Cytochrome - P450 (Phần 2) - Nguyễn Thị Ngọc Dao

pdf 139 trang ngocly 1020
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Cytochrome - P450 (Phần 2) - Nguyễn Thị Ngọc Dao", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfcytochrome_p450_phan_2_nguyen_thi_ngoc_dao.pdf

Nội dung text: Cytochrome - P450 (Phần 2) - Nguyễn Thị Ngọc Dao

  1. 79 Chng IV H TH NG CYTOCHROME-P450  VI SINH VT VÀ THC VT 4.1. H! th#ng Cyt-450 % n&m men và n&m s,i (Filamentous Fungi) 4.1.1 Tình hình nghiên c u Cyt-P450  nm men và nm si S� phát hi�n Cytochrome- P450 trong n�m men �ư�c công b� l�n ��u tiên vào n�m 1964 b�i Lindenmayer và Smith. Cùng n�m �ó, Omura và Sato c�ng công b� nh�ng bài báo ��u tiên c�a h�. Tuy nhiên, ngư�c v�i nh�ng hi�u bi�t khá nhi�u v� Cyt-P450 � ��ng v�t có vú thì Cyt-P450 � con men và n�m s�i (filamentous fungi) còn �ư�c bi�t r�t ít. Yoshida và cs �ã kh�ng ��nh �ư�c c�u trúc và ch�c n�ng c�a h� th�ng v�n chuy�n �i�n t� trong Saccharomyces cerevisiae (hình 4.1) và �ã g�i các h� th�ng này là Cyt-P450(14DM), lanosterol 14– demethylase. Nghiên c�u v� s� oxy hóa alkan b�i Cyt-P450 c�a con men h�p th� alkan �ư�c ti�n hành b�i m�t s� nhóm nghiên c�u khác nhau �ã cung c�p nh�ng thông tin quan tr�ng liên quan t�i Cyt-P450 � con men. S� có m�t c�a nh�ng Cyt-P450 và nh�ng ho�t tính ph� thu�c Cyt-P450 trong con men và filamentous fungi �ã �ư�c công b� nhưng c�ng m�i ch� d�ng l�i � mô t� s� lư�ng các Cyt-P450 t�n t�i trong các dòng riêng bi�t ho�c các dòng c�a các eukaryote �ơn bào, còn r�t h�n ch� so v�i s� lư�ng này � các karyote b�c cao hơn. Tuy nhiên, có th� là nh�ng cơ th� riêng bi�t t�o ra nh�ng Cyt P450 nh�t ��nh �� �áp �ng cho nh�ng chuy�n hóa ��c hi�u c�a chúng và b� sung vào danh sách gia �ình c�a Cyt-P450. T�ng s� các Cyt-P450 trong eukaryote b�c th�p là r�t l�n. Cyt-P450 �ã t�o nên m�t ��i gia �ình các gen kh�ng l� trong quá trình ti�n hóa c�a eukaryote ��
  2. 80 Nguy�n Th� Ng�c Dao �áp �ng cho yêu c�u c�a chúng trong s� oxy hóa các h�p ch�t nh�t ��nh. �� gi�i thích s� ti�n hoá và s� khác nhau c�a Cyt-P450 c�n ph�i nghiên c�u tích c�c hơn n�a trên Cyt-P450 c�a eukaryote c�a vi sinh v�t c�ng như c�a th�c v�t b�c cao. - Kh� axít béo bão hòa acyl CoA NADH fP1 B5 C SF8 - Kh� axít béo bão hòa ergostadienol - Kh� methyl c�a sterol - Kh� methyl c�a NADPH fP2 P450s lanosterrol - Kh� bão hòa c�a ergostadienol - Oxy hóa các xenobiotic Squalene epoxidate Hình 4.1. H� th�ng chuy�n �i�n t� � n�m men và ch�c n�ng c�a chúng, fP1= NADH Cyt b5 reductase; b5 = Cytb5; CSF = cyanide senitive factor (y�u t� nh�y c�m v�i cyanide) B ng 4.1. Nh�ng ho�t tính ph� thu�c Cyt-P450 �ã công b� ��i v�i n�m men và n�m s�i Ho t tính P450 Phân b 14-demethyl hoá các sterol P45014D H�u h�t vi sinh v�t 22 kh� bão hoà ergosterol P45022DS Có th� h�u h�t Thu� phân kh�i mào các alkan P450 alkan N�m men tiêu th� Alkan Thu� phân các axit béo P450 alki,c Candida tropical Chuy�n hoá các xenobiotic B Saccharomyces cerevisiae a Schizoscc pombe a Candida tropical a Cunighamella elegan a Cunighamella baireiri P450 hpha Aspergillus sp. T�o thành isobuten P450RM Rhodotorula minuta
  3. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 81 Chuy�n hoá nitrat/nitrit P450dNIR Fusarium oxysporum Demethyl hoá pisatin P450(57)d Nectria haematococca Thu� phân m-cresol a Aspergillus parasitous. Sinh t�ng h�p aflatoxin a Claviceps purpurea Sinh t�ng ergot alkaloid a Aspergillus Ocraceousrhizopusnigricas Thu� phân progesterone a Chú thích: a = P450 �áp �ng cho nh�ng ho�t tính chưa �ư�c xác ��nh, b= m�t P450 có ho�t tính này �ã �ư�c tách chi�t nhưng chưa �ư�c kh�ng ��nh như m�t loài duy nh�t, c= nh�ng P450 có th� �áp �ng cho ho�t tính này �ã �ư�c tách chi�t nhưng chưa kh�ng ��nh v� �óng góp c�a nó cho ph�n �ng, d: gen c�a P450 này �ã �ư�c tách dòng nhưng protein tương �ng chưa tách �ư�c 4.1.2. Cyt-P450 ca nm men Cyt-P450(14DM) (Lanosterol 14-demethylase) Cyt-P450(14DM) �ã �ư�c tinh s�ch t� S. cerevisiae và C. albicans, trong �ó S. cerevisiae �ư�c nghiên c�u nhi�u nh�t trong các lo�i n�m men. Enzyme này oxy hóa nhóm methyl c�a lanosterol �� b�t ��u s� sinh t�ng h�p ergosterol t� lanosterol và �ư�c phân b� r�ng rãi trong h�u h�t các eukaryote v�i ch�c n�ng chuy�n hoá. Nh:ng thu;c tính sinh lý, hóa sinh Cyt-P450(14DM) tinh s�ch t� S. cerevisiae có TLPT 58.000 khi �i�n di trên PGE có m�t SDS (th�p hơn giá tr� lý thuy�t 60.700). D�ng ferric khi không có cơ ch�t c�a Cyt-P450 này th� hi�n tr�ng thái spin th�p � sóng �� 417nm, không có h�p th� � vùng 650nm, tín hi�u EPR � g = 1,92 ; 2,27; và 2,45. D�ng kh�- CO có b�ng h�p th� � 447nm. Khi liên k�t v�i cơ ch�t, tr�ng thái spin th�p c�a ferric chuy�n thành spin cao v�i thay ��i quang ph� typ I. S� chuy�n d�ng spin này không x�y ra v�i 24, 25-dihydrolanosterol, m�t cơ ch�t khác ít b� �nh hư�ng hơn. B�ng cách s� d�ng s� bi�n ��i quang ph� do cơ ch�t b� kh�, ngư�i ta �ã xác ��nh �ư�c Kd c�a lanosterol là 6,0 µM và giá tr� này trùng kh�p v�i Km c�a h�p ch�t này. Enzyme này tác d�ng v�i nh�ng h�p ch�t ngo�i lai khác như pyridin, d�n xu�t imidazol và triazol, th� hi�n s� bi�n ��i quang ph� ��c trưng cho typ II. Trong s� nh�ng h�p ch�t này, các d�n xu�t
  4. 82 Nguy�n Th� Ng�c Dao azol �ư�c bi�t là nh�ng ch�t kháng n�m (antifungal agent) th� hi�n ái l�c ��c bi�t cao và chúng ho�t ��ng như là nh�ng ch�t �c ch� Cyt-P45014DM. Nh:ng thu;c tính xúc tác Cyt-P45014DM xúc tác s� oxy hóa lanosterol thành 4, demethylcholesta 8, 14, 24-trienol trong s� có m�t c�a NADPH- P450-reductase, O2 và NADPH (hình 4.2). Ph�n �ng này bao g�m 3 quá trình monooxygen hoá và m�t phân t� Cyt-P45014DM riêng l� chuy�n hóa toàn b� quá trình ph�n �ng liên t�c này mà không có s� gi�i phóng ch�t trung gian b� oxy hóa � v� trí 32. H�ng s� Km và Vmax c�a lanosterol 14-demethylase c�a S. cerevisiae tái t�o �ư�c xác ��nh là 6,25µM và 16nmol s�n ph�m �ư�c t�o thành/phút/nm Cyt-P45014DM, m�t cách tương �ng. Vì s� methyl hóa g�m có 3 quá trình monooxygen hóa nên tr� s� Vmax mô t� � trên kh�ng ��nh r�ng m�t phân t� Cyt-P45014DM lanosterol xúc tác nhi�u quá trình oxy hoá /phút. Ph�n �ng kh� b�i enzyme c�a h�n h�p Cyt-P450 - lanosterol x�y ra v�i m�t h�ng s� bi�u ki�n k = 20min-1 dư�i áp su�t CO, trong khi m�t h�ng s� bi�u ki�n cho s� -1 kh� c�a Cyt-P45014ld không có cơ ch�t là < 0,1min . �i�u này kh�ng ��nh r�ng Cyt-P45014DM có m�t cơ ch� �i�u hòa �� h�n ch� s� quay vòng vô ích c�a chu k� oxy hóa kh�. Lanosterol 14- demethylase tái l�p c�ng xúc tác cho s� th�y phân 14, 24, 25 dihydrolanosterol v�i ái l�c y�u hơn (km = 16,7µM). Vì không có 24, 25 dihydrolanosterol xu�t hi�n m�t cách t� nhiên � n�m men nên cơ ch�t ��c bi�t này có th� có ý ngh�a v� m�t sinh lý. Thêm vào �ó, enzyme này có kh� n�ng chuy�n hóa m�t s� d�n xu�t lanosterol khác và b� �c ch� b�i m�t s� d�n xu�t lanosterol không b� chuy�n hóa. Tuy nhiên, enzyme này không có tác d�ng v�i cholesterol ho�c ergosterol và bi�u hi�n ho�t tính chuy�n hoá thu�c không �áng k�. Quan sát này cho th�y r�ng Cyt-P45014DM c�a n�m men có tính ��c hi�u cơ ch�t h�p ��i v�i lanosterol và các d�n xu�t c�a nó và ch� ho�t ��ng như enzyme lanosterol 14-demethylase.
  5. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 83 HO Hình 4.2. S� demethyl hóa 14 c�a lanosterol �ư�c xúc tác b�i Cyt-P45014DM. C&u trúc bEc 1 C�u trúc b�c 1 c�a Cyt-P45014DM �ã �ư�c suy lu�n t� trình t� nucleotid c�a genomic DNAs dòng hoá t� S. cerevisiae, C.albican và C.tropical. Cyt-P45014DM là tương ��i l�n g�m 530 axit amin v�i tr�ng lương phân t� là 60.700 (S. cerevisiae). Xem xét c�u trúc b�c 1, Cyt-P45014DM c�a n�m men �ư�c coi là t�o thành m�t gia �ình gen riêng bi�t và �ư�c Nebert và cs x�p vào CYP51 như trong trư�ng h�p Cyt-P450 t� microsom c�a ��ng v�t có vú, Cyt- P45014DM có m�t c�u trúc �ư�c cho là m�t vùng g�n màng � ��u N- t�n như là ph�n �ư�c g�ch dư�i trong trình t�. �áng chú ý là m�t �o�n ch�a 30 axit amin �ư�c kéo dài v� phía ��u N-t�n c�a vùng �ư�c cho là g�n màng và �o�n này v�n còn l�i trong phân t� thành th�c ngo�i tr� methionin � ��u. M�c dù ch�c n�ng c�a �o�n này v�n chưa �ư�c làm rõ nhưng �áng chú ý r�ng domain �ư�c gi� ��nh là g�n màng này �ư�c b�o v� bên sư�n b�i các axit amin tích �i�n; ví d�: - QR :::: RK - trong S. cerevisiae Cyt-P45014DM. �i�u �ó g�i ý r�ng �o�n này có th� không �ư�c g�n vào màng cùng v�i �o�n �ư�c cho là g�n màng. S� kéo dài như v�y c�ng �ư�c th�y trong Cyt-P450alk. Nhưng không tìm th�y � Cyt-P450 ��ng v�t có vú. Tóm l�i, s� kéo dài � ��u N- t�n này �ư�c coi là riêng bi�t cho Cyt- P450 � n�m men, và cách th�c g�n màng � Cyt-P450 n�m men có khác gì �ó v�i � Cyt-P450 ��ng v�t có vú. Theo nghiên c�u c�a Chen và cs. nh�ng Cyt-P45014DM t� S. cerevisiae và C.tropicals có 343 (66,6% ) trùng kh�p và 119 (23,1%) các axit amin �ư�c thay
  6. 84 Nguy�n Th� Ng�c Dao th� b�o t�n và 4 vùng tương ��ng cao �ã �ư�c xác ��nh. M�t trong s� �ó là vùng liên k�t �ư�c gach dư�i và nh�ng vùng khác �ư�c coi là liên quan v�i v� trí chính xác m�c dù v�n chưa �ư�c x�p lo�i. �i�u �áng k� là s� thay th� ch� m�t g�c axit amin (310G → D) trong vùng �ư�c xác ��nh l�n nh�t (t� 290N ��n 332E trong phân t� S. cerevisiae) �ã t�o ra m�t d�ng không ho�t ��ng c�a Cyt- P45014DM �ư�c g�i là Cyt-P450SGI. Trình t� axit amin c�a Cyt- P45014DM và Cyt-P450cam g�i ý r�ng vùng này bao g�m trình t� �áp �ng cho helix I ho�c helix xa c�a Cyt-P450cam. S� d�ng máy tính có thêm h� th�ng "SCADS" mô hình hóa phân t� �ư�c phát tri�n b�i Vi�n Suntory trong nghiên c�u v� sinh y h�c và s� li�u c�a phân tích tinh th� Cyt-P450cam, ngư�i ta �ã d� �oán r�ng trong phân t� Cyt-P450SGI ��t bi�n không ho�t ��ng, m�t histidin � vùng này (317-H) có th� tác ��ng v�i s�t hem như là ph�i t� th� 6 trans vào thiolate và s� tác ��ng này �ã �ư�c kh�ng ��nh b�i phân tích quang ph� c�a phân t� Cyt-P450SGI �ã tinh s�ch. �i�u �ó g�i ý r�ng vùng này ph�i �ư�c ��nh v� � g�n v�i m�t ngo�i biên c�a hem và có th� bao g�m m�t ph�n c�a v� trí ho�t ��ng. Cyt-P45014DM nh là mFc tiêu cHa nh:ng tác nhân ch#ng n&m Azole M�t s� nh�ng d�n xu�t triazol và imidazol �ã �ư�c s� d�ng như là tác nhân có kh� n�ng ch�ng n�m trong y h�c và l�nh v�c nông hóa, chúng �ư�c g�i là nh�ng tác nhân azole kháng n�m. T�t c� nh�ng h�p ch�t này ��u có th� n�ng �c ch� enzyme lanosterol 14α- demethylase t�o ra h�n h�p l�p th� v�i Cyt-P45014DM. S� �c ch� enzyme Cyt-P450 14-DM gây ra s� �ào th�i ergosterol và làm � ��ng 14-methyl sterol trong các t� bào. Bi�n ��i trong s� t�o thành sterol, ��c bi�t là tích l�y 14-methyl sterol gây ra s� xáo tr�n hàng lo�t v� ch�c n�ng c�a màng, d�n t�i �c ch� t� bào phát tri�n ho�c ch�t. Tóm l�i, Cyt-P45014DM là �ích ��u tiên c�a tác nhân azole kháng n�m. S� phát tri�n nh�ng thu�c có hi�u qu� và an toàn có th� �ư�c áp d�ng m�t cách h� th�ng là m�t trong nh�ng v�n �� quan tr�ng nh�t trong hóa tr� li�u �� h�n ch� s� nhi�m các n�m khác � nh�ng b�nh nhân b� suy gi�m mi�n d�ch. M�c dù nh�ng d�n xu�t azole �ư�c coi là có th� tr� thành m�t trong nh�ng nhóm tri�n v�ng nh�t trong nh�ng tác nhân kháng n�m h� th�ng, v�n còn nguy cơ c�a ph�n �ng có h�i d�n t�i �c ch� các Cyt-P450 c�a v�t ch�. Tuy v�y, s� phát tri�n m�t tác nhân azole kháng n�m có s� l�a ch�n cao
  7. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 85 ��i v�i Cyt-P45014DM v�n �ư�c ch� ��i m�t cách háo h�c. Cơ s� cho �i�u này là nh�ng phân tích trư�c �ây v� c�u trúc v� trí ho�t ��ng c�a Cyt-P45014DM c�a n�m giúp cho s� thi�t k� nh�ng phân t� tác nhân azole kháng n�m. Cyt-P450(alk) (alkan terminal hydroxylase) cHa n&m men a dMu hNa Bư�c ��u tiên c�a s� chuy�n hóa alkan b�i nh�ng n�m men tiêu hóa �ư�c alkan là s� th�y phân các alkane thành các alkanol. Ph�n �ng này �ư�c xúc tác b�i m�t lo�i Cyt-P450 khác �ư�c g�i là Cyt- P450alk. Cyt-P450alk �ư�c t�o ra ch� trong nh�ng t� bào phát tri�n nh� alkan � nh�ng n�m men tiêu hóa �ư�c alkan và không tìm th�y trong nh�ng n�m men khác như là Saccharomyces sp. ho�c nh�ng t� bào phát tri�n nh� glucose c�a n�m men tiêu hóa alkan. Cyt- P450alk �ã �ư�c tinh ch� t� nh�ng t� bào phát tri�n �ư�c nh� alkan c�a C.maltosa EH15, t� bào này trư�c �ây �ư�c g�i là Lodderomyces elongisporus và �ã �ư�c ��c trưng. Genomic DNA ��i v�i Cyt-P450alk �ã �ư�c dòng hóa t� C.maltosa IAM 12247. C.maltosa EH15 và C.tropicals, s� trùng h�p b�c 1 c�a Cyt-P450alk v�i nh�ng Cyt-P450 khác là th�p và Cyt-P450alk �ư�c x�p lo�i như là m�t gia �ình gen CYP52 riêng bi�t b�i Nebert và cs. Tính không PQng nh&t phân tS Tr�ng lư�ng phân t� c�a các Cyt-P450alk �ư�c tính toán ��a vào c�u trúc b�c 1 là 59838 (523 axit amin) cho C. IAM maltosa 12247, 59705 (521 axit amin) cho C.maltosa EH15 và 63200 (543 axit amin) cho C.maltosa, g�n 60% các axit amin là gi�ng nhau và kho�ng 25% �ư�c b�o t�n. Sanglard và Fiechter phát hi�n gen Cyt-P450 khác có 70% s� ��ng nh�t v�i gen Cyt-P450alk �ã nêu � trên c�a C.tropicals trong cùng m�t thư vi�n gen và phân ��nh rõ 2 enzyme này v�i nh�ng Cyt-P450alk trư�c �ây là Cyt-P450alk và - 3 Cyt-P450alk , m�t cách tương �ng. Seghezzi và cs. công b� r�ng 2 gen Cyt-P450alk là m�t protein ch�a 522 axit amin. Kích thư�c 2 phân t� c�a Cyt-P450alk có th� so sánh v�i kích thư�c c�a C.maltosa Cyt-P450alk. Sanglard và cs. xác ��nh r�ng TLPT trên �i�n di c�a Cyt-P450alk �ư�c tinh s�ch t� C.tropicals th�p hơn 1 �áng k� so v�i protein c�a Cyt-P450alk �ư�c bi�u hi�n trong S. 1 cerevisiae. Tuy nhiên, Cyt-P450alk �ư�c bi�u hi�n �ã không xúc tác �ư�c ph�n �ng th�y phân alkan mà l�i th�y phân - laurate,
  8. 86 Nguy�n Th� Ng�c Dao 2 g�i ý r�ng Cyt-P450alk xúc tác s� th�y phân alkane. Tóm l�i, Cyt- 2 P450alk tương t� v�i Cyt-P450alk chuy�n hóa chính alkane c�a C.tropicals và có th� �ư�c dòng hóa tr�c ti�p t� Cyt-P450 c�a C.maltosa. �i�u này kh�ng ��nh r�ng Cyt-P450alk c�a C.tropicals bao g�m ít nh�t hai thành viên khác nhau. Sanglard và cs g�i ý r�ng chúng có th� �ư�c t�o ra b�i s� c�p �ôi gen m�t cách n�i ti�p 2 vì Cyt-P450alk và alk ch� cách nhau m�t Kb trên cùng m�t nhi�m s�c th�. Thu;c tính phân tS và thu;c tính xúc tác Như trong trư�ng h�p c�a Cyt-P45014DM, Cyt-P450alk có m�t nhánh ưa nư�c trư�c �o�n �ư�c cho là g�n màng � vùng N- t�n và �o�n này v�n �ư�c gi� l�i trong phân t� thành th�c ngo�i tr� methionin g�n � ��u. �i�u thú v� là, �o�n �ư�c cho là g�n màng c�a Cyt-P450alk �ã �ư�c chia thành hai nhánh và c� hai �ư�c che ch�n b�i các axit amin tích �i�n . Cyt- P450alk �ư�c tinh ch� t� C.maltosa bi�u hi�n sóng h�p th� ��c trưng c�a m�t Cyt-P450 spin th�p. Sóng h�p th� c�a ph�c h�p kh� v�i CO �ã �ư�c công b� là � 447nm cho Cyt-P450 alk c�a C.maltosa EH15 ho�c 450nm cho Cyt-P450alk t� C.maltosa IAM 12247. Phân tích quang ph� c�a microsome t� nh�ng t� bào C.tropicals m�c trên tetradecane g�i ý r�ng Cyt-P450alk tác ��ng v�i m�t s� ph�i t� ngo�i lai m�c dù không có s� bi�n ��i quang ph� �ư�c phát hi�n d�a trên liên k�t v�i cơ ch�t c�a nó, n- tetradecane. M�c khác, Cyt-P450alk �ư�c tinh ch� m�t ph�n t� C.guilliermondic �ã �ư�c công b� th� hi�n bi�n ��i quang ph� typI d�a trên liên k�t v�i hexadecane. M�t h� th�ng tái l�p ch�a Cyt-P450alk và NADPH-P450- reductase t� C.maltosa EH15 xúc tác s� th�y phân ban ��u c�a hexadecane, s� kh� b�ng enzyme Cyt-P450alk trong h� th�ng tái l�p ph� thu�c vào s� có m�t c�a cơ ch�t như là trong trư�ng h�p c�a Cyt-P45014DM. M�t s� công b� g�i ý kh� n�ng là Cyt- P450alk xúc tác s� th�y phân � ho�c �-1 c�a acid béo b�c cao và chuy�n hóa m�t s� cơ ch�t là thu�c. Tuy nhiên, s� ��c hi�u cơ ch�t c�a Cyt-P450alk không �ư�c nghiên c�u th�t tích c�c và c�n ph�i có nh�ng nghiên c�u chính xác hơn v�i ch�t li�u tinh ch�, 1 b�i vì Cyt-P450alk xu�t hi�n dư�i nhi�u d�ng. Cyt-P450alk �ư�c 2 dòng hóa và �ư�c bi�u hi�n và Cyt-P450alk t� ra có s� ��c hi�u cơ ch�t khác nhau như ý ki�n �ã nêu � trên.
  9. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 87 M;t Cyt-P450 Páp Tng cho sU hoVt hóa các ch&t gây P;t biWn hóa hXc Ngư�i ta �ã công b� r�ng, n�m men có th� ho�t hóa m�t s� ch�t gây ��t bi�n hóa h�c. M�t s� Cyt-P450 có th� �áp �ng cho s� ho�t hóa này �ã �ư�c tinh ch� t� S. cerevisiae. Cyt-P450 này (còn �ư�c g�i là P448) �ã có m�t TLPT bi�u ki�n là 55.500. Cyt-P450 này th� hi�n ho�t tính th�y phân benzo(1)pyrene trên h� th�ng tái l�p v�i Cyt-P450-NADPH-Reductase, s� bi�n ��i quang ph� typ I d�a trên liên k�t v�i benzo(a)pyrene, m�t s� cơ ch�t thu�c và lanosterol. M�c dù s� �áp �ng c�a Cyt-P450 ��i v�i chuy�n hóa oxy hóa các ch�t gây ung thư b�i n�m men có th� là ch�c ch�n, s� xác ��nh nó như là m�t lo�i Cyt-P450 riêng bi�t v�n chưa ��t �ư�c. �áng chú ý là hàm lư�ng Met. và Cys c�a Cyt-P450 này khác �áng k� so v�i nh�ng Cyt-P45014DM . Ví d�, hàm lư�ng Met và Cys c�a Cyt- P450 này �ư�c tính toán t� thành ph�n axit amin là 7/407 và 8/407, m�t cách tương �ng, trong khi Cyt-P45014DM �ư�c xác ��nh t� c�u trúc b�c m�t là 18/530 và 4/530, m�t cách tương �ng. M;t Cyt-P450 duy nh&t cHa Phodotorunla minuta xúc tác sU tVo thành isobuten tY isovaleric acid. Fujii và cs công b� r�ng m�t Cyt-P450 �ã �ư�c t�ng h�p b�i phenylalanine trong t� bào c�a R.minuta phát tri�n � �i�u ki�n hi�u khí (60h) v�i ho�t tính t�o thành isobutene. Vì isobutene �ư�c t�o thành t� L-Leu qua axit isovaleric, Cyt-P450 này �ư�c cho là s� �áp �ng ��i v�i s� chuy�n hóa c�a isovaleric axit �� thành isobutence (H.4.7). M�i �ây, các microsome tách t� nh�ng t� bào R.minuta �ư�c kích thích s�n xu�t b�i phenylalanin xúc tác s� chuy�n hóa c�a axit isovaleric thành isobutene trong s� có m�t c�a NADPH và O2, và ho�t tính b� �c ch� b�i CO và VTMK3, do c�n tr� quá trình chuy�n �i�n t� t� Cyt-P450 reductase t�i Cyt-P450. Như v�y, s� có m�t c�a m�t Cyt-P450 trung gian chuy�n hóa axit isovaleric thành isobutene trong microsome c�a t� bào R.minuta �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i phenylalanin �ã �ư�c kh�ng ��nh. M�i �ây, Fujii và cs �ã phân l�p �ư�c Cyt-P450 có m�t d�ng ��ng nh�t khi �i�n di. Cyt-P450 �ư�c tinh ch� �ã � tr�ng thái spin th�p và th� hi�n t�c �� hơi ch�m hơn tr�ng thái spin cao trong s� liên k�t v�i axit isovaleric. Tuy nhiên, chưa có thông tin nào v� thu�c tính xúc tác c�a nó.
  10. 88 Nguy�n Th� Ng�c Dao Trình t� 30 axit amin � ��u N-t�n c�a s�n ph�m tinh s�ch �ã �ư�c xác ��nh là GIVQEAAAFVGSLTQLAGAFAALVLAFH. Trình t� này là hoàn toàn khác v�i trình t� c�a nh�ng Cyt-P450 c�a n�m men �ã �ư�c bi�t. Tuy v�y, c�u trúc b�c 1 c�a vùng này là không b�o toàn gi�a nh�ng Cyt-P450 có cùng ch�c n�ng t� nh�ng ch�ng khác nhau và ngư�i ta không th� xác ��nh �ư�c là li�u Cyt- P450 này có cùng thu�c v� m�t gia �ình gen duy nh�t hay không. Không th�y có tín hi�u c�a búi (cluster) k� nư�c � �o�n liên k�t màng �ư�c tìm th�y trong trình t� axit amin ��u N-t�n � trên. �i�u này g�i ý r�ng m�t ph�n kéo dài trư�c vùng liên k�t vào màng �ư�c tìm th�y trong t�t c� các Cyt-P450 c�a n�m men cho ��n nay �ã �ư�c phân tích trình t� c�ng có th� có m�t trong Cyt-P450 này. S� chuy�n hóa axit isovaleric �� thành isobutene �ư�c coi là ho�c Cyt- P450 xúc tác s� kh� bão hòa v� trí �, � ti�p theo sau s� kh� carboxyl c�a �, � không bão hòa c�a axit carboxylic ho�c oxy hóa liên k�t C-C gi�ng như là bư�c cu�i cùng c�a s� demethyl hóa 14 �-lanosterol. Trong m�i trư�ng h�p, Cyt-P450 này là trung gian cho m�t ph�n �ng m�i chưa t�ng �ư�c công b� ��i v�i Cyt-P450. Cyt-P45022DS chuy[n hóa trung gian cho sU khS bão hòa v^ trí 22 cHa ergostadienol ho_c ergostenol S� t�o ra liên k�t �ôi s� 22 � ergostadienol ho�c ergostenol là c�n thi�t cho s� sinh t�ng h�p ergosterol. Ph�n �ng này �ư�c xúc tác b�i nh�ng microsome n�m men, c�n có m�t NADPH và O2 và b� �c ch� b�i kháng th� kháng CPR c�a n�m men. Tuy nhiên, ph�n �ng này �ư�c coi là m�t ph�n �ng trung gian b�i m�t d�ng Cyt- P450 �ư�c h�p nh�t vào h� th�ng v�n chuy�n �i�n t� � microsome. Vì có m�t ch�ng n�m men ��t bi�n ch� thi�u h�t ph�n �ng t�o ra liên k�t �ôi s� 22 � ergostadienol ho�c ergostenol nên ph�n �ng này �ư�c coi là �ư�c xúc tác b�i m�t d�ng Cyt-P450 riêng bi�t �ư�c g�i là Cyt-P45022DS. Tuy v�y, Cyt-P450 này v�n chưa �ư�c tách chi�t và nh�ng thu�c tính xúc tác và phân t� c�a nó v�n chưa �ư�c làm rõ. 4.1.3. Cyt-P450 ca nm si (Filamentous Fungi) Cyt-P450 cHa Fusarium oxysporum Shoun và cs �ã công b� r�ng F. oxysporum ch�a Cyt-P450 c� � microsome và phân �o�n hoà tan. �i�u �ó g�i ý r�ng m�t �o�n n�i
  11. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 89 màng ��nh v� � microsome thu� phân trung gian acid béo và m�t �o�n hoà tan có kh� n�ng do nitrate/nitrite kích thích t�ng h�p có th� là �áp �ng cho s� chuy�n hoá nitrate ho�c nitrite. Thêm n�a, ngư�i ta c�ng công b� r�ng d�ch chi�t không còn t� bào c�a F. oxysporum th� hi�n ho�t tính có th� coi là oxy hoá ��i v�i ch�t ngo�i lai. Cyt-P450 P,c tinh chW tY phân PoVn hoà tan Hai ch� ph�m Cyt-P450 �ư�c coi là Cyt-P450A và B �ã �ư�c tinh s�ch t� ph�n hoà tan c�a F. oxysporum. Hai s�n ph�m này h�u h�t r�t gi�ng nhau tr� �i�m ��ng �i�n c�a chúng. TLPT bi�u ki�n c�a c� hai Cyt-P450 �ã �ư�c xác ��nh b�ng �i�n di PGE là 48.000 và 43.000 b�ng l�c gel, xác ��nh �ư�c b�n ch�t monomer c�a chúng trong ch� ph�m cu�i cùng không ch�a ch�t t�y. S� lư�ng các g�c axit amin �ư�c tính toán t� vi�c phân tích axit amin c�a Cyt-P450A và B là 427-8 cho TLPT là 48.000. D�ng oxy hoá c�a Cyt-P450A, B là trong tr�ng thái h�n h�p spin th� hi�n � ��nh h�p th� t�i 414nm v�i m�t vai � 390nm. ��nh h�p th� c�a h�n h�p v�i CO d�ng kh� �ư�c th�y � 447nm. C�n ph�i làm rõ li�u nh�ng Cyt-P450 này có ph�i d�ng hoà tan không, vì Shoun và các cs �ã công b� r�ng Cyt-P450 liên k�t microsome �ư�c gi�i phóng m�t ph�n vào phân �o�n hoà tan trong quá trình phân hu� t� bào. Cyt-P450A th� hi�n quang ph� phân bi�t typ I trên liên k�t v�i laurate. M�t cơ ch�t có th� c�a Cyt-P450 microsomal và kháng th� ��i v�i Cyt-P450 này �c ch� ho�t tính thu� phân laurate. M�t khác, ngư�i ta �ã công b� r�ng ��nh h�p th� c�a h�n h�p CO d�ng kh� c�a Cyt-P450 microsomal �ã �ư�c th�y � 450nm, trong khi d�ng hoà tan c�a chúng và ch� ph�m tinh s�ch l�i �ư�c th�y � 448 và 447nm (m�t cách tương �ng). Như v�y, không có m�t ch�ng minh ch�c ch�n nào cho s� trùng l�p c�a Cyt-P450A và Cyt-P450B. SU thu` phân acid béo Nh�ng d�ch chi�t không có t� bào t� F. oxysporum �ã chuy�n hoá thu� phân laurate và palmitate � v� trí -1, �-2 và �-3. S� tái l�p Cyt-P450 và CPR �ã �ư�c g�i ý d�a trên nh�ng tác ��ng �c ch� c�a CO và menadion, ch�t này �ư�c coi là ch�t �c ch� s� v�n chuy�n �i�n t� t� Reductase ��n Cyt-P450. Trên phân �o�n t� bào, ho�t tính này �ư�c tái t�o trong c� phân �o�n microsome và phân �o�n hoà tan. Tuy nhiên, ho�t tính trong phân �o�n hoà tan �ã �ư�c
  12. 90 Nguy�n Th� Ng�c Dao xem như là do s� gi�i phóng h� th�ng emzym t� microsome trong quá trình phân hu� t� bào. Nh�ng lo�i Cyt-P450 �áp �ng cho ho�t tính này v�n chưa �ư�c xác ��nh. Cyt-P450 hoà tan P,c kích thích tbng h,p b%i Nitrat ho_c Nitrit S� phát tri�n c�a F. oxysporum khi có m�t nitrat ho�c nitrit và m�t ít oxy �ã t�o ra có th� coi là Cyt-P450 trong ph�n hoà tan c�a nh�ng t� bào này (b�ng 4.2). B ng 4.2. S� kích thích t�ng h�p Cyt-P450 hoà tan b�ng nitrat ho�c nitrit trong F. oxysposum ( t� công b� c�a Shoun và các cs) Nitơ vô cơ thêm vào S�c khí Hàm lư�ng Cyt-P450(nmol/mg protein) ( 0,2%) Phân �o�n tan Phân �o�n microsome NO th�p Kph 0,085 NaNO3 th�p 0,288 0,075 NaNO2 th�p 0,685 0,103 NH4CL th�p 0,0035 0,11 NaNO3 cao 0,013 0,014 NaNO2 cao kph 0,012 Chú thích: kph = không phát hi�n Vì s� c�m �ng t�ng h�p là ít �ư�c quan sát � Cyt-P450 microsomal dư�i �i�u ki�n này, nên Cyt-P450 �ư�c t�o ra �ã �ư�c coi là hoàn toàn n�m trong phân �o�n hoà tan. M�i �ây, Kizawa và cs �ã tách chi�t m�t dòng cDNA, �o�n này �ư�c cho là có mang trình t� mã hoá c�a Cyt-P450. cDNA này (CYP55) mã hoá cho m�t protein Cyt-P450 ch�a 403 axit amin và không có búi k� nư�c ��i v�i m�t �o�n liên k�t màng �ã �ư�c tìm th�y trong trình t�. Như v�y, Cyt-P450 mã hoá b�i gen này là tương t� v�i m�t protein hoà tan. S� kích thích t�ng h�p d� thư�ng và s� ��nh v� c�a Cyt-P450 này dư�ng như �ư�c d� �oán trư�c v� ch�c n�ng duy nh�t c�a nó. Shoun và các cs th�y r�ng ho�t tính kh� nitrit không tương t� �ã �ư�c kích thích t�ng h�p c�m �ng song song v�i Cyt-P450 hoà tan, g�i ý s� tham gia có th� c�a Cyt-P450 này vào ho�t tính xúc tác trên.
  13. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 91 Nh:ng Cyt-P450 khác và hoVt tính liên quan PWn Cyt-P450 cHa n&m s,i (Filamenrtous Fugi): SU demethyl hoá v^ trí 14 trong sinh tbng h,p sterol Tác nhân kháng n�m azole, nh�ng ch�t �c ch� có ti�m n�ng và ��c hi�u c�a lanosterol 14�-demethylase (P45014DM) c�a n�m men, �c ch� s� sinh t�ng h�p ergosterol b�i n�m s�i và tích lu� m�t s� 14- methyl sterol trong t� bào, g�i ý r�ng Cyt-P45014DM tham gia vào s� chuy�n nhóm c�a 14�-methyl trong n�m s�i. S� dư th�a sterol �ư�c tìm th�y trong nh�ng n�m men �ư�c x� lý v�i nh�ng tác nhân kháng n�m là lanosterol, trong khi � n�m s�i ch� có m�t ít lanosterol và m�t s� lư�ng l�n 24-methylne-24, 25-dilydro lanosterol �ã �ư�c tích lu� l�i. �i�u này g�i ý v� tính ��c hi�u cơ ch�t c�a Cyt-P45014DM t� Filamentous Fungi dư�ng như tác ��ng trên 24-methylene-24, 25-dihydro lanosterol như là cơ ch�t tr�i. SU tVo ra ch&t chuy[n hoá thT c&p Ambike và cs g�i ý v� s� tham gia c�a Cyt-P450 vào sinh t�ng h�p alkaloid b�i claviceps purpured d�a trên m�t �i�u là alkaloid �ư�c t�o thành t�ng lên song song v�i s� kích thích t�ng h�p Cyt- P450 b�i Phenobarbital. B�ng cách s� d�ng cùng m�t chi�n lư�c hi�u qu�, s� tham gia c�a Cyt-P450 vào s� t�o thành c�a Aflatoxin b�i Asp.parasiticus NRRL3240 c�ng �ư�c g�i ý. Murphy và cs c�ng công b� r�ng phân �o�n microsomal c�a Penicillum patulum ch�a m�t Cyt-P450 xúc tác s� chuy�n hoá c�a m-cresol thành m-hydroxybenzyl alcohol, ch�t này �ư�c coi là �ư�c t�o ra trong con �ư�ng sinh t�ng h�p c�a Paturin, m�t mycotoxin �ư�c t�o ra b�i n�m này. Phát hi�n này g�i ý r�ng Filamenrtous Fungi có nh�ng Cyt-P450 khác có ch�c n�ng trong s� t�o thành các ch�t chuy�n hoá th� c�p ��c trưng c�a chúng. M;t Cyt-P450 khS P;c cHa Phytoalexin pisatin: Mattheva và Van Etten th�y r�ng m�t n�m b�nh c�a th�c v�t là Nectria haematococca t�o ra Cyt-P450 xúc tác s� O-demethyl hoá c�a pisatin khi nó ti�p xúc v�i pisatin. Pisatin là m�t ch�t ��c do n�m phytoalexin t�o ra khi ��u Hà Lan � vư�n b� nhi�m n�m ngay t�i v� trí b� nhi�m, nhưng s�n ph�m phenolic c�a nó ít ��c hơn. Ho�t tính ��c hi�u c�a c�a pisatin demethyl hoá �ư�c quan sát trong nh�ng microsome tách t� s�i n�m �ư�c x� lý b�i pisatin là r�t cao (20nmol/min/mg protein microsome) và Km c�a nó ��i v�i pisatin
  14. 92 Nguy�n Th� Ng�c Dao �ư�c coi là th�p (<5�M). Theo �ó, s� kh� ��c c�a pisatin �ư�c coi là ch�c n�ng n�i t�i c�a Cyt-P450 này và s� t�ng h�p c�a nó là m�t cơ ch� t� v� sinh h�c �� ch�ng l�i h�p ch�t kháng khu�n. M�t gen (CYP57) mã hoá cho Cyt-P450 này �ã �ư�c dòng hoá và ��c trình t�. SU chuy[n hoá các ch&t lV Ho�t tính Aryl hydrocarbon hydroxylase (AHH) �ã �ư�c th�y trong Cunning hamella elegans, C. bainierit và Asp. Ochraceus TS. Ho�t tính AHH c�a nh�ng n�m này �ã �ư�c kích thích t�ng h�p b�i m�t s� arylhydrocarbon (hydrocacbon nhi�u vòng nhân thơm), b� �c ch� b�i nh�ng ch�t �c ch� ��c hi�u Cyt-P450 như là CO và SKF 525 A và ��nh v� trong phân �o�n microsomal. Cerniglia và Gibson �ã ti�n hành phân tích ��u tiên nh�ng phân t� t� benzo[a]pyrence do AHH xúc tác c�a C.elegans và ch� ra r�ng AHH c�a n�m cho ra cùng m�t s�n ph�m như là s�n ph�m �ư�c t�o thành b�i enzyme t� ��ng v�t có vú. M�i �ây, m�t gene c�a Cyt- P450 �áp �ng cho s� chuy�n hóa c�a benzo[a]pyrence �ã �ư�c xác ��nh trong Asp.niger và �ư�c g�i là CYP53. Các microsomes c�a A. ocraceus TS và Rhizopus nigrican �ã �ư�c công b� là có ho�t tính thu� phân 11�- progesterone và ho�t tính này �ư�c coi là ph� thu�c vào Cyt-P450 d�a trên s� nh�y c�m c�a nó ��i v�i m�t s� ch�t �c ch� Cyt-P450 ��c hi�u. Chloride peroxidase (chloro peroxidase) không phei là m;t thành viên cHa các Cyt-P450 Chloride peroxidase [EC.1.11.1.10] là m�t glycohemoprotein có m�t protoheme g�n v�i thiolate như là nhóm ngo�i �ư�c t�o ra b�i Caldariomyces fumago,là m�t enzyme ngo�i bào. C�u trúc ligand và k�t qu� ��c trưng quang ph� phân t� enzyme này là r�t gi�ng v�i c�a các Cyt-P450. Tuy nhiên, c�u trúc protein c�a nó khác rõ r�t v�i c�a các Cyt-P450, dòng hoá cDNA và phân tích trình t� cho th�y r�ng apoprotein c�a Chloride peroxidase ch�a 321 axit amin v�i TLPT 35.202 và không tìm th�y s� tương ��ng gi�a c�u trúc b�c 1 c�a nó v�i c�u trúc b�c 1 c�a các Cyt-P450S. TLPT bi�u ki�n c�a enzyme này �ã �ư�c xác ��nh là 42.000 v�i 25 – 30% carbonhydrate. Như v�y, Chloride peroxidase không �ư�c x�p vào siêu gia �ình Cyt-P450 m�c dù thu�c tính quang ph� là tương t� v�i các enzyme này.
  15. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 93 4.1.4. +i,u hoà s- t.ng hp Cyt-P450 bi vi khu1n nhân th-c Nh�ng vi sinh v�t thay ��i ch�c n�ng chuy�n hoá ph� thu�c vào �i�u ki�n phát tri�n. Vì h�u h�t các Cyt-P450 c�a vi khu�n �ã bi�t ��u �áp �ng cho s� c�n thi�t chuy�n hoá �� phát tri�n dư�i nh�ng �i�u ki�n ��c bi�t, nên s� t�o thành nh�ng Cyt-P450 như v�y trong vi khu�n �ư�c coi là �ư�c �i�u hoà b�i nhi�u y�u t� khác nhau. Cyt-P450alk c�a Candida sp. �ư�c kích thích t�ng h�p m�t cách ��c hi�u b�i n-alkane. Phương pháp lai Northern xác ��nh rõ ràng r�ng s� t�ng h�p này �ư�c gây ra b�i s� t�ng quá trình sao chép gen P450alk b�i n-alkane. S� c�m �ng c�a Cyt-P450alk b�i n-alkane không �ư�c quan sát th�y khi môi trư�ng có �� glucose cho s� phát tri�n, kh�ng ��nh r�ng m�t cơ ch� �i�u hoà ki�m ch� b�i glucose c�ng x�y ra ��i v�i s� bi�u hi�n c�a gen Cyt-P450alk. S� t�ng h�p c�m �ng c�a Cyt-P450 b�i m�t y�u t� ��c hi�u c�ng �ã �ư�c công b� ��i v�i m�t s� Cyt-P450 khác. Cyt-P450 t�o thành isobuten c�a R.minuta �ã �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i phenylalanin và Cyt-P450 kh� methyl c�a pisatin � N. haemadococca �ã �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i cơ ch�t c�a nó. S� thêm nitrat ho�c nitrit vào môi trư�ng nuôi c�y �ã kích thích t�ng h�p m�t d�ng Cyt-P450 hoà tan � F. oxysporum. S� t�ng h�p c�m �ng này c�a Cyt-P450 b�i ch�t ngo�i lai như là hoá ch�t gây ung thư và phenobarbital �ã �ư�c công b� ��i v�i m�t s� ho�t ��ng ph� thu�c Cyt-P450 c�a n�m s�i. M�c Cyt-P450 trong t� bào S.cereviseac t�ng lên khi hàm lư�ng O2 th�p và n�ng �� glucose cao trong môi trư�ng nuôi c�y. Vì n�ng �� O2 và glucose �nh hư�ng ��n nhi�u quá trình chuy�n hoá c�a n�m men nên có th� là s� t�ng h�p c�m �ng Cyt-P450 là do �nh hư�ng tr�c ti�p c�a nh�ng y�u t� này. Liên quan v�i �i�u này là nh�ng phát hi�n dư�i �ây: M�c Cyt-P450 t�ng lên khi �c ch� sinh t�ng h�p protein ti th� b�i Chloramphenicol và tương t� như v�y c�ng �ư�c th�y gi�a cAMP và Cyt-P450. Như mô t� trong chương 5, h�u h�t các Cyt-P450 � ��ng v�t có vú là nh�ng enzyme có kh� n�ng �ư�c t�ng h�p c�m �ng và s� hi�u bi�t v� cơ ch� �i�u hoà bi�u hi�n gen c�a chúng �ã có nh�ng bư�c ti�n nhanh chóng. Các Cyt-P450 monooxygenase t�o thành m�t siêu gia �ình kh�ng l� bao trùm t�t c� th� nhân th�t và nhi�u d�ng trong s� �ó có kh� n�ng �áp �ng ��i v�i s� chuy�n hoá nh�ng phân t� th�p khác nhau c�n thi�t cho s� thích nghi v�i stress môi trư�ng. Ti�p �ó, s� �i�u hoà bi�u
  16. 94 Nguy�n Th� Ng�c Dao hi�n gen �� �áp �ng v�i các y�u t� ngo�i lai khác nhau có th� là m�t ��c trưng quan tr�ng. Như v�y nghiên c�u so sánh cơ ch� �i�u hoà bi�u hi�n gen � th� nhân th�t b�c cao và th�p có th� là quan tr�ng cho s� hi�u bi�t v� ti�n hoá c�a h� th�ng Cyt-P450 monooxygenase trong th� nhân th�t. 4.2. Nh:ng enzyme Cyt-P450 cHa vi khufn 4.2.1. Nh4ng enzyme Cyt-P450 ca vi khu1n: Cyt-P450cam Cyt-P450cam là h� th�ng Cyt-P450 vi khu�n �ư�c hi�u bi�t rõ nh�t v� m�i liên quan gi�a c�u trúc và ch�c n�ng (xem chương 1). 4.2.2. Campho 5-exo-hydroxylase: Cyt-P450cam N�m 1959, Gansalus và cs �ã phân l�p �ư�c Pseudomonas putida PPG1 (ATCC17453), ch�ng này phát tri�n trên ��a ch�a Camphor như là ngu�n carbon duy nh�t. S� oxy hoá Camphor �ư�c b�t ��u b�ng s� t�o ra 5-exo-hydroxy Camphor b�i m�t h� th�ng monooxygenase v�i s� k�t h�p nh�ng c�u t� oxy hoá kh�. H� th�ng này ��i v�i ph�n �ng exo-hydroxyl hoá c�a Camphor có 3 enzyme tham gia là: a) NADH-putidaredoxin reductase (PdR), 1FAD-protein (TLPT 45,547: 422 axit amin) �ư�c mã hoá b�i gen Cam A. b) Putidaredoxin (Pd) 1 protein oxy hoá kh� có Fe-S (TLPT 11,418) mã hoá b�i gen Cam B. c) Cyt-P450cam, m�t c�u t� teminal hydroxylase (MW: 46,538; 414 axit amin) mã hoá b�i gen Cam C. S� t�o thành tính enzyme c�a h� th�ng thu� phân Camphor ��u tiên tương t� như h� th�ng Cyt-P450SCC trong ti th� v� thư�ng th�n ��ng v�t tham gia vào s� chuy�n hóa chu�i bên c�a cholesterol. Bư�c ti�p theo là s� kh� hydro c�a 5-OH Camphor �� t�o ra 2,5-diketocamphane (h�p ch�t �ư�c xúc tác b�i F-dehydrogenase (MW: 38,377; 361 axit amin). Sau m�t s� bư�c, cu�i cùng Camphor �ư�c chuy�n hoá thành 3 phân t� acetat và m�t phân t� isobutylate. T�t c� các gen, tr� nh�ng gen cho bư�c cu�i cùng c�a nh�ng ph�n �ng k� trên �ư�c ��nh v� trong m�t plasmid l�n (240 Kb) �ư�c g�i là CAM. 4 enzyme, s�n ph�m c�a các gen cam A, B, C và D �ã �ư�c tìm th�y là �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i Camphor. Nh�ng gen
  17. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 95 này �ã �ư�c dòng hoá và ��c trình t�, k�t qu� ch� ra r�ng c�u t�o di truy�n c�a các gen Cam, ít nh�t, bao g�m Cam DCAB trong m�t búi gen và t�o thành Cam operon. Cam R, m�t gen �i�u hoà âm, ��ng trư�c gen Cam D và �ư�c phiên mã � v� trí ��i di�n tr�c ti�p v�i Cam operon. Ch�t kìm hãm, m�t protein dimeric (TLPT c�a m�t mer (�ơn phân) là 20,300; 186 acid amin) là �áp �ng cho Camphor, nó t�o ra m�t s� t�ng h�p c�m �ng c�ng h�p c�a các gen Cam DCAB. Ch�t kìm hãm �ã �ư�c tách ra, g�n k�t vào operator và tách r�i ra kh�i nó khi có m�t Camphor. Ngư�i ta nh�n th�y r�ng gen Cam R c�ng �ư�c �i�u hoà t� ��ng b�i chính ch�t �c ch� c�a nó. Nh�ng ch�t c�m �ng t�ng h�p khác nhau ��i v�i h� th�ng này �ã �ư�c công b� và ngư�i ta c�ng bi�t v� s� có m�t c�a m�t ch�t �c ch� chuy�n hoá ��i v�i s� t�ng h�p có tính enzyme . Promotor c�a Cam operon �ư�c xác ��nh gi�a các gen c�a Cam D và Cam R. RNA polymesase c�a E.coli liên k�t v�i vùng mà nơi �y có trình t� nucleotid là -35 (TTGACC) và -10 (TATGCT). Gen �i�u hành (operator) (m�t c�u trúc palindromic - g�p �ôi, ��i x�ng) trên vùng ch�a trình t� -10 và nucleotid b�t ��u (� v� trí: +1) c�a Cam operon, ch�t kìm hãm �ư�c tách ra liên k�t vào vùng operator này in vitro. V� trí liên k�t ribosom �ư�c gi� ��nh, có trình t� Shine -Dargarno, là tương t� trong m�i gen Cam, GAGG c�a Cam D, AGGAG cho Cam C, GGAG cho Cam A, GAGG cho Cam B. Mã kh�i ��u là ATG cho Cam B, C, D và GTG cho Cam A. M�t c�u trúc vòng và hình cu�ng �ã �ư�c tìm th�y � ��u c�a gen Cam A và m�t promoter �i�u hành có th� c�a P.putida trong vùng gi�a các gen A và B. M�t ch�ng E.coli s�n xu�t quá m�c enzyme Cyt-P450cam �ã �ư�c t�o ra và s� lư�ng enzyme trong m�t h� nuôi c�y t� bào có th� �ư�c phát hi�n b�ng quang ph� phân bi�t CO c�a môi trư�ng nuôi c�y s� d�ng ch�ng vi khu�n này. 4.2.3. Cu trúc và ch c n8ng ca Cyt-P450cam Cyt-P450cam �ư�c s�n xu�t b�i P. putida �ó là m�t trong nh�ng h� th�ng t�t �� nghiên c�u m�i liên quan c�u trúc-ch�c n�ng c�a Cyt-P450 vì nó không liên k�t màng và có kh� n�ng thu �ư�c m�t lư�ng l�n m�t cách ��c bi�t sau khi gen �ư�c dòng hoá. Nh�ng
  18. 96 Nguy�n Th� Ng�c Dao nghiên c�u c�u trúc tinh th� tia X c�a m�t s� tr�ng thái P450cam, không và có liên k�t v�i cơ ch�t, liên k�t v�i CO cho phép s� d�ng các ��t bi�n ��c hi�u v� trí c�a protein này. (xem Chương 2). 4.2.4. M:i liên quan gi4a cu trúc và ch c n8ng ca Cyt-P450cam Như �ã nêu � trên, c�u trúc tinh th� tia X c�a m�t s� tr�ng thái c�a Cyt-P450cam t�o cho chúng ta kh� n�ng s� d�ng s� ��t bi�n v� trí ��c hi�u ��i v�i protein này. Th�c ra, m�t s� nghiên c�u �ã thành công trong vi�c thu nh�n m�t s� ��t bi�n c�a Cyt-P450cam và c�a nh�ng Cyt-P450 khác. Tuy nhiên, Cyt-P450cam �òi h�i nhi�u hơn hai c�u t� Pd và PdR, nhưng nh�ng protein này �ã không k�t tinh �ư�c và liên k�t gi�a ba protein v�n còn chưa �ư�c xác ��nh. �� t�p h�p nhi�u Cyt-P450 ��t bi�n bao g�m nh�ng ��t bi�n không th� liên k�t v�i Pd và (ho�c) PdR, nh�ng ý �� �ã �ư�c th�c hi�n �� phân l�p nh�ng ��t bi�n �ư�c kích thích t�ng h�p b�i hydroxylamine (in vitro x� lý ��i v�i DNA gen c�a Cam C), nh�ng t� bào có ��t bi�n này không th� m�c v�i Camphor nhưng có th� m�c v�i 5-exo-hydroxy Camphor và có kh� n�ng t�o ra protein Cyt- P450cam không có ho�t tính oxygen hóa trong s� có m�t c�a Pd và PdR. Trong trư�ng h�p Cyt-P450d t� microsome chu�t, Shimizu và cs công b� r�ng gi�ng như nh�ng protein Cyt-P450cam bi�n ��i nêu � trên, protein C(456)E và C(456)4 và G(458)E (C(456) �áp �ng cho C537 c�a Cyt-P450cam �ã không tham gia vào vi�c gi� hem. K(452)E th� hi�n m�t quang ph� phân bi�t CO sau khi b� kh� b�i dithionit nhưng không th� hi�n quang ph� b�i s� kh� trong �i�u ki�n tái t� h�p l�i, g�i ý r�ng Lys (453) tham gia vào s� t�o thành m�t h�p ch�t v�n chuy�n �i�n t� n�i phân t� (gi�ng như R112C c�a P450cam. Enzyme Cyt-P450d t� nhiên có c� hai ho�t tính Benzphetamin N-demethylation và 7-ethoxycoumarin O- dealkylation, nhưng m�t �i�u thú v� là, G(450)S protein ch� m�t ho�t tính th� hai trong khi I(457)S ch� m�t ho�t tính th� nh�t. R(455)G protein th� hi�n m�t ho�t tính th�p nh�t ��i v�i c� hai cơ ch�t. Nh�ng ��t bi�n nhân thơm như là F(425)L, P(427)L và F(430)L protein t� ra ho�t tính th� nh�t r�t th�p (10%) nhưng ho�t tính th� hai l�i r�t cao (250%). Như v�y s� bi�n ��i c�a vùng xa có th� �nh hư�ng ��n con �u�ng v�n chuy�n �i�n t� và m�t s� bi�n ��i nh� trong tính ��c hi�u cơ ch�t.
  19. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 97 g;t biWn enh h%ng PWn sU vEn chuy[n Pi!n tS tY Pd (putidaredoxin) Enzyme R112C c�a Cyt-P450cam không có ho�t tính xúc tác, nhưng b�o t�n phân t� hem m�c dù hàm lư�ng hem là không bình thư�ng (10-15 nmol/mg protein, kho�ng 75% n�ng �� c�a lo�i enzyme t� nhiên). Quang ph� h�p th� c�a liên k�t CO-liên k�t O2 và d�ng ferric (có camphor ho�c không có camphor) c�a enzyme ��t bi�n là tương t� v�i k�t qu� thu �ư�c t� enzyme typ d�i. K�t qu� này g�i ý r�ng s� chuy�n �i�n t� ��u tiên ��n R112C protein t� Pd �ã b� khóa l�i. B�ng phân tích stopped flow s� d�ng Pd b� kh� và enzyme ��t bi�n cho th�y r�ng giá tr� c�a h�ng s� t�c �� b�c 1 là quá th�p; 0,1/giây ��i v�i ch�t ��t bi�n trong m�c �� phân t� (R>15) c�a Pd b� kh� ��n Cyt-P450cam, trong khi nó là 40/giây ��i v�i Cyt-P450cam typ d�i trong kho�ng R>5. Giá tr� th�p này c�a vi�c chuy�n �i�n t� t� Pd d�ng kh� ��n enzyme ��t bi�n có th� là nguyên nhân cho s� m�t ho�t tính enzyme. Th� n�ng trung bình (Em) c�a protein ��t bi�n, s� d�ng safranin (Em = -225 mV) như là m�t ��i ch�ng, là -182mV, th�p �áng k� so v�i protein typ d�i (-138mV). Vì m�t trong nh�ng nhóm -NH2(2) c�a guanidin và = NH() c�a Arg112 (trong helix C) �ư�c ��nh v� g�n m�t bên c�a b� m�t hình tam giác c�a v� trí xa hem, và nhóm -NH2(1) khác c�a các d�ng Arg112 t�o thành liên k�t v�i OID c�a axit carboxylic c�a nhóm propionat hem, Arg112 có th� là r�t quan tr�ng ��i v�i s� chuy�n �i�n t� t� Pd d�ng kh�, và vùng xung quanh nhóm Arg này có th� là m�t trong vùng h�p lý nh�t cho s� ti�p xúc v�i m�t Pd d�ng kh�, và m�t protein acid, qua tương tác axit-bazơ, và ��i v�i vi�c ch�p nh�n m�t �i�n t� t� m�t Pd d�ng kh�. Th�c ra, nhóm c�a Sligars �ã ch� ra r�ng nh�ng axit amin láng gi�ng c�a Arg112, như là Cys344 và Arg72, cùng ��nh v� trên m�t b� m�t, �óng vai trò quan tr�ng trong s� tương tác gi�a Cyt-P450cam và Pd. Ngư�i ta c�ng ghi nh�n r�ng Arg112 là m�t axit amin không bi�n ��i cao c�a gia �ình Cyt-P450. Vì v� trí duy nh�t c�a Arg112 như mô t� � trên, g�c này c�ng �óng m�t vai trò quan tr�ng trong s� chuy�n �i�n t� n�i phân t� ��n s�t hem. S� d�ng ��t bi�n v� trí tr�c ti�p c�a Cyt-P450d, Shimizu và cs �ã xác ��nh r�ng lysin � v� trí (94) (99) (105) (440) (453) và (463), m�t Arginin � v� trí (135) (136) (137) và (455) trong Cyt-P450d có
  20. 98 Nguy�n Th� Ng�c Dao th� tham gia vào s� ti�p xúc v�i m�t s� chuy�n �i�n t� t� reductase c�a nó. Ngư�i ta c�ng nh�n ra r�ng K(94) K(440) K(463) và R(136) c�a Cyt-P450d �áp �ng cho R72, K344 và R112 c�a Cyt-P450cam, m�t cách tương �ng. g;t biWn P#i vhi liên kWt oxygen M�t chuy�n ��ng v�n c�c b� và s� m� r�ng c�a h�c trung tâm (Gly 248-Thr 252) c�a helix I xa t�o nên m�t cái túi cho phân t� oxygen. Chu�i bên, m�t nhóm –OH c�a Thr 252, là không bình thư�ng trong vi�c là nó cho m�t liên k�t hydro v�i nguyên t� Cacbonyl oxygen c�a Gly 287 và psi angle (liên k�t C�-N) và psi angle (liên k�t C�-C) c�a Asp251 là -108 và 5o, m�t cách tương �ng. M�c dù c�u trúc tinh th� c�a d�ng oxy hóa v�n chưa �ư�c bi�t, phân t� oxygen �ư�c coi là �ư�c gói trong túi oxygen b�i nh�ng g�c acid amin � vùng này. Trong s� nh�ng g�c không phân c�c, Asp251 ��ng ra ngoài ch� như m�t g�c ion hóa, và v� trí này ch� y�u là Asp ho�c Glu trong gia �ình Cyt-P450. Thr 252 h�u như không bi�n ��i trong các Cyt-P450 nh�n ch�c n�ng như là m�t ch�t cho proton và/ ho�c m�t ch�t xúc tác acid bazơ trong bư�c chuy�n hóa liên k�t O-O c�a ph�n �ng monooxygenase. Thr 252 �ã bi�n ��i thành A, V ho�c S. T�t c� nh�ng enzyme bi�n ��i trong s� có m�t c�a d-camphor ��u t�n t�i quang ph� h�p th� h�u h�t khác bi�t v�i quang ph� c�a enzyme d�i trong nh�ng d�ng ferric, ferrous, oxygen hóa và CO-ferrous. Trong m�t h� th�ng tái l�p v�i Pd và PdR, enzyme alanin tiêu th� O2 � m�t m�c �� (1100/p'/hem)có th� so sánh v�i t�c �� c�a enzyme d�i (1330/p'/hem) nơi s� lư�ng 5-exo-hydroxycamphor �ư�c t�o thành ít hơn 10% so v�i s� t�o thành b�i enzyme d�i. Kho�ng 85% oxy �ư�c tiêu th� �ã �ư�c tái t�o dư�i d�ng hydroxy peroxide. Enzyme valin th� hi�n nh�ng ��c tính tương t�, nhưng enzyme serin �ư�c t�n t�i th�c t� cùng m�t ho�t tính monooxygenase như là ho�t tính c�a enzyme d�i. Vì t�c �� t� oxy hóa c�a nh�ng (E) ��t bi�n là quá th�p �� tính toán t�c �� tiêu th� oxygen toàn b�, s� t�o thành H2O2 �ư�c coi là không b�i ngu�n này mà do s� phá v� c�u trúc c�a m�t h�n h�p peroxid �ư�c t�o ra b�i s� kh� c�a d�ng b� oxygen hóa t� Pd b� kh�. 252G, P ho�c C enzyme th� hi�n ��c tính tương t� v�i ho�t tính c�a (E) 252A trong khi 252N (E) thì tương t� v�i typ d�i. Như v�y, nhóm OH c�a Thr252 �óng vai trò quy�t ��nh trong s� phân
  21. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 99 �ôi liên k�t O-O c�a O2 trong ph�n �ng oxygenase. Nh�ng nghiên c�u gây ��t bi�n các v� trí c�a Cyt-P450 cam có th� xem thêm trong Chương I và Chương II � cu�n sách này. Nh:ng P;t biWn % liên kWt c ch&t Dùng phương pháp phân tích c�u trúc tinh th� tia X, ngư�i ta �ã ti�n hành quan sát các v� trí axit amin b� bi�n ��i � các v� trí như t�o ra các protein v�i Y96F, V247A, V295I, R186H, D251N, T101, I209L so sánh ho�t tính enzyme bi�n ��i v�i typ d�i �� rút ra nh�n xét v� vai trò c�a các axit amin này trong s� liên k�t v�i cơ ch�t. Bư�c ��u nh�n th�y vai trò thi�t y�u c�a các axit amin � các v� trí như 117, 209, 365. Ngư�i ta c�ng nh�n th�y là �� �áp �ng cho nhi�u cơ ch�t khác nhau, các axit amin tham gia vào s� liên k�t c�a cơ ch�t thư�ng n�m � các v� trí trong vùng “m�m d�o” có kh� n�ng bi�n ��i cao. 4.2.5. Nh4ng h< th:ng Cyt-P450  các vi khu1n khác SU thu` phân axit béo: P450(BM-1), P450(BM-2) và P450(BM-3) Bacillus megaterium ATCC 14581 �ư�c bi�t là có ch�a Cyt- P450 th�y phân axit béo. Fluco và cs s� d�ng ch�t chi�t không có t� bào c�a vi khu�n �ã phát hi�n Cyt-P450 th�y phân axit béo hòa tan, enzyme này xúc tác s� th�y phân �1, �2 và �3 c�a các acid béo bão hòa, các alcohol và các amide. Enzyme �òi h�i m�t cách tuy�t ��i NADPH như là ch�t cho �i�n t�. S� th�y phân nhóm methyl t�n cùng, �-1, �ã �ư�c quan sát. �i�u này ngư�c v�i Cyt-P450 th�y phân acid béo � � ��ng v�t có vú, enzyme này c�ng th�y phân �-1. Các enzyme th�y phân acid béo này là m�t h�n h�p c�a 3 Cyt- P450 khác nhau, �ó là Cyt-P450 1, -2, và -3. Nhóm c�a Fluco �ã tinh ch� Cyt-P450(BM)này. Cyt-P450(BM-1) tinh khi�t t� nó không có ho�t tính monooxygenase � m�c có th� phát hi�n �ư�c trong h� th�ng thí nghi�m chu�n ch�a NADPH v�i ho�c là myristate ho�c palmitoleate làm cơ ch�t. Tuy v�y, Cyt-P450(BM-1) xúc tác c� hai s� th�y phân epoxidation và hydroxylation c�a palmitoleate b�ng cách s� d�ng iodosyl benzene- diacetate, ch�t này �ư�c bi�t là m�t ch�t th� ph�, nó h� tr� s� th�y phân steroid và acid béo b�i m�t s� bi�n ��i c�a các lo�i Cyt-P450 khi không có NADPH, O2, ho�c các c�u t� reductase / redoxin. M�i �ây, Fluco và cs �ã tách dòng gen Cyt- P450(BM-1) t� DNA nhi�m s�c th� c�a B.megaterim ATCC 14581 DNA. Khung ��c m� mã hóa Cyt-P450(BM-1) mang 410 axit amin
  22. 100 Nguy�n Th� Ng�c Dao v�i TLPT là 47,439.Trình t� axit amin c�a Cyt-P450BM1 tương t� nhi�u v�i nh�ng Cyt-P450cam hơn là v�i b�t c� eukaryotes Cyt- P450 nào và gen c�a nó khác rõ r�t v�i gen c�a Cyt-P450(BM-3). Cyt- P450(BM-2) �ã �ư�c tách ra như là m�t c�u t� nh� hơn t� Cyt-P450(BM-3) trong quá trình tinh ch� Cyt-P450(BM-1). Cyt- P450(BM-2) �ã tinh ch� có kh�i lư�ng phân t� kho�ng 46 kDa và d� nhiên b�n thân nó không bi�u hi�n ho�t tính th�y phân axit béo trong h� th�ng thí nghi�m ch�a NADPH. Ngư�i ta còn bi�t ít v� Cyt-P450(BM-2). Cyt-P450(BM-3) th� 3 (là ch� y�u) có ��c trưng r�t thú v� có liên quan t�i c�u trúc và kh� n�ng t�ng h�p c�m �ng. C� BM-1 và BM-2 ��u có th� �ư�c kích thích t�ng h�p nhi�u hơn 100 l�n b�i phenobarbital và nhi�u barbiturat khác. �ây là trư�ng h�p ��u tiên �ư�c bi�t c�a monooxygenase ph� thu�c Cyt- P450 �ư�c t�ng h�p b�ng barbiturat trong prokaryotes. Khi có m�t NADPH và O2, BM-3 xúc tác s� th�y phân �-2 c�a axit béo bão hòa, alcohols và amines và s� th�y phân c�ng như epoxi hóa axit béo có m�t liên k�t không bão hòa như là axit palmitic. ��c trưng khác duy nh�t c�a Cyt-P450(BM-3) là ��c tính �ã �ư�c t�o ra b�i m�t polypeptid �ơn l� (MW: 119. 000) và có ho�t tính xúc tác ��c l�p. Khi có m�t NADPH và O2, BM-3 có th� xúc tác s� oxygen hóa axit béo mà không c�n thêm b�t c� protein nào khác, và có ho�t tính xúc tác kho�ng 4.600nmol acid béo �ư�c thu� phân/nmol P450, làm cho nó tr� thành Cyt-P450 monooxygenase ho�t ��ng nh�t �ư�c công b� cho t�i nay. Ho�t tính cao c�a protein có th� �ư�c mô t� c�n c� vào n�ng �� c�a nó là 1 mole FAD và FMN/mole heme và vai trò c�a Cyt-P450 NADPH-reductase và Cyt-P450 trên s�i peptid �ơn. Cyt-P450(BM-3) �ư�c tiêu hoá h�n ch� b�ng trypsin d�n t�i 2 �o�n polypeptid kho�ng 66.000 và 55.000 Da, �o�n th� nh�t �ư�c t�o ra t� ��u C t�n c�a Cyt-P450(BM-3) ch�a c� FAD và FMN nhưng không có hem và �o�n sau �ư�c xác ��nh là ch�a hem và có kh� n�ng g�n v�i acid béo. Protein 55 kDa d�ng b� kh� g�n CO th� hi�n m�t peak � 446 nm ��c hi�u cho Cyt-P450. Cu�i cùng, Fulco và cs �ã thành công trong vi�c tách dòng gen Cyt-P450(BM-3) nguyên v�n và �ã xác ��nh trình t� axit amin ��y �� c�a nó. S� li�u v� trình t� d� ki�n là 1048 g�c axit amin v�i TLPT là 117,641. Trình t� axit amin c�a �o�n Cyt-P450 có m�t � vùng N- t�n c�a Cyt-P450(BM-3) là tương t� nhi�u hơn (kho�ng 25%) v�i
  23. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 101 trình t� c�a Cyt-P450cam. �o�n có NADPH – Cyt-P450- Reductase có kho�ng 33% trình t� gi�ng v�i trình t� c�a gen Cyt-P450 ��ng v�t có vú. S� d�ng m�t plasmid tái t� h�p mang gen mã hóa Cyt-P450(BM-3), Boddupalli và cs �ã bi�u hi�n Cyt-P450(BM-3) trong E.coli �� t�o ra kho�ng 20% protein hòa tan hoàn toàn và Cyt-P450(BM-3) tinh s�ch. S� t�ng h�p Cyt- P450(BM-3) ti�n hành v�i ��i ch�ng dương tham gia vào ít nh�t 2 vùng �i�u hòa (R1 và R2) cái này b�ng qua kho�ng 1 Kb c�a vùng 5'-flanking c�a gen v�i vùng gen tương tác v�i protein ho�t ��ng v� trí trans. Steroid Hydroxylase (15-j): Cyt-P450meg Gustafson và cs �ã xác ��nh r�ng Steroid hydroxylase c�a d�ch chi�t vô bào c�a ch�ng B.megatermin ATCC 13368 là Cyt- P450 ch� th�y phân 3-oxo-�4-steroids (như là progestesone) � v� trí 15�. Cyt-P450meg này �ã �ư�c tinh ch� hoàn toàn và TLPT là 52kDa �ã �ư�c tính toán cho hemoprotein này. 15�-Steroid Hydroxylase �òi h�i 3 c�u t� cho ho�t ��ng xúc tác: 1 Flavoprotein ch�a NADPH ph� thu�c FMN (megaredoxin reductase), 1 protein Fe-S (megaredoxin) và Cyt P450meg. �� tìm ki�m các ch�t kích thích t�ng h�p, m�t s� lo�i như steroids, phenobarbital, axit béo �ã �ư�c kh�o sát nhưng chưa có ch�t nào có kh� n�ng kích thích t�ng h�p Cyt P450meg. M�t �i�u thú v� là c� megaredoxin và metochondrial adrenodoxin (t� ti th� tuy�n thư�ng th�n) cùng bi�u hi�n ho�t tính chéo trong h� th�ng khác nhau và r�ng megaredoxin reductase có th� �ư�c thay th� b�ng adrenodoxin reductase ho�c NADPH-Cyt P450- Reductase t� microsome gan th�. Ví d�, megaredoxin reductase cho �i�n t� ��n Cyt P45011� và Cyt-P450LM-3 microsome gan th�, ch�ng t� r�ng chu�i v�n chuy�n �i�n t� c�a h� th�ng th�y phân steroid trong B.megatermin ��c hi�u không cao, ngo�i tr� c�u t� terminal Cyt-P450. Alkane Hydroxylase Có hai loài vi sinh v�t s�n xu�t ra Alkane Hydroxylase ph� thu�c Cyt-P450 �ã �ư�c bi�t cho ��n nay. M�t là Rhodococcus rhodochrous ATCC 19067, �ã �ư�c x�p lo�i là Coryne bacterium, loài th� 2 là Acinetobacter calcoaceticus. Cardini và Jurtshuk �ã tìm th�y m�t Hydroxylase n-octan ph� thu�c vào Cyt-P450 t� rhodochrous m�c trong môi trư�ng ch�a n-
  24. 102 Nguy�n Th� Ng�c Dao octane như là ngu�n carbon duy nh�t cho s� phát tri�n. Ho�t tính th�y phân �ư�c t�o ra b�i n-octane là 6 l�n cao hơn so v�i ch�t kích thích t�ng h�p là acetate. D�ch chi�t vô bào t� nh�ng t� bào b� phá v� b�i siêu âm �ã th�y phân n-octane �� t�o ra 1-octanol như là m�t s�n ph�m duy nh�t trong s� có m�t c�a NADPH, O2 và 1 phân �o�n riêng bi�t có s� kh� ��c hi�u th� hi�n quang ph� phân bi�t v�i CO xác ��nh r�ng h� th�ng này là 1�-Hydroxylase ph� thu�c Cyt-P450. H� th�ng th�y phân c�a R.rhodochrous �ư�c �ưa ra g�m m�t NADPH- Cyt P450- Reductase. (1 FAD-FMN protein) và m�t Cyt- PP450 tương t� như h� th�ng � microsome ��ng v�t có vú. Ngư�i ta nh�n th�y r�ng vi khu�n như v�y có kh� n�ng m�c trong môi trư�ng ch�a nh�ng n-alkane khác nhau t� C3 ��n C18 c�a nh�ng alkane không bão hòa dài hơn 10 carbon ho�c th�m chí c� chloroalkanes như là 1-chorooctane và 1 chlorooctadecane. Aspesge và cs �ã phát hi�n ra m�t ch�t có kh� n�ng t�ng h�p hexadecane và Cyt-P450 hòa tan t� loài Acinetobactes calcoaceticus EB 104. Không có s� h�n ch� xúc tác, Cyt-P450 �ã �ư�c kích thích t�ng h�p b�i n-alkane t� hexan thành hexadecan, nonance và decance là nh�ng ch�t kích thích t�ng h�p ho�t ��ng nh�t trong s� chúng. S� t�ng h�p Cyt-P450 c�ng �ã �ư�c kích thích b�i nh�ng h�p ch�t không có liên quan v�i n-alkane, ví d� như biphenylidence, phenanthrene, nhưng không b�i Phenobarbital. Nghiên c�u m�i �ây cho th�y r�ng Cyt-P450 c�a A.celloacetius th�y phân C t�n c�a n-alkane và r�ng h� th�ng Cyt-P450 �- Hydroxylase �ư�c t�o ra b�i 3 c�u t� NADH-feredoxin reductase, feredoxin và Cyt-P450. Benson và cs th�y s� có m�t c�a n-alkane Hydroxylase �- 1 mã hóa b�i gen alkB trên OCT plasmid c�a P.putida. Nh�ng enzyme này không ph�i là protein ph� thu�c Cyt-P450 nhưng là m�t protein g�n màng v�i TLPT là 41kDa. Linalool 8-Methyl Hydroxylase: Cyt-P450lin Lindalool 8-Methyl Hydroxylase (P450lin) và các c�u t� liên quan c�a nó �ã �ư�c tinh ch� b�i Ulah và cs t� Pseudomonas putida (incognita), enzyme này �ã �ư�c tách b�i Madyastha và cs. H� th�ng Cyt- P450lin ch�a 3 protein như là Cyt- P450cam.TLPT c�a NADH-LIN-red. là 44.000, c�a LIN-redoxin là 11.000 và c�a Cyt-P450lin là 46.000, r�t g�n v�i s� li�u c�a h� th�ng th�y phân c�a Cyt-P450cam.
  25. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 103 M�c dù có s� gi�ng nhau v� hóa h�c và v�t lý gi�a camphor và linalool c�a terpence, nhưng không có cái nào trong 3 lin-protein th� hi�n ho�c ho�t tính mi�n d�ch chéo ho�c ho�t tính xúc tác trong h� th�ng tái l�p d� h�p t�. Các ch�t kích thích t�ng h�p các enzyme này là acyclic, ho�c cyclicterpenes như là linalool, geraniol, nerol, citronellol ho�c limonene và s� kích thích t�ng h�p c�a h� th�ng này nh�y c�m v�i glucose, 8-methyl linalool �ư�c oxy hóa thành linalool-8-carboncylic acid qua 8-alcohol và 8-aldehyde c�a nó. Ngư�i ta nh�n th�y r�ng � vi khu�n, t�n t�i h� th�ng tương t� Cyt- P450 th�y phân m�t g�c methyl � v� trí 10 c�a linalool. p-Cymene-7- Hydroxylase: Cyt-P450cym Bhattacharyya và cs �ã phân l�p Pseudomonat, ch�ng PL, ch�ng này lên men � và �-pinence. Enzyme có kh� n�ng �ư�c t�ng h�p c�m �ng và nh�y v�i glucose. Cyt-P450cym c�a Pseudomonas putida PL-W ho�c dòng JT-101 ( cùng m�t dòng như trên) có kh� n�ng phát tri�n trên P-cymene (4-isopropyl-toluene) �ư�c coi là P- cymene-hydroxylase và enzyme th�y phân P-cymene t�o thành cumic alcohol (4-isopropyl-benzyl alcohol). P-putida JT-810 �ư�c tách b�i Ribbon và cs c�ng có kh� n�ng m�c trên P-cymene và bư�c kh�i ��u �ư�c xúc tác b�i m�t enzyme có th� là ph� thu�c Cyt-P450. Dealkylase Castwright và Broadbent �ã tách và tinh s�ch m�t O-dealkylase ph� thu�c Cyt-P450 t� Nocrsdia srtain NHI. Cyt-P450 kh� alkyl c�a p-alkylphenyl ethers như là axit anisinic và isovarilate. Enzyme này �ư�c t�o ra t� ít nh�t hai c�u t�: Reductase ch�a flavin ��c hi�u NADH (MW >70.000)và Cyt-P450pda (MW: 45,000). Dardas và cs �ã phân l�p Moraxella SP, loài này có th� m�c trên guaiacol (2 methoxy- phenol) ho�c 2-ethoxyphenol như là m�t ngu�n carbon. Loài vi khu�n này t�o ra m�t O-demethylase ph� thu�c Cyt- P450. P450S tY Rhizobium Japonicum Appleby th�y r�ng Cyt P450 có � dòng vi khu�n Rhizobium c� ��nh ��m (dòng CC705), và �ã ti�n hành xác ��nh �ư�c 6 Cyt- P450(a,b,c1 - c4), tinh ch� �ư�c Cyt-P450a,b,c1. T�t c� các Cyt-P450 �ư�c tinh s�ch có TLPT 45,000. Phân tích axit amin c�a các Cyt-
  26. 104 Nguy�n Th� Ng�c Dao P450 ch� th�y 2 g�c Cys, ch�ng t� r�ng nó tương t� v�i Cyt-P450 microsom và Pseudomonas, và k�t qu� này �ã �ư�c �ng h� b�i nh�ng nghiên c�u hóa mi�n d�ch. Trong quang ph� h�p th�, nh�ng Cyt-P450 th� hi�n các tr�ng thái spin th�p, Cyt-P450 spin cao và nh�ng Cyt-P450 trung bình. Trong t� bào phát tri�n y�m khí có Nitơ, các Cyt-P450 �ư�c t�o ra m�t cách rõ r�t. Nh�ng Cyt-P450 này �ư�c g�i chung là nh�ng oxydase, peroxydase ho�c ch�t mang oxygen màng trong m�t con �ư�ng oxy hóa - phosphoryl hóa có hi�u xu�t cao. Nh:ng Cyt-P450 vi khufn khác M�t Cyt-P450cb hòa tan (MW: 50.000) �ã thu �ư�c b�i Yamamoto và cs t� Corynebacterin SP m�c trong m�t môi trư�ng mu�i t�i thi�u ch�a cholesterol như là ngu�n carbon và ngu�n n�ng lư�ng duy nh�t. T� �ó, �ã th�y r�ng có m�t s� bi�n ��i r�t r�ng c�a các lo�i Cyt P450 vi khu�n t�n t�i trên trái ��t. M�t s� trong các genes P450 �ư�c k�t h�p ch�t ch� trong genom vi khu�n và m�t s� � trên m�t plasmid v�n chuy�n và chuy�n m�t cách d� dàng t� loài vi khu�n này sang loài vi khu�n khác, tái t� h�p l�i �� t�o ra nh�ng ch�c n�ng m�i. Cyt-P450-Monooxygenase là nh�ng enzyme khơi mào quan tr�ng cho vi�c b�t ��u các con �ư�ng chuy�n hóa, �ó là, kh� n�ng �� xúc tác m�t kh�i lư�ng cơ ch�t khác nhau l�n �� t�o ra nh�ng ch�t chuy�n hóa có l�i m�i và kh� n�ng �� chuy�n hóa các cơ ch�t không c�n thi�t trong sinh thái h�c. V� m�t nghiên c�u cơ b�n, �i�u c�n thi�t là t� ch�c nh�ng nghiên c�u th�c nghi�m nh�m s� d�ng các Cyt-P450 c�a vi khu�n. M�t s� h� th�ng vi sinh v�t �ã �ư�c nghiên c�u k� trong khi m�t s� khác thì chưa. �ó là �i�u khó kh�n cho vi�c nghiên c�u s�n xu�t �ư�c m�t lư�ng l�n enzyme. Tuy nhiên, s� ti�n b� trong k� thu�t thao tác gen cung c�p cho chúng ta phương ti�n �� phát tri�n nh�ng h� th�ng h�u ích hơn ��i v�i c� nghiên c�u khoa h�c l�n áp d�ng th�c t�. 4.3. Các enzyme Cytochrome – P450 % thUc vEt 4.3.1. Tính Aa dBng và ch c n8ng ca Cyt-P450 th-c vCt Cách �ây kho�ng hơn 40 n�m �ã xu�t hi�n 2 công b� ��u tiên v� Cyt-P450 trong các phân �o�n c�a màng tách t� th�c v�t b�c cao, v� m�i liên quan c�a chúng m�t m�t v�i s� oxy hoá các cơ ch�t sinh h�c
  27. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 105 (Kaurene) (Murphy và West, 1969) và m�t khác là v�i thu�c tr� sâu (monuron) (Frear và cs, 1969). Ngày nay, �ã có nh�ng ch�ng c� k�t lu�n v� s� tham gia c�a chúng vào s� oxy hoá c�a ít nh�t 30 cơ ch�t sinh h�c và 20 ch�t ngo�i lai (Durst và Benveniste, 1993). T� nh�ng nghiên c�u v� s� �c ch� và t�ng h�p invivo, s� d�ng m�t s� li�u c�a nhi�u cơ ch�t khác nhau ngư�i ta th�y r�ng Cyt- P450 có l� tham gia vào m�t s� lư�ng �áng k� các ph�n �ng oxi hoá �òi h�i cho s� sinh t�ng h�p các ch�t chuy�n hoá th� c�p � th�c v�t. Ngư�i ta tin r�ng có nhi�u hơn 20.000 ch�t chuy�n hoá th� c�p mà nh�ng ch�t này �ư�c xác ��nh ��n nay ch� m�i chi�m 5-10% trong t�ng s� toàn b� cơ ch�t có trong t� nhiên. Theo ư�c tính có t�i 200.000 ��n 400.000 ch�t chuy�n hóa th� c�p có trong th�c v�t b�c cao. S� lư�ng các ph�n �ng do Cyt-P450 xúc tác có th� là r�t l�n. Ph� r�ng các Cyt-P450 “sinh lý” nhi�u hơn so v�i s� t�n t�i c�a s� ��ng phân c�a enzyme và chúng có tính ��c hi�u cơ ch�t r�ng t� cơ ch�t sinh h�c ��n các ch�t tr� sâu và hoá ch�t môi trư�ng. SU Pa dVng cHa các phen Tng T�t c� các Cyt-P450 monooxygenase th�c v�t �ư�c mô t� cho t�i nay là các microsomal Cyt-P450. H�u h�t các nghiên c�u v� phân �o�n dư�i t� bào �ã ch� ra r�ng Cyt-P450 g�n vào lư�i n�i nguyên sinh m�c dù s� g�n k�t v�i màng bào tương và nh�ng phân �o�n ti�n không bào c�ng �ã �ư�c công b� (Durst, 1991). Không có d� li�u ch�c ch�n v� Cyt-P450 ti th� hay th� di�p l�c trong th�c v�t. S� phân b�, s� kích thích t�ng h�p và ch�c n�ng c�a nh�ng enzyme này �ã �ư�c t�p h�p b�i Durst 1991. Bên c�nh s� thu� phân và epoxi hoá, các Cyt-P450 th�c v�t còn xúc tác m�t s� lư�ng l�n các ph�n �ng ��ng phân hoá, ph�n �ng chuy�n hoá, vòng hoá c�p �ôi C-C và s� oxy hoá kh� bão hoà. Nh�ng ho�t tính này ph� thu�c vào m�t s� tính ch�t ��c trưng ��c bi�t c�a hemoprotein th�c v�t nhưng c�ng ph� thu�c vào kh� n�ng ph�n �ng hoá h�c c�a cơ ch�t và c�a các ch�t chuy�n hoá trung gian xúc tác �ư�c sinh ra � v� trí ho�t ��ng. M�t ngo�i l� �áng chú ý là enzyme allene oxide synthase (AOS), m�t hemoprotein ph� thu�c NADPH và O2 �ư�c tinh s�ch t� h�t lanh b�i Sony và Brash (1991). Enzym này xúc tác s� kh� hydrat hoá c�a 13-hydroperoxylinoleat (hình 4.3) �� t�o thành m�t allene oxide, ch�t này có th� b� vòng hoá thành axit jasmonic, m�t hormon stress c�a th�c v�t ho�c b� thu� phân thành nh�ng �- và �� ketols tương �ng (1, 2 và 3 trong hình 4.3).
  28. 106 Nguy�n Th� Ng�c Dao Hình 4.3. Ph�n �ng �ư�c xúc tác b�i allene oxide synthase (AOS) t� h�t lanh Trình t� peptid suy di�n t� cDNA c�a AOS (CYP 74) �ã �ư�c xác ��nh m�i �ây bi�u hi�n �� l�ch l�n kh�i c�u trúc bình thư�ng c�a Cyt-P450 trong helix L và K và trong vùng liên k�t hem. �i�u này �nh hư�ng ��n “rãnh oxygen” �ư�c t�p trung xung quanh axit amin threonin �ư�c b�o t�n cao (T252 trong Cyt-P450cam), axit amin này �ã b� m�t trong AOS. H�u h�t các ho�t ��ng sinh lý �ư�c mô t� cho ��n nay ��u t�p trung vào 3 con �ư�ng chính (hình 4.4) c�a cái �ư�c g�i là s� chuy�n hoá th� c�p � th�c v�t: phenylpropanoids (ch�t màu, ch�t b�o v� kh�i tia UV, các phân t� �� kháng), terpenes (sterols, hormone, nh�ng ph�n t� �� kháng, aroma-ch�t thơm), acid béo (cutin và ti�n ch�t suberin, nh�ng ph�n t� �� kháng ). Ngày càng có thêm nhi�u nh�ng d�n ch�ng rõ ràng là Cyt-P450 còn tham gia vào m�t s� �a d�ng hoá r�t l�n c�a các ch�t chuy�n hoá ��c hi�u loài như là s� th�y phân arginine trong nh�ng loài Cyanogenic (m�u xanh) hay ch�a cyanur (Halkier và Moller, 1991), s� c�p �ôi C-C para-ortho. Trong nh�ng loài t�ng h�p opioid (Gerardy và zenk, 1993) Bên c�nh nh�ng ph�n �ng sinh lý, Cyt- P450 còn �óng m�t vai trò quan tr�ng trong chuy�n hóa sinh h�c c�a các ch�t l�, thu�c tr� sâu, ch�t th�i. ��i v�i m�t s� hóa ch�t di�t c� (herbicide) ngư�i ta �ã xác ��nh r�ng Cyt-P450 là y�u t� ��u tiên �ư�c l�a ch�n �� nghiên c�u và nó c�ng �ư�c chú ý t�i trong s� ra ��i các lo�i ch�t di�t c� sinh h�c.
  29. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 107 Hình 4.4. M�t s� cơ ch�t ��c trưng c�a Cyt-P450 th�c v�t: axit tr-cinnamic, digitoxin, axit oleic và tyrosine. Ghi chú: Fatty acids: Các axit béo; Others: Các ch�t khác 4.3.2 S- t.ng hp cEm ng Cyt-P450  th-c vCt M�t s� nghiên c�u �ã ch�ng minh cho s� kích thích t�ng h�p ch�n l�c m�t s� d�ng Cyt-P450 b�i các nhân t� hoá h�c, v�t lý và sinh lý (b�ng 4.3). M�t nhóm ch�t �ư�c g�i là safener, là hóa ch�t �ư�c s� d�ng �� b�o v� m�t s� lo�i ng� c�c ch�ng l�i côn trùng. Safener c�ng �ư�c s� d�ng trên các cánh ��ng. Chúng �ư�c phát tri�n b�i s� sàng l�c, nhưng công trình m�i �ây do m�t s� nhóm, �áng chú ý là nhóm nghiên c�u � phòng thí nghi�m c�a S.Frear � Fargo, �ã g�i ý r�ng cơ s� phân t� cho safener ho�t ��ng là s� kích thích t�ng h�p các ��ng phân Cyt-P450. Ví d� dư�i �ây �ư�c rút ra t� công trình c�a Zeinmerlin và Durst (1992) S� thanh th�i c�a lúa mì ��i v�i ch�t di�t c� là do kh� n�ng c�a chúng xúc tác s� th�y phân vòng aryl c�a các c�u trúc hóa h�c khác nhau. Ngư�i ta c�ng thu �ư�c s� kích thích t�ng h�p r�t cao b�ng cách k�t h�p, theo m�t trình t� x� lý
  30. 108 Nguy�n Th� Ng�c Dao nh�t ��nh, k�t h�p nh�ng �nh hư�ng c�a Phenobarbital (PB) và naphtalic anhydride (NA), m�t safener �ã �ư�c bi�u hi�n t�t. Trong thí nghi�m � hình 4.5, ngư�i ta �ã b�c h�t lúa mì b�ng NA và sau 48h n�y m�m, x� lý h�t v�i PB. Quá trình k�t h�p này làm t�ng 20 ��n 35 l�n s� oxy hóa diclofop- m�t diphenylether, chlorsulfuron- m�t sulfonylurea và chlortoluron- m�t phenylurea. Hơn n�a, s� oxy hóa 2,4-D có th� �o �ư�c trong khi �ã không th� phát hi�n �ư�c � h�t ��i ch�ng. B ng 4.3. Lo i Cht kích thích t"ng h#p Các y�u t� v�t lý Ánh sáng, tia UV V�t thương, oxygen, n�m, virus, elicitor Thách th�c b�i m�m b�nh (ch�t chi�t màng n�m m�c ) Ch�t hóa h�c Manganese, cadmium, th�y ngân , clofibrate, (axit, ester và các ch�t tương t�), phenobarbital, aminopyrine, ethanol. Biphenyl, arochlor, -naphto flavone, isosaffrole, ch�t di�t c� (2,4-D, monurone, chlortoluron, mecoprof ) Safener (NA, cyometrinil, oxabetrinil, CGA, (133205 ) azoles. Vi�c tìm ra nh�ng hóa ch�t gi�ng nhau ho�c tương t� có th� kích thích t�ng h�p Cyt-P450 � c� ��ng v�t và cây xanh làm xu�t hi�n câu h�i li�u �ây là s� trùng h�p ng�u nhiên hay th�c t� có th� là có m�t cơ ch� chung?. Nh�ng nghiên c�u v� s� sinh t�ng h�p các enzym th�y phân axit béo th�c v�t do Salaun và c�ng s� ti�n hành (Benveniste và cs. 1982, Salaun và cs. 1981, Zimmerlin và cs.1992) g�i ý r�ng ít nh�t PB và clofibrate có th� ho�t ��ng ch�c n�ng theo m�t cách tương t� nhau � các t� ch�c ��ng v�t và th�c v�t. K�t qu� c�a h� ch� ra r�ng PB và clofibrate kích thích t�ng h�p m�t cách ch�n l�c enzym th�y phân  và (-1) c�a axit béo chu�i dài và trung bình m�t cách tương �ng. Trong m�t s� loài th�c v�t, ch� y�u là � h� ��u, các axit béo �ư�c th�y phân m�t cách riêng bi�t � ��u methyl t�n cùng (v� trí ) b�i Cyt-P450 microsomal. (Benveniste và cs., 1982). C�ng như � ��ng v�t có vú, clofibrate và nh�ng ch�t làm t�ng s� phân chia t� bào peroxisome kích thích t�ng h�p m�t cách ch�n l�c nh�ng - hydroxylase th�c v�t này (Salaun và cs. 1987) và gây ra s� t�ng
  31. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 109 cư�ng phân chia peroxisome (cơ quan t� ch�a nhi�u peroxidase). �áng k� là nh�ng microsome tách t� h�u h�t nh�ng loài th�c v�t khác nhau ��u xúc tác s� oxy hóa bên trong chu�i. � các microsome tách t� h�t lúa mì, axit lauric �ư�c th�y phân � cacbon s� 11, 10, và 9 b�i (-1)-LAH (Zimmerlin và cs., 1992).  -hydroxylase ( -1)-hydroxylase ( -3)-hydroxylase (Cây ��u t�m sativa) (Cây lúa mì) (cây artiso Jerusalem) Hình 4.5. S� ch�n l�a vùng và s� kích thích t�ng h�p h� th�ng 3-laurate-hydroxylase � th�c v�t b�c cao. Như � hình 4.5, enzyme th�y phân (-1) c�a laurate �ư�c kích thích t�ng h�p t�ng 11 l�n b�i PB. Trong cây artiso jerusalem, acid 10-, 9-, và 8-hydroxylauric �ư�c t�o ra b�i IC-LAH, enzyme này c�ng �ư�c kích thích t�ng h�p m�nh b�i PB (Salaun và cs., 1981 và 1993). �i�u �áng chú ý là không có nh�ng phân �o�n microsome nào �ư�c phân tích cho t�i nay là có kh� n�ng th�y phân c� cacbon t�n cùng và g�n t�n cùng. �i�u này trái ngư�c rõ v�i các h� th�ng c�a ��ng v�t nơi mà c� hai ph�n �ng ��u x�y ra trong cùng các phân �o�n microsome gi�ng nhau. SU Pa dVng hóa cHa các Cyt-P450 thUc vEt Trong nh�ng n�m qua, nh�ng ph�n �ng ph� thu�c Cyt-P450 khác nhau �ư�c mô t� � th�c v�t bao g�m m�t s� các d�ng isozym. Tuy nhiên, do r�t khó kh�n trong vi�c tinh s�ch các isozyme sao cho v�n gi� �ư�c ho�t tính, nên nh�ng th�c m�c v� tính ��c hi�u cơ ch�t c�a m�t isozyme Cyt-P450 th�c v�t v�n chưa �ư�c gi�i quy�t. M�i �ây, Vrerck-Reichart và cs, trong phòng thí nghi�m c�a h�, �ã tinh s�ch (Gabriac và cs., 1991) và tách dòng (Teutsch và cs., 1993) �ư�c enzyme cinnamic acid 4-hydroxylase (CA4H), m�t Cyt- P450 ch� y�u � th�c v�t (hình 4.6). Con �ư�ng chuy�n hoá ��y �� này �ư�c kích thích m�nh b�i m�t lo�t các y�u t� sinh h�c và không
  32. 110 Nguy�n Th� Ng�c Dao sinh h�c và CA4H d� b� t�n thương m�t ph�n ��i v�i m�t s� th� như ánh sáng, v�t thương, côn trùng và s� ti�p xúc v�i nh�ng hoá ch�t khác nhau. D. Pompon (CNRS. Gif) và M. Kazmaier (Orsan, Paris) �ã bi�u hi�n �ư�c enzyme này v�i hi�u su�t r�t cao (turn- over=400) trong các t� bào n�m men. K�t qu� này cung c�p m�t h� th�ng lý tư�ng cho s� phát hi�n cơ ch� chuy�n hoá nh�ng cơ ch�t có ái l�c th�p. Tia UV Ánh sáng Tbn Kích thích sinh Kích thích không sinh PN thng c hXc hXc hXc - Các sqc t# - Các phân tS beo v! - Các b; phEn cHa thành tW bào - Các thành phMn bi[u Bì - Các ch&t beo v! tia UV Hình 4.6. S� tham gia c�a CA4H và nh�ng Cyt- P450 khác nhau vào con �ư�ng chuy�n hóa phenylpropanoid Francis Durst và cs �ã nghiên c�u kh� n�ng xúc tác c�a CA4H ��i v�i t�t c� các cơ ch�t sinh lý c�a Cyt-P450 th�c v�t �ư�c xác ��nh cho ��n nay và thêm c� m�t s� lư�ng l�n các ch�t ngo�i lai. �i�u thú v� là không có h�p ch�t sinh h�c nào trong s� �ó, th�m chí c� phenylpropanoids-ch�t th� hi�n ki�u cinnamate, là �ư�c chuy�n hoá. Ngư�c l�i, 7-ethoxy và 7-methoxycoumarin, ch�t di�t c� chlortoluron và PCMA l�i là cơ ch�t c�a CA4H (b�ng 4.5). Nh�ng k�t qu� này cho th�y r�ng enzyme, trong khi có s� ph�n �ng phân bi�t rõ v�i các h�p ch�t n�i sinh có th� có m�t trong cùng nh�ng ng�n dư�i t� bào, l�i c�ng có kh� n�ng t�t �� thích �ng và xúc tác chuy�n hoá các ch�t ngo�i lai.
  33. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 111 �i�u thú v� là PCMA c�ng �ư�c chuy�n hoá b�i CYP71 c�a cây lê tàu (Bozak và CS, 1992), �i�u �ó ch�ng t� r�ng cùng m�t hoá ch�t có th� là cơ ch�t c�a nh�ng ��ng phân khác nhau. B ng 4.4. Nh�ng ph�n �ng do Cyt-P450 xúc tác trong microsomes n�m men �ư�c bi�n n�p CA4H t� Artiso Jerusalem CA4H Ph n &ng '#c th( nghi)m C cht ph n &ng t, nm men OH Cinnamate 4-Hydroxylase O ++++ 7-Ethoxycoumarin O-Deethylase ++ H5C2 O O O 7-Methoxycoumarin O- CH O- + Demethylase 3 H p-Chloro-N-methylaniline Cl N ++ (PCMA) CH3 NH O Chlorotoluron hydroxylase N + H3C H3C CH3 Cl Hi�n nay, có r�t ít thông tin v� m�i liên quan gi�a các Cyt-P450 th�c v�t cùng tham gia trong cùng m�t con �ư�ng chuy�n hoá, nguyên nhân có th� là, m�c dù vi�c phân tích trình t� cDNA �ã tr� nên có th�, nhưng v�n r�t ít (cho t�i gi� m�i có 3) �ã �ư�c g�n v�i m�t ph�n �ng sinh lý. Trong hình 4.7: di�n t� s� gi�ng nhau gi�a CA4H tách t� Artiso Jerusalem và 3 trình t� CYP73 khác t� lo�i cây có t�n, cây ��u xanh và A.thaliana. V� trí axit amin ��ng nh�t >80% là r�t cao khi xét ��n kho�ng cách ti�n hoá gi�a ph�c h�p fabaceae và brassicaceae. �i�u này là b�ng ch�ng cho vai trò trung tâm c�a CA4H, ch�t xúc tác bư�c oxy hoá ��u tiên trong con �ư�ng
  34. 112 Nguy�n Th� Ng�c Dao chuy�n hoá phenylpropanoid. Dòng cu�i cùng trong hình 4.7 cho th�y s� gi�ng nhau gi�a cinnamate hydroxylase và 2 flavonoid 3’5’- hydroxylases (CYP 75), enzyme này oxy hoá nh�ng flavonoids ki�u cinnamate. Tuy nhiên, ch� m�t ít g�c c�m l�i � m�t s� v� trí là �ư�c b�o t�n gi�a 2 gia �ình. C�ng r�t hay là v�i c�u trúc tinh th� m�i �ây c�a Cyt-P450BM 3 và Cyt-P450 scc, có th� xác ��nh �ư�c cái gì quy�t ��nh trong s� nh�n d�ng cơ ch�t. Hình 4.7. Hàng trên cùng (CYP73.Con) th� hi�n s� tương ��ng gi�a các CYP73 c�a 4 loài th�c v�t: Artiso Jerusalem, A. thaliana, cây ��u xanh và cây d�ng t�n, hàng dư�i (pheprop. Con) th� hi�n s� tương ��ng gi�a các CYP73 và CYP75 Hình 4.8 bi�u di�n m�i liên quan ki�u t�ng �ôi m�t trong s� 26 Cyt- P450 th�c v�t. Ch� có 4 CYP73 (cinnamate hydroxylase) và flavonoid 3’5’-hydroxylase mã hóa cho m�t ch�c n�ng sinh lý xác ��nh. 16C rõ r�ng là m�t thành viên m�i c�a gia �ình CYP73. �áng chú ý là không có m�t cá th� nào c�a các Cyt-P450 này là tương t� v�i m�t Cyt-P450 nào khác � ��ng v�t ho�c vi sinh v�t. Trình t� t� 1C t�i 16C �ã thu �ư�c t� Catharantus roseus b�ng ph�n �ng PCR s� d�ng m�t m�i suy di�n vùng liên k�t hem (Meijer và cs., 1993). Vì trình t� t� 1C ��n 16C là r�t riêng bi�t (t� Cys liên k�t hem t�i ��u carboxy t�n), nên cây ph� h� �ư�c d�a trên m�t trình t� r�t cá bi�t.
  35. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 113 Hình 4.8. Cây ph� h� c�a Oc: CYP72, 1c ��n 16c:16 CYP450 không ��ng nh�t t� C. roseus .1,2,3 4: CYP 73 t� 4 loài; 5: flavonoid 3’ 5’ hydroxylase; 6: CYP 71; 7,8,9: nh�ng Cyt-P450 không xác ��nh Theo D. Nelson ( P450.html), ��n nay ngư�i ta �ã ghi nh�n �ư�c ít nh�t 249 gen CYP ho�t ��ng � cây mù t�c Arabidopsis thaliana chi�m kho�ng 1% genome c�a nó. Arabidopsis Cyt-P450 xúc tác bư�c ��u tiên c�a s� sinh t�ng h�p Indol-3-acetic acid ph� thu�c tryptophan (Annak et al.2000). Th�c v�t t�ng h�p m�t lư�ng l�n các ch�t chuy�n hóa th� c�p t� các axit amin và nucleotide. Nhi�u ch�t trong s� �ó có vai trò quan tr�ng trong s� phát tri�n c�a th�c v�t và như là nh�ng ch�t �� kháng ch�ng l�i các y�u t� gây b�nh. Ch�t chuy�n hóa th� c�p là d�n xu�t c�a tryptophane bao g�m carnalexin, indole glucosinolates và indole -3-acetic acid (IAA). Tuy nhiên nh�ng bư�c �� t�ng h�p ra chúng �i t� tryptophan ho�c nh�ng ti�n ch�t c�a nó v�n còn chưa rõ. Ngư�i ta �ã xác ��nh �ư�c 2 lo�i Arabidopsis Cyt-P450 (CYP 79B2 và CYP 79B3) có th� chuy�n hóa tryptophan thành indole-3- acetaldoxine (IAO x), m�t ti�n ch�t c�a IAA và indole glucosinolates. Arabidopsis CYP 85A2 là m�t Cyt-P-450 tham gia chuy�n hóa trong s� oxy hóa Baeyer-Villiger c�a Castasterone thành Brassinolide trong quá trình sinh t�ng h�p Brassinosteroid (Tae- Wuk Kim et al.2005).S� chuy�n hóa t� castasteron(CS) sang brassinolide(BL), s� oxy hóa ki�u Baeyer-Villiger, là bư�c cu�i
  36. 114 Nguy�n Th� Ng�c Dao cùng và là bư�c h�n ch� t�c �� trong s� sinh t�ng h�p BL � cây xanh. Cyt-P450 85A2 c�a Arabidopsis thaliana �ư�c bi�u hi�n d� th� trong n�m men �ã chuy�n hóa CS thành BL c�ng như là s� oxy hóa v� trí C6 c�a brassinosteroids (BRs). �i�u này kh�ng ��nh r�ng Cyt-P450 85A2 là m�t enzyme hai ch�c n�ng v�a oxy hóa BR C6 v�a ho�t ��ng như BL synthase. Nh�ng nghiên c�u v� sinh lý, hóa sinh và di truy�n phân t� c�a nh�ng dòng bi�u hi�n m�t ch�c n�ng ho�c bi�u hi�n quá m�c Arabidopsis CYP 85A2 �ã ch�ng minh r�ng castasteron ph�i là m�t brassinosteroid ho�t ��ng sinh h�c, ch�t này ki�m soát s� m�c và phát tri�n chung c�a cây Arabidopsis. Nh�ng nghiên c�u gây ��t bi�n c�ng cho th�y r�ng BL (brassinolide) có th� không ph�i lúc nào c�ng c�n thi�t cho s� m�c và l�n lên bình thư�ng nhưng c�ng ch�ng minh r�ng cây Arabidopsis ��t �ư�c s� m�c và phát tri�n t�t hơn khi có m�t BL. Nh�ng nghiên c�u gây ��t bi�n thi�u h�t BR c�a m�t s� tác gi� như Li và cs 1996, Fujioka và cs,1997, Choe và cs 1998, Bishop và cs 1999 �ã ch� ra r�ng thi�u h�t BR gây ra s� gi�m chi�u dài c�a ch�i, gi�m �� phì nhiêu, ch�m già, làm bi�n ��i s� v�n chuy�n các mao m�ch và s� phát sinh quang hình thái. Ngư�i ta �ã xác d�nh �ư�c nh�ng gen bi�u th� cho s� sinh t�ng h�p BR. CYP 85A1, CYP 85A2, CYP90A1, CYP90B1 �ư�c tìm th�y trong Arabidopsis. CYP 90D2 và CYP92A6 �ư�c xác ��nh có m�t trong lúa g�o và ��u m�t cách tương �ng. Ngư�i ta c�ng ch�ng minh �ư�c r�ng m�t Arabidopsis Cyt- P450, CYP85A2, m�t BR-C-6 oxidase, c�ng có kh� n�ng ho�t ��ng như m�t BL synthase trong s� chuy�n hóa CS thành BL. CYP 85A1 và CYP85 A2 có ho�t tính ��c hi�u cơ ch�t khác nhau. Arabidopsis CYPP450 cà chua ch�a 2 lo�i CYP 85 (CYP85A1 và CYP85A2) tương t� nhau, chúng chuy�n hóa 6- deoxo CS thành CS,6-deoxoTY thành TY,6-deoxo 3DHT thành 3- DHT và 6-deoxoTE thành TE. CYP85A1 và 85A2 �ư�c bi�u hi�n d� th� trong n�m men c�ng xúc tác ph�n �ng oxy hóa C-6 c�a BRs và cho th�y r�ng c� 2 lo�i CYP 85A1 và A2 ��u có th� ho�t ��ng như BR C-6 oxydase. T�i sao Arabidopsis l�i có 2 b� gen mã hóa nh�ng enzyme có cùng ch�c n�ng thì cho ��n nay ngư�i ta v�n chưa gi�i thích �ư�c. G�n �ây ngư�i ta �ã ch�ng minh �ư�c r�ng CS �ư�c sinh t�ng h�p t� cholesterol (CHR) qua các C27-BR, nh�ng ch�t này có cùng
  37. Chng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 115 khung cacbon như là 28-norcastasterone (28-nor CS) trong cây cà chua non. Hơn n�a ngư�i ta còn ch�ng minh �ư�c r�ng 28-nor CS có th� �ư�c chuy�n hóa thành CS b�i m�t lo�i enzyme xúc tác là sterolmethyltransferase ph� thu�c S-adenosyl-L-Methionine trong cây cà chua. Trong Arabidopsis s� chuy�n hóa t� CHR thành cholestanol �ã �ư�c ch�ng minh (Nakajima và cs. 2002). Ngư�i ta c�ng xác ��nh �ư�c r�ng s� chuy�n hóa t� 28-nor CS thành CS c�ng x�y ra � Aradopsis. �i�u này g�i ý r�ng con �ư�ng sinh t�ng h�p C27-BR t� CHR �� t�o ra CS c�ng di�n ra trong th�c v�t. Các k�t qu� nghiên c�u ch� ra r�ng CYP85A1 và CYP85A2 có ái l�c khác nhau v�i các cơ ch�t C27-BRs và C28-BRs, m�c dù chúng cùng có kh� n�ng ho�t ��ng như BR C-6 oxidase. (Tae-Wuk Kim et al. 2005).
  38. 117 Chng V NH NG GEN Cyt-P450 VÀ S BIU HIN CA CHÚNG 5.1. C"u trúc c'a gen Cyt-P450 Gia �ình gen Cyt-P450 bao g�m m�t s� l��ng l�n các thành viên phân b� r�ng rãi trong t� nhiên. Cho ��n nay �ã có hơn 270 gia �ình gen CYP (Cyt-P450) khác nhau v�i 18 gia �ình gen ���c ghi nh�n � ��ng v�t có vú (Nelson, 2006). � ng��i, có 57 gen CYP phân b� trong 18 gia �ình và 42 d��i gia �ình. M�t genom ��ng v�t có vú ch�a nh�ng gen Cyt-P450 �a d�ng và nhi�u nhánh. S� l��ng các gen Cyt-P450 � genom ��ng v�t có vú ch�a ���c xác ��nh m�t cách chính xác, nh�ng nh�ng gì �ã bi�t v� các gene mRNAs, protein và ho�t tính enzym g�i ý r�ng m�i m�t genom �ơn b�i c�a ��ng v�t linh tr��ng hay ��ng v�t g�m nh�m có l� ��u ch�a 50-100 gen Cyt-P450. Thành t�u l�n lao trong k� thu�t sinh h�c phân t� nh�ng n�m g�n �ây bao g�m vi�c tách dòng gen, ��c trình t�, và bi�u hi�n gen trong nh�ng t� bào d� th� c�ng ch�a làm rõ h�t ���c m�t s� các ��c �i�m quan tr�ng và cơ b�n c�a nhi�u thành viên trong gia �ình �a gen này. C�u trúc exon-intron c�a g�n 50 gen ��ng v�t có vú �ã ���c làm rõ. Thông tin này cung c�p cơ s� h�p lý �� x�p lo�i gia �ình gen Cyt-P450. Chúng ta c�ng �ã có nh�ng hi�u bi�t v� các gen Cyt-P450 trong các cơ th� b�c th�p nh� vi khu�n và n�m. Trình t� cDNA t� 6 lo�i n�m và 7 gia �ình gen vi khu�n �ã ���c công b� m�i �ây. Phân tích so sánh trình t� cho th�y có s� t�ơng t� l�n gi�a các gen CYP � ng��i và vi khu�n g�i ý v� m�t t� tiên chung c�a ��i gia �ình CYP vào kho�ng 3 t� n�m tr��c �ây.
  39. 118 Nguy�n Th� Ng�c Dao 5.1.1. Gia ình và di gia ình gen Cyt-P450 (CYP) Các gen Cyt-P450 ���c x�p lo�i thành các gia �ình và d��i gia �ình theo s� gi�ng nhau trong trình t� các axit amin do chúng mã hoá và m�t danh pháp có tính h� th�ng d�a trên s� phân lo�i này �ã ���c ��a ra. Nói chung, các thành viên trong m�t gia �ình v� cơ b�n có cùng m�t c�u trúc gen và trình t� axit amin do chúng mã hoá khác nhau ít hơn 40%. Nh�ng CYP có trình t� gi�ng nhau ≥ 40%. ���c ��a vào m�t gia �ình, ký hi�u b�ng m�t s� � R�p, n�u gi�ng nhau ≥55% là thành viên c�a m�t d��i gia �ình, ký hi�u b�ng m�t ch� cái, ví d� CYP 7A và CYP 7B. N�u thêm 1 thành viên m�i vào CYP 7A thì s� ���c g�i là CYP 7A2. B�t c� m�t c�p gen nào trong m�t du�i gia �ình c�ng mã hóa nh�ng axit amin nh�t ��nh v�i s� t�ơng ��ng l�n hơn 55%, các v� trí mã hóa t�ơng �ng và các gen c�a cùng m�t loài ���c liên k�t ch�t ch� trong m�t nhi�m s�c th� (chromosome). Tuy nhiên, c�ng có m�t s� ngo�i l� ��i v�i quy t�c trên. Nebert và cs. �ã có m�t �� xu�t v� cách x�p lo�i ��y �� và danh pháp cho các gen P450. (xem ph�n Ph� tr�ơng). 5.1.2. Các c m gen "ng v#t có vú Nh�ng nghiên c�u nh�m xác ��nh v� trí � NST c�a các gen ��ng v�t có vú �ã ���c t�p trung vào genom c�a ng��i và chu�t nh�t. Trong kho�ng 20 d��i gia �ình Cyt-P450 ��ng v�t có vú, 16 gen �ã ���c xác ��nh � nh�ng NST ��c hi�u � ng��i ho�c chu�t (B�ng 5.1). Nh� � b�ng 5.1, các gen CYP �ã phân tán qua nhi�u NST khác nhau, �ôi khi t�o thành nh�ng búi gen. Cho t�i lúc này các gen ng��i và chu�t �ã ���c b�n �� hóa. Búi th� nh�t ��nh v� trên nhánh dài c�a NST 19 � ng��i, NST 7 � chu�t nh�t và NST 1 � chu�t c�ng và bao g�m kho�ng 10 trình t� gen ho�c t�ơng t� gen c�a CYP2A, CYP2B và CYP2F (d��i gia �ình). Simmon và Kasper (theo Osamu Gotoh) tìm th�y s� liên k�t ch�t ch� gi�a nh�ng búi gen này và locus Coh (Coumarin hydroxylase) c�a chu�t nh�t. Sau �ó, Negishi và cs. �ã kh�ng ��nh r�ng gen Coh th�c ra ���c mã hóa b�i CYP2A5. Ho�t tính th�y phân coumarin v� trí s� 7 � ng��i c�ng ���c mã hóa b�i 1 gen CYP2A. Búi gen CYP21A � ng��i ho�c chu�t nh�t bao g�m 1 gen th�t và 1 gi� gen c�a nó. Nh�ng gen (và gi� gen) này ���c s�p x�p m�t cách ng�u nhiên trong h�n h�p phù h�p t� ch�c c�a HLA trên NST 6P � ng��i và NST 17 c�a chu�t nh�t.
  40. Chng V. Nh�ng gen Cyt-P450 và s� bi�u hi�n c�a chúng 119 B ng 5.1. V� trí trên NST c�a các gen Cyt-P450 � ��ng v�t có vú (theo Osamu Gotoh) Loài Gen S� NST Phương thành viên +1 pháp+2 Ngư�i CYP1A1 1 15q22-q24 SH Ngư�i CYP1A2 1 15 SH Ngư�i CYP 2A 19q13.1-13.2 g�n gpi IS Ngư�i CYP 2B ~4 19q13.1 – 13.2 SH, CL Ngư�i CYP 2C >7 10q24.1-24.3 SH Ngư�i CYP 2D ~3 22q11.2-qter LA Ngư�i CYP 2E 1 10 SH Ngư�i CYP 2F >2 19q13.1 13.2 SH, LA Ngư�i CYP 3A ~5 7q21.3-q22.1 SH Ngư�i CYP 4B >1 1q12-p34 SH Ngư�i CYP 11A 1 15q23-24 SH, IS Ngư�i CYP 11B ~2 8q21-22 SH, IS Ngư�i CYP 17A ~2 10 SH Ngư�i CYP 19 ~1 15q21.1-21.3 SH, IS Ngư�i CYP 21 2 6q21.3 trong H2A LA Ngư�i CYP 27 1 2q33-qter SH Chu�t nh�t CYP1a2 1 9 c�nh Mpi-1 SH, RI Chu�t nh�t CYP2a >6 7 c�nh Col1, Gpi-1 SH, RI, BC Chu�t nh�t CYP2c >7 19 c�nh Gol-1 SH, IS Chu�t nh�t CYP2d >5 1517 cm 55 kDa SH, RI Chu�t nh�t CYP2e 1 17Tyr-1 9 1 g�n P BC Ghi chú: 1) S� các thành viên trong m�i gia �ình ho�c d��i gia �ình. Không phân bi�t các gen và gi� gen. 2) Các ph�ơng pháp: BC: backcross; CL: cloning; LA: linkage analysis; IS: Lai in situ; RI: recombinant inbred-tái t� h�p t� nhiên; SH: somatic cell hybrid-lai t� bào Soma.
  41. 120 Nguy�n Th� Ng�c Dao CYP21A mã hóa cho enzyme 21-hydroxylase. B�nh c��ng th��ng th�n b�m sinh do thi�u h�t gen này, là m�t trong nh�ng b�nh di truy�n th��ng g�p nh�t. Gen h�c phân t� c�a b�nh này �ã ���c nghiên c�u r�t tích c�c. Locus CYP2D là búi gen khác c�ng ���c nghiên c�u k� trong m�i liên quan v�i s� �a d�ng di truy�n trong chuy�n hóa thu�c. 5- 10% ng��i Caucasian là không có kh� n�ng chuy�n hóa debrisoquin, spartein, bufulralol và nh�ng thu�c khác. Tính tr�ng NST l�n này �i kèm v�i nh�ng s� thi�u h�t trong 1 gen CYP2D. M�t gen th�t và 2 gi� gen �ã ���c tìm th�y trong bó gen CYP2D ng��i � NST 22. 5 gen CYP2D ho�t ��ng ���c s�p x�p m�t cách ng�u nhiên trong genom chu�t c�ng, và m�t trong chúng là gen c�a enzyme debrisoquine hydroxylase. Chu�t nh�t c�ng có ít nh�t 5 gen cyp2d trên NST 15. M�t gen mã hóa cho enzyme th�y phân 16 - steroid, nh�ng ng��i ta không bi�t li�u có gen mã hóa cho enzym th�y phân debrisoquin hay không. Nh�ng nghiên c�u di truy�n phân t� m�i �ây v�n ch�a làm rõ ���c cơ s� phân t� c�a tính l��ng hình trong s� chuy�n hóa debrisoquine � ng��i và chu�t c�ng. Nh�ng ��t bi�n �a d�ng �ã ���c tìm th�y là nguyên nhân c�a s� thi�u h�t chuy�n hóa này. Kích th��c c�a các exon (bp) Kích th��c c�a các intron (bp) Hình 5.1. Bi�u �� d�ng c�t c�a exon (A) và intron (B) (các kích c� c�a gen Cyt-P450 � ��ng v�t có vú) (A) Bi�u �� d�ng c�t thu ���c t� t�ng s� 65 exon riêng bi�t trong 8 gia �ình gen P-450 ��ng v�t có vú. ���ng g�ch n�i �� ch� t�n suÊt c�a các kích th��c exon ���c mong ®îi t� s� phân b� ng�u nhiên c�a các liên k�t exon-intron theo m�t trình t� mã hóa. (B) bi�u �� d�ng c�t thu ���c t� t�ng s� 112 các intron tiêu bi�u trong nh�ng gen P450 ��ng v�t có vú khác nhau
  42. Chng V. Nh�ng gen Cyt-P450 và s� bi�u hi�n c�a chúng 121 Búi gen cu�i cùng n�m trên NST 15 ng��i và NST s� 9 � chu�t, bên c�nh locus c�a MPI/mpi – I (mannose phosphate isomerase). Búi này ch�a 3 gia �ình gen P450 khác nhau (CYP1A, CYP11A và CYP19). � NST chu�t nh�t, nh�ng gen này liên k�t ch�t ch� trong m�t vùng kho�ng 1 centi Morgan. Gia �ình (d��i gia �ình) P450 này bao g�m 1 ho�c 2 thành viên (B�ng 5.1), không nhi�u nh� � d��i gia �ình CYP2A/2B �ã d�n � trên. M�t gi� thuy�t thú v� là s� s�p x�p các gen có liên quan t�i m�t s� cơ ch� �i�u hòa quan tr�ng, nh� là s� �i�u hòa phát tri�n ���c tìm th�y trong búi gen globin. M�i �ây Kawajj và cs �ã th�y r�ng m�t MspI RFLP � vùng flanking 3’ c�a CYP1A1 � ng��i có th� �i kèm v�i nguy cơ b� ung th� ph�i d�ng carcinomas phát sinh do khói thu�c lá. A B Hình 5.2. Bi�u �� d�ng c�t c�a hàm lư�ng G+C � v� trí codon th� 3 ��i v�i 52 gen Cyt-P450 loài g�m nh�m (A) và 52 gen Cyt-P450 ��ng v�t có vú khác (B). Tr�c tung c�a bi�u �� bi�u th� t�n s� (frequency) Tr�c hoành bi�u th� t� l� ph�n tr�m (%) G+C � v� trí codon th� 3 5.1.3. C(u t*o c, b.n c/a các gen Cyt-P450 0 "ng v#t có vú B�ng 5.1 t�p h�p các gen Cyt-P450 ��ng v�t có vú mà nh�ng gen này �ã ���c bi�t rõ v� c�u trúc cơ b�n. Kích th��c c�a các gen Cyt-P450 ��ng v�t có vú thay ��i trong kho�ng t� kho�ng 3 kb (kilo base) ��i v�i gen steroid 21-hydroxylase (CYP21A) c�a ng��i, chu�t, bò ��n hơn 70 kb ��i v�i gen aromatase ng��i (CYP19A). Vì m�i gen Cyt-P450 mã hóa cho m�t kích th��c th�ng nh�t c�a m�t protein có kho�ng 500 acid amin, s� bi�n ��i trong
  43. 122 Nguy�n Th� Ng�c Dao kích th��c c�a gen Cyt-P450 ���c cho là do vùng không mã hóa, ch� y�u là các intron và ��i v�i m�t s� ít gen là do nh�ng vùng không ���c d�ch mã. T�t c� nh�ng gen Cyt-P450 ��ng v�t có vú ���c tìm th�y là b� tr��t ��n m�t s� vùng b�i các intron xen vào. Gen cholesterol 7–hydroxylase (CYP7A) có s� l��ng nh� các exon (kho�ng 6 exon) trong khi gen -hydroxylase thu� phân v� trí  c�a axit lauric chu�t c�ng (CYP4A1) và gen testosterone 6- hydroxylase chu�t c�ng (CYP3A2) có t�i 13 exon m�i lo�i. Exon dài nh�t mã hóa cho trình t� protein �ã ���c quan sát cho t�i nay là exon 2, exon mã hóa ��u tiên c�a gen CYP1A1 (kho�ng 830bp) trong khi ng�n nh�t là exon 3 CYP4A2 (36bp). �� dài các intron c�a gen Cyt-P450 l�n hơn c�a các exon. Intron 3 c�a CYP2D2 có �� dài 73 bp là intron kích th��c nh� nh�t ���c tìm th�y trong gen P450 cho t�i nay. Cơ ch� tr��t ch�c là không �úng ��i v�i nh�ng exon và intron quá ng�n. Nh� phát hi�n m�i �ây, c�u t�o exon-intron ���c duy trì m�t cách cơ b�n trong m�t gia �ình gen, m�t khác các gen c�a nh�ng gia �ình khác nhau th� hi�n s� không gi�ng nhau trong c�u t�o c�u trúc c�a chúng, lo�i tr� tr��ng h�p cá bi�t c�a c�p gen CYP17 và CYP21. 5.1.4. S2 phân b5 theo hai ph,ng th6c c/a hàm l8ng G + C T�ng c�ng hàm l��ng G+C � genom ��ng v�t có vú là kho�ng 42% và không thay ��i m�t cách �áng k� gi�a các ch� th�. Tuy nhiên, thành ph�n các base trong m�t genom dao ��ng khá l�n. Bernadi và cs th�y r�ng m�i genom ��ng v�t có vú ���c t�o thành b�i nhi�u �o�n v�i s� thu�n nh�t có tính n�i b�, nh�ng hàm l��ng G+C thì �a d�ng ��i v�i nhau. Bernadi g�i nh�ng �o�n dài nh� v�y (l�n hơn 300 kb) c�a DNA v�i s� t�ơng t� v� thành ph�n base là “isochores”. Nh�ng nghiên c�u ti�p theo �ã làm rõ ���c m�t s� liên quan m�t thi�t gi�a c�u trúc isochorer và nh�ng ki�u t�p h�p c�a NST. Nh�ng isochorer nghèo G+C ���c sơ �� hóa m�t cách có tính t�n su�t trên vùng G-band (b�t màu Giemsa ��m), �o�n gen này sao chép mu�n và ch�a m�t ít các gen t�ơng ��i ��c hi�u t� ch�c. M�t khác, nh�ng isochores giàu G+C th��ng g�n v�i R-band (b�t màu nh�t v�i Giemsa), �o�n gen này s� sao chép s�m hơn. Hàm l��ng G+C c�a các gen Cyt-P450 (B�ng 5.2) th� hi�n s� bi�n ��i có th� nh�n th�y ���c. VD: các gen CYP11B và CYP21A có hàm l��ng G+C > 60% trong khi gen CYP2C có hàm l��ng G+C t�ơng ��i
  44. Chng V. Nh�ng gen Cyt-P450 và s� bi�u hi�n c�a chúng 123 th�p vào kho�ng 40%. Tuy nhiên hàm l��ng G+C c�a gen ng��i, th� và bò cao hơn m�t cách ch�c ch�n so v�i nh�ng gen t�ơng �ng � loài g�m nh�m. Hai ki�u s�p x�p ��c tr�ng c�a các gen Cyt-P450 ���c minh h�a t�t nh�t khi chúng ta xem xét nh�ng v� trí codon th� 3 ��i v�i nh�ng loài ��ng v�t có vú: loài g�m nh�m và nh�ng ��ng v�t khác. Ng��i ta th�y r�ng s� s�p x�p các base � v� trí codon th� 3 có s� liên quan và ch�a ��ng nhi�u thông tin hơn là s� s�p x�p các base � toàn b� các gen S� phân b� các thành ph�n c�a v� trí codon th� 3 ��i v�i 52 gen Cyt-P450 � loài g�m nh�m và 52 gen � ��ng v�t có vú khác ���c ch� ra trong hình 5.2A và 5.2B, m�t cách t�ơng �ng. S� phân b� � loài g�m nh�m � trong di�n h�p hơn m�t chút và xê d�ch kho�ng 9% v� phía có hàm l��ng G+C th�p hơn khi so sánh v�i s� phân b� � các loài không ph�i là g�m nh�m. Tuy nhiên, hình d�ng c�a hai ki�u phân b� là t�ơng t� nhau và là hai ki�u rõ r�t (bimodal).Có m�t kho�ng tr�ng rõ � g�n trung tâm c�a m�i ki�u phân b� có giá tr� kho�ng trên 5%. Lo�i gen Cyt-P450 không ph�i loài g�m nh�m có hàm l��ng G+C � codon th� 3 trong kho�ng 50,2% - 56 % và t�ơng t� nh� v�y, không có gen Cyt-P450 ��ng v�t có vú nào khác có m�t hàm l��ng G+C � codon th� 3 trong kho�ng 59,5% - 66,8%. B ng 5.2. Nh�ng c�u trúc cơ b�n c�a các gen CYP � ��ng v�t có vú Các loài Gen Exon Kích thc [G + C%]+2 Ngư�i CYP1A1 7 5984 51.2 Chu�t nh�t CYP1A1 7 6045 48 Chu�t cyp1a1 7 6215 47.8 Chuôt ��ng CYP1A1 7 6393 48.4 Ngư�i CYP1A2 7 7.8k 51.5 Chu�t nh�t CYP1A2 7 6929 48.9 Chu�t cyp1a2 7 6716 48.8 Chu�t ��ng CYP1A2 7 6954 48.8
  45. 124 Nguy�n Th� Ng�c Dao Chuôt nh�t CYP2A1 9 12835 43.4 Chu�t nh�t CYP2A2 9 ~23k 43.1 Chu�t nh�t CYP2A3 9 8067 47.8 Chu�t cyp2a4 9 ~8k 47.9 Chu�t cyp2a5 9 ~8k 48 Chu�t nh�t CYP2B1 9 ~23k 49.4 Chu�t nh�t CYP2B2 9 ~14k 50 Th� CYP2C2 9 ~20k 38.8 Th� CYP2C3 9 >25k 37.2 Th� CYP2C5 9 >20k 43.1 Chu�t nh�t CYP2C11 9 ~35 42 Chu�t nh�t CYP2C12 9 >35 37.6 Chu�t nh�t CYP2D2 9 4036 51.2 Chu�t nh�t CYP2D3 9 4371 52.3 Chu�t nh�t CYP2D4 9 4678 54.1 Chu�t nh�t CYP2D5 9 4567 53.7 Ngư�i CYP2D6 9 4378 62.7 Chu�t cyp2d9 9 4.8k 51.4 Chu�t cyp2d10 9 4286 51.2 Chu�t cyp2d11 9 4945 50.1 Ngư�i CYP2E1 9 11413 52.3 Chu�t nh�t CYP2E1 9 10374 45 Th� CYP2E1 9 ~10.4k 54.2
  46. Chng V. Nh�ng gen Cyt-P450 và s� bi�u hi�n c�a chúng 125 Th� CYP2E2 9 ~9.0k 55 Chu�t nh�t CYP2G1 9 ~11k 49.5 Chu�t nh�t CYP3A2 13 ~25k Chu�t nh�t CYP4A1 13 14144 43.9 Chu�t nh�t CYP4A2 12 10576 42.7 Ngư�i CYP4B1 11 ~20k Chu�t nh�t CYP7A 6 ~12k 40.4 Ngư�i CYP11A 9 >20k 56.9 Chu�t nh�t CYP11A 9 50.6 Bò CYP11B 9 62.9 Ngư�i CYP11B1 9 ~4.8k 61 Ngư�i CYP11B2 9 ~5.3k 60.1 Bò CYP17A 8 ~6.8k Ngư�i CYP17A 8 6659 52.2 Ngư�i CYP19A 10 >70k 41.1 Bò CYP21A 10 3457 60.8 Ngư�i CYP21A2 10 ~3230 61.8 Chu�t Cyp21a1 10 ~3060 57.9 S� phân b� c�a nh�ng gen CYP khác nhau thành hai ki�u (giàu G+C và nghèo G+C) ph�n l�n là không ng�u nhiên. T�t c� các gen CYP2C, 3A và 7A c�a loài g�m nh�m và không g�m nh�m ���c x�p lo�i vào ki�u nghèo G+C. Ng��c l�i, t�t c� các gen CYP ��ng v�t có vú thu�c CYP1, CYP2 tr� 2C, 4, 11, 17, 21 và 27 là ���c x�p vào ki�u giàu G+C. Ch� có m�t ngo�i l� duy nh�t trong s� phân lo�i các gen CYP c�a loài g�m nh�m hay không g�m nh�m là: Gen CYP 19A (aromatase) � ng��i có 54% G+C � nh�ng v� trí codon th� 3, vì v�y gen này ���c x�p vào ki�u nghèo G+C (hình 2B) trong
  47. 126 Nguy�n Th� Ng�c Dao khi �ó gen CYP19A c�a chu�t (64% G+C � v� trí codon th� 3) ���c x�p vào ki�u giàu G+C ( H5.2A). CYP1A2 (90.9%) ���c quan sát m�t cách ��c bi�t � các gen housekeeping. B�i vì nh�ng gen này c�ng nh� nh�ng gen khác �ã ���c bi�u hi�n m�t cách ��c hi�u t� ch�c và �áp �ng v�i ch�t c�m �ng (inducers), m�i liên quan nói chung gi�a các gen ch� th� (housekeeping) và búi gen giàu G+C không áp d�ng ���c cho các gen Cyt-P450. M�t câu h�i ��t ra là li�u nh�ng gen thu�c lo�i giàu ho�c nghèo G+C có ���c b�n �� hóa m�t cách t�ơng �ng trong vùng R-band và G-band hay không. Nh�ng nghiên c�u s� d�ng ph�ơng pháp sơ �� hóa chi ti�t nh� là lai hu�nh quang In situ và b�n �� lai phóng x� trong m�i liên k�t v�i b�n �� NST l�p ra m�t cách cơ h�c và nh�ng clones có th� t� YAC có th� gi�i quy�t ���c câu h�i này trong t�ơng lai g�n. 5.1.5. Các .o CpG và s2 methyl hoá DNA Khái ni-m v0 12o CPG DNA ���c c�u t�o t� 4 base: Adenine (A), Thymine (T), Cytosine (C) và Guanine (G). T� 4 base này s� có 16 t� h�p dinucleotid là Â, AT, AC, AG, TT, TA, TC, TG, CC. CA, CT, CG, GG, GA, GT, GC. Vì v�y xác su�t cho m�i dinucleotid s� là 1/16. Dinucleotid ���c ký hi�u là NPN trong �ó N là base và p là liên k�t phosphodiester gi�a 2 base. CPG có ngh�a là Cytosine phospho guanine. � ng��i, t�n su�t CPG dinucleotid là r�t th�p (kho�ng 1%). Hi�n t��ng liên k�t phosphodiester này ���c quy cho là s� tri�t kh� CG. S� tri�t kh� này là ��c tr�ng c�a t�t c� các genome s� d�ng s� methyl hóa. Hi�n t��ng tri�t kh� CG x�y ra � các Cytosine b� methyl hóa. Hi�n t��ng tri�t kh� CG x�y ra � kh�p genome ng��i tr� nh�ng vùng nh�, dài kho�ng 300-3000 bp, nơi mà t�n su�t CPG th��ng là cao hơn bình th��ng. Nh�ng vùng này ���c g�i là ��o CPG, các ��o này có th� chi�m t�i 1% genome. Lý do mà các ��o này thoát kh�i hi�n t��ng tri�t kh� CG qua quá trình ti�n hóa là do chúng không b� methyl hóa ��c tr�ng và do v�y thoát kh�i s�c ép ��t bi�n. Các ��o CPG ���c quan sát th�y � vùng 5’ c�a các gen bi�u hi�n và trên 60% promoter � ng��i có ch�a các ��o CPG. Nh�ng dinucleotid CpG � trong genom ph�n l�n ��ng v�t có x�ơng s�ng là r�t hi�m và th��ng xu�t hi�n v�i t�n su�t kho�ng 20%. S� hi�m có c�a CpG và s� d� th�a bù vào �ó c�a TpG và
  48. Chng V. Nh�ng gen Cyt-P450 và s� bi�u hi�n c�a chúng 127 CpA c�ng ���c gi�i thích b�i m�t lo�t các cơ ch�: methyl hóa � v� trí 5 c�a C, kh� amin hóa c�a nó và s� s�a ch�a sau �ó. S� phân b� c�a CpG trong m�t genom ��ng v�t có vú không ph�i là ng�u nhiên. Nh�ng �o�n DNA riêng bi�t th��ng dài 1-2 kb, v�i s� l��ng không gi�m c�a CpG ���c phân tán trong genom. Có kho�ng 30.000 ��o CpG nh� v�y trong m�t genome �ơn b�i c�a ��ng v�t có vú. H�u h�t nh�ng ��o CpG ���c g�n v�i gene, m�t ph�n v�i gene housekeeping và c�ng ���c tìm th�y � ��u 5’ các exon và � ��u 3’ c�a m�t s� gene ��c hi�u t� ch�c. Gen CYP1A1 c�a ng��i có m�t ��o CpG ��c bi�t � vùng rìa 5’ c�a gen (flanking 5’) (hình 5.3). S� t�p trung cao CpG � vùng �áp �ng c�a gen CYP1A1 � chu�t c�ng ���c ghi nh�n m�c dù ít ���c chú ý. Vùng 5’ flanking ch�a các y�u t� �i�u hòa �ã ���c bi�t nh� XRE’s và 1 BTE. Không tìm th�y ��o CpG khác � ��u 5’ c�a kho�ng 50 gen Cyt-P450 ��ng v�t có vú khác � trình t� flanking 5’ �ã bi�t. S� t�n t�i c�a ��o CpG � ��u 5’ cùng v�i hàm l��ng cao G+C � nh�ng v� trí codon th� 3 cho m�t hình �nh gi�ng nh� gen ch� th� (housekeeping) ��i v�i gen CYP1A1. Tuy nhiên, không gi�ng h�u h�t các gen ch� th�, v� trí promotor c�a m�t gen CYP1A1 ch�a m�t h�p TATA thay th� cho h�p G/C. Nh�ng ��o CpG n�i b� ���c tìm th�y trong m�t s� gen CYP (hình 5.3). Khi so sánh trình t� c�a nh�ng gen �áp �ng, các gen c�a ng��i th��ng t� ra có nhi�u ki�u khác bi�t v� phân b� CpG hơn là nh�ng trình t� t�ơng �ng � loài g�m nh�m. Nh�n xét này là phù h�p v�i s� khác nhau v� hàm l��ng trung bình G+C � v� trí codon th� 3 (hình 5.2). T�m quan tr�ng sinh h�c c�a các ��o CpG hi�n t�i ch� có tính ch�t suy �oán. Nh�ng nh�ng ��o CpG là ch�c ch�n r�t ít b� methyl hóa trong nh�ng t� bào dòng m�m (phôi). Umeno và cs, Matsunaga và Gonzahlez cho r�ng s� kh� methyl hóa c�a các v� trí C � ��u 5’ và nh�ng vùng mã hoá liên quan t�i s� bi�u hi�n gen �i�u hoà s� phát tri�n c�a các gen CYP 2E1 và CYP 2D chu�t. Vì ��o CpG không có trong các gen CYP2E1 và 2D c�a chu�t, s� demethyl hóa �i�u hoà phát tri�n d��ng nh� x�y ra m�t cách không ph� thu�c vào nh�ng cơ ch� liên quan t�i ��o CpG. V0 s5 methyl hóa 12o CpG Các ��o CpG th��ng không b� methyl hóa DNA do có nhi�u dinucleotid CpG. �i�u này ��c bi�t quan tr�ng ��i v�i các ��o CpG
  49. 128 Nguy�n Th� Ng�c Dao liên quan t�i promoter, do tr�ng thái không có methyl hóa là c�n thi�t �� phiên mã các gene liên quan. Tuy nhiên quy lu�t này có nh�ng ngo�i l� quan tr�ng �ó là tr��ng h�p các gene trên nhi�m s�c th� X b�t ho�t và các gene in. Trong c� hai tr��ng h�p, promoter ch�a các ��o CpG b� methyl hóa � nhi�u v� trí (không ph�i là t�t c�) và s� methyl hóa này liên quan t�i vi�c ki�m soát phiên mã gene. S� methyl hóa ��o CpG vùng promoter làm cho gene b� câm l�ng. S� câm này di truy�n qua phân bào và ���c gi� thi�t là không ��o ng��c ���c tr� khi có ch�t �c ch� methyl hóa. Các tác nhân gây ra methyl hóa ��o CpG (� các gene in và trên nhi�m s�c th� X) ���c cho là các y�u t� ho�t hóa chéo c�m �ng s� methyl hóa c�c b�, b�ng cách cho phép các ��o ti�p xúc v�i DNA- methyltransferase (Mtase). Trên NST X tác nhân là s�n ph�m RNA c�a gene Xist, trong khi tác nhân � các gene in v�n ch�a ���c xác ��nh. Cơ ch� câm l�ng gene do methyl hóa ��o CpG m�i ���c b�t ��u nghiên c�u. Hình 5.3. ��o CpG trong các gen CYP c�a ngư�i ���ng th�ng ��ng th� hi�n s� có m�t c�a m�t c�p dinucleotid CpG ho�c GpC � gen CYP ng��i. T� ch�c gen ���c trình bày d��i m�i c�p dinucleotid trên b�n �� phân b�. M�c �� dày, v�a và m�ng trong các ���ng k� �� ch� exon, exon không mã hóa và intron c�a vùng rìa c�a gen m�t cách t�ơng �ng.
  50. Chng V. Nh�ng gen Cyt-P450 và s� bi�u hi�n c�a chúng 129 S� methyl hóa ��o CpG là m�t quá trình sinh lý, s�p x�p di truy�n bi�u sinh, nh� �ó mà s� thay ��i trong bi�u hi�n gene có th� di truy�n qua các k� phân bào mà không c�n ph�i thay ��i trình t� DNA liên quan. Methyl hóa DNA là 1 bi�n ��i hóa h�c nh� enzyme b� sung 1 g�c CH3 vào các vùng ch�n l�c trên phân t� proteine, DNA và RNA. � ng��i và h�u h�t ��ng v�t có vú, s� methyl hóa DNA là c�i bi�n DNA t� nhiên và ch� x�y ra � base Cytosine (C) ��ng tr��c base Guanine(G). Do v�y, � nh�ng sinh v�t này s� methyl hóa ch� x�y ra � các vùng CpG, và 70-80% các vùng CpG � DNA ng��i ��u b� methyl hóa. S� methyl hóa x�y ra tr��c h�t � nh�ng vùng có m�t �� CpG th�p ho�c nh�ng vùng DNA l�p l�i, nh� các y�u t� Alu. Còn h�u h�t các ��o CpG (m�t �� cao) không b� methyl hóa hoàn toàn. Ch�c n�ng c�a s� methyl hóa ch�a ���c bi�t rõ nh�ng có gi� thuy�t cho r�ng methyl hóa DNA ti�n hóa tr��c tiên là cơ ch� b�o v� ch�ng l�i các trình t� DNA ký sinh xâm nh�p vào genome. Nh�ng nghiên c�u �ang ti�n hành cho th�y có s� liên quan gi�a s� methyl hóa ��o CpG v�i quá trình lão hóa và ung th�. 5.1.6. Nh?ng c(u trúc exon – intron a d*ng N�m 1984 Sogawa và cs �ã hoàn thành vi�c ��c trình t� c�a toàn b� gen CYP1A1 c�a chu�t nh� là gen Cyt-P450 ��u tiên ���c ��c trình t�. H� s�m nh�n th�y r�ng c�u t�o exon–intron c�a CYP1A1 là hoàn toàn khác v�i CYP2B2. Lo�i tr� s� t�ơng t� gi�a nh�ng v� trí intron c�a CYP17 và CYP21, m�i liên k�t exon - intron ��i v�i m�i gia �ình gen Cyt-P450 �ã ���c tái kh�ng ��nh khi m�i �ây nh�ng v� trí intron xác ��nh �ã ���c b�n �� hóa vào trình t� protein. Hình 5.4 ch� ra nh�ng b�n �� v� v� trí g�n intron ho�c nh�ng trình t� tiêu bi�u ���c ch�n t� nh�ng gia �ình Cyt-P450 riêng bi�t. Nh� trên �ã nêu, c�u t�o exon – intron ���c b�o toàn v� cơ b�n trong s� nh�ng gen trong m�t gia �ình, nh�ng c�ng có m�t s� ít ngo�i l� ��i v�i quy lu�t này. CYP c�a chu�t ch�a 1 intron thêm vào � vùng 3’ không d�ch mã, nơi mà không có intron ���c tìm th�y trong nh�ng gen Cyt-P450 khác nh� là CYP4A2 chu�t và CYP4B1 � ng��i. CYP 4B1 � ng��i thi�u intron 5, intron này có m�t trong CYP 4A1 và 4A2. Intron dài b�t th��ng ���c tìm th�y � vùng 5’ không d�ch mã c�a CYP19A � ng��i, nh�ng không có trong gen CYP19A c�a chu�t, v� trí b�t ��u phiên mã có th� là nguyên
  51. 130 Nguy�n Th� Ng�c Dao Hình 5.4. S� ��nh v� c�a các intron trong m�i liên quan v�i trình t� protein Cyt-P450, các intron �ư�c ký hi�u b�ng hình tam giác - Ch� intron n�m gi�a các codon hai bên rìa - Ch� intron n�m gi�a nucleotide th� 1 và th� 2 c�a các codon ti�p theo - Ch� intron n�m gi�a nucleotide th� 2 và th� 3
  52. Chng V. Nh�ng gen Cyt-P450 và s� bi�u hi�n c�a chúng 131 nhân cho s� khác bi�t rõ r�t này. Câu h�i ���c ��t ra là s� c�u t�o gen khác nhau nh� v�y (hình 5.4) ���c di truy�n theo quá trình ti�n hóa c�a Cyt-P450 nh� th� nào. Có hai ki�u ���c d� ki�n: ki�u chèn c�m vào (insertion) và ki�u m�t �o�n (deletion model). Ki�u sau (m�t �o�n) ���c gán cho nh�ng gen Cyt-P450 c� x�a có nhi�u intron, m�t s� trong �ó �ã m�t �i trong quá trình ti�n hóa. Ki�u này d�a trên m�t gi� thi�t v� ái l�c là m�t s� thay ��i c�a gen mã hóa protein nói chung �ã ���c t�o ra b�i s� d�ch chuy�n exon (exon shuffling). D�a trên mô hình này, Kimura và cs. �ã cho r�ng t� tiên chung c�a nh�ng gen Cyt-P450 ngày nay �ã có ít nh�t 35 th� k�. Sogawa và cs thiên v� ki�u chèn g�n hơn, b�i vì các c�u t�o gen khác nhau hoàn toàn c�a CYP1A1 và CYP2B, có v� không gi�ng v�i ���c t�o ra b�i s� m�t ng�u nhiên c�a intron nguyên th�y c� x�a. S� khác nhau này ���c nh�n th�y d� dàng b�ng cách �ánh giá th�ng kê. Và t�ng k�t l�i cho th�y r�ng, gen t� tiên có 14 intron v�n còn l�i trong gen CYP1A1 và 8 intron trong CYP2B2. Th�c t� �ây là m�t tr��ng h�p ��c bi�t c�a s� phân b� ���c bi�t ��n nh� là s� phân b� quá m�c (hypergeometic). S� phân b� này kh�ng ��nh r�ng 3 ho�c 4 intron gi�ng nhau gi�a các gen CYP1 và CYP2 v�i kho�ng > 70%. M�c dù s� l��ng “nh�ng intron chung” có th� thay ��i v�i tiêu chu�n và trình t� b�c m�t c�a protein, nh�ng thay ��i nh� trong s� l��ng này không �nh h��ng ��n k�t qu� chính. B�i v�y, mô hình “m�t” không áp d�ng trong cách tính ��i v�i s� ti�n hóa c�a nh�ng gen Cyt-P450 c�ng nh� là v�i các serin protease, protein liên k�t calcium và nh�ng gia �ình gen mã hóa protein khác. Tuy nhiên, ki�u l�ng g�n �ơn gi�n ch�a th�c s� phù h�p. C�u t�o gen c�a nh�ng gia �ình có liên quan t�ơng ��i ch�t ch�, ví d�: CYP1, 2 và CYP 17, 21, hi�n nhiên là khác nhau nhi�u hơn là mong ��i. ��c �i�m này là chung ��i v�i xu h��ng ���c tìm th�y trong m�t s� gia �ình gen khác là v� trí c�a intron c�m vào có xu h��ng g�n kho�ng gi�a c�a nh�ng exon �ã t�n t�i t� tr��c. Kích th��c c�a nh�ng exon tr� nên kém g�n k�t. B�i vì vi�c c�m 1 intron vào có th� làm kém b�n v�ng nh�ng intron c� g�n �ó. N�u intron m�t �i, còn l�i 1 exon l�n, cái này sau �ó s� là m�c tiêu t�t cho s� c�m vào c�a 1 intron m�i. B�ng cách này s� c�m vào và s� m�t �i intron có th� x�y ra liên ti�p nh� hi�u �ng domino, và các gen CYP17 và CYP21 có th� là 1 m�c tiêu trung gian c�a quá trình này. M�t ít chu trình c�a quá trình này có th� �em m�t s� intron g�n vào
  53. 132 Nguy�n Th� Ng�c Dao g�n v�i intron � xa khác làm gi�i phóng nh�ng gen nh� là CYP4 và CYP7. �ây là ��i t��ng cho nh�ng nghiên c�u v� th�c nghi�m và lý thuy�t trong t�ơng lai �� gi�i quy�t v�n �� còn l�i �ã lâu v� ngu�n g�c c�a các intron. 5.1.7. S2 ghép n5i chEn l2a Nhi�u công b� r�ng mRNA ���c sao chép m�t cách hi�n nhiên t� nh�ng gen Cyt-P450 cho th�y kh� n�ng mã hóa m�t cách bình th��ng. H�u h�t nh�ng mRNA khác th��ng �ã ���c bi�t là phân nhánh gen CYP2 nh� là CYP2B2 chu�t, CYP2B6 ng��i, CYP2C6 chu�t, CYP2C8 ng��i, CYP2D9 chu�t nh�t, CYP2F1 ng��i và CYP2G1 chu�t, nh�ng c�ng có nhi�u phân nhánh t� nh�ng gia �ình khác nh� CYP1A1 th� và CYP19A ng��i. So sánh trình t� mRNA c�a chúng v�i trình t� genom g�i ý r�ng h�u h�t, n�u không ph�i là t�t c�, thì nh�ng mRNA khác th��ng này ���c t�o ra b�i s� ghép n�i ch�n l�a. S� phiên mã ch�n l�a c�a CYP2B2 chu�t mang thêm 8 codon nhi�u hơn và có th� phiên mã cho 1 enzym ho�t ��ng. Tuy nhiên, trong nh�ng tr��ng h�p khác mRNA b�t th��ng ch�a nh�ng codon c�a s� k�t thúc s�m và th��ng � xa vùng liên k�t hem (HR2) c�n thi�t cho ch�c n�ng c�a Cyt-P450. T�m quan tr�ng ch�c n�ng c�a s� ghép n�i này trong s� phiên mã Cyt-P450 ��n nay v�n ch�a ���c bi�t rõ. Có th� là nh�ng mRNA b�t th��ng này là nh�ng m�nh v� ���c t�o ra b�i s� ghép n�i sai. C�ng có quan �i�m khác cho r�ng, s� ghép n�i ch�n l�a có th� �óng m�t vai trò quan tr�ng trong s� �a d�ng hóa trình t� gen Cyt-P450 và là s� �áp �ng �� tái t�o các liên k�t intron gi�a nh�ng gia �ình gen Cyt-P450 khác nhau. 5.1.8. Các gen c/a vi khuHn và n(m m5c Kích th��c c�a nh�ng protein Cyt-P450 ���c d�ch mã suy ra t� trình t� gen, ngo�i tr� P45055A c�a Fusarium oxysporum, ��i v�i gen này trình t� mã hóa �ã nh�n ���c t� m�t cDNA dòng hoá. Ch� có 2 gen Cyt-P450 n�m m�c cho th�y có c�u t�o gen b� chia tách: Saccharomyces sp. CYP56A ch�a 2 intron và Neurospora crassa CYP54A có ít nh�t 2 intron nh�ng vùng mã hóa hoàn toàn không ���c xác ��nh. Không có intron nào t�n t�i trong gen Cyt-P450 vi khu�n nh� là bình th��ng. Nh�ng quan sát