Báo cáo đề tài Protein tái tổ hợp và virus cúm gia cầm (Avian Ifnluenza virus- AIV) - Trần Thị Ngọc Quỳnh

Nội dung text: Báo cáo đề tài Protein tái tổ hợp và virus cúm gia cầm (Avian Ifnluenza virus- AIV) - Trần Thị Ngọc Quỳnh

1. PROTEIN TÁI TỔ HỢP VÀ VIRUS CÚM GIA CẦM (AVIAN IFNLUENZA VIRUS- AIV) Sinh viên thực hiện: Trần Thị Ngọc Quỳnh Giảng viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải
2. Nội dụng ▪ I. Đặc vấn đề ▪ II. Nội dung ▪ III. Kết luận ▪ IV. Tài liệu tham khảo
3. I. Đặt vấn đề ▪ Bệnh cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm do virus gây chết rất cao trên gia cầm ( tỷ lệ chết có thể lên đến 100%) với những biểu hiện về hô hấp, tiêu hóa hay thần kinh. ▪ Được ghi nhận đầu tiên vào năm 1878 tại Ý và được gọi là “dịch tả gà” (fowl plague). ▪ Sau đó ở các nước Áo, Đức, Bỉ và Pháp. Hiện nay bệnh hầu như ở các nước trên thế giới với các subtype khác nhau đã được xác định.
4. ▪ Tại Việt Nam từ tháng 12/2003 đến 12/2005 đã có ba đợt dịch cúm gia cầm xảy ra trên cả nước. Bệnh đã xảy ra ở 57/64 tỉnh thành vào năm 2004 và 35/64 tỉnh thành vào các tháng đầu năm 2005, gây thiệt hại rất lớn cho nền kinh tế của nước ta.
5. II. Tổng quan 1. Căn bệnh: a. Hình thái, cấu trúc: ▪ Virus cúm gia cầm thuộc họ Orthomyxoviridae, chi Influenza virus type A, có dạng đa hình thái, kích thước 80- 120 nm. ▪ Virus có vỏ bọc lipid. ▪ Hai loại gai glycoprotein (dài 10-14 nm, đường kính 4-6 nm): haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). ▪ Bộ gen là RNA sợi đơn, chuỗi âm.
6. ▪ Cấu trúc bộ gen của virus bao gồm tám phân đoạn, mã hóa cho các protein: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS ( Cox và ctv, 2000). ▪ Các phân nhóm (subtype) được xác định dựa trên cấu trúc của các protein bề mặt HA và NA. ▪ Đến nay có tất cả 16 subtype HA và 9 subtype NA được phân lập trên các loại dã cầm và gia cầm khắp nơi trên thế giới qua nhiều giai đoạn khác nhau ( OIE, 2005, Capua và Maragon 2007 ).
7. Haemegglutinin (HA) ▪ Protein bề mặt, có khả năng bám trên các thụ thể tế bào chứa acid sialic, giúp virus nhân lên và gây bệnh. ▪ Khả năng gây ngưng kết hồng cầu. ▪ Kháng nguyên bề mặt, kích thích sinh kháng thể bảo hộ HI có tính đặc hiệu cao và giúp định subtype. ▪ Thường xuyên biến đổi tạo nên tính đa dạng của kháng nguyên.
8. Neuraminidase (NA) ▪ Protein bề mặt, kháng nguyên có tính đặc hiệu cao. ▪ Giúp qui định subtype, thường xuyên biến đổi tạo tính đa dạng kháng nguyên. ▪ Có hoạt tính sialidase, giúp virus phân cắt HA ra khỏi màng, xâm nhập vào bên trong tế bào, phóng thích ra khỏi tế bào sau khi đâm chồi trong quá trình nhân lên của virus.
9. Nucleoprotein (NP) ▪ Protein bên trong có tính đặc hiệu của virus cúm type A giúp phân biệt với virus cúm type B và C. ▪ Nucleoprotein tạo nên khung cấu trúc xoắn bên trong của virus và gắn kết với chuỗi RNA và ba polymerase khác nhau.
10. Protein matrix (M) ▪ Bao gồm M1 và M2. ▪ M1 là protein bên trong, nằm ngay dưới lớp vỏ bọc lipid, gắn kết với những ribonucleoprotein, qui định hình dạng của virus và có tính đặc hiệu cho virus type A. ▪ M2 là protein bề mặt, giữ vai trò là kênh trao đổi ion của virus và khơi mào cho hoạt tính gắn kết HA.
11. Protein không cấu trúc (NS) ▪ Nằm rải rác ngay dưới M1. ▪ Các polymerase: PB1, PB2 (polymerase kiềm), PA (polymerase acid) ▪ Gắn kết với NP và RNA của virus, giúp cho quá trình sao chép của RNA virus (rRNA). ▪ PB1 và PB2 tham gia vào giai đoạn tổng hợp RNA trung gian của virus nhân lên trong tế bào. ▪ PA và NP tham gia quá trình tổng hợp RNA của virus.
12. b. Quá trình tái sản của virus
13. c. Triệu chứng
14. d. Đường lây truyền ▪ Virus bài thải ra ngoài môi trường thông qua chất tiết đường hô hấp, miệng, kết mạc và phân. ▪ Do tiếp xúc trực tiếp giữa thú bệnh và thú khỏe hay gián tiếp qua không khí hay tiếp xúc những vật dụng vấy nhiễm virus. ▪ Các loài dã cầm đóng vai trò chủ yếu truyền lây virus đầu tiên, sau đó do truyền lây cơ học thông qua các vật dụng bị vấy nhiễm hay sự vận chuyển thú bệnh hay do con người.
15. 2. Các phương pháp chẩn đoán a. Chẩn đoán lâm sàng và phân biệt với một số bệnh khác: ▪ Dựa vào triệu chứng, bệnh tích và tính chất dịch tễ để xác định bệnh cúm gia cầm với các bệnh khác. b. Chẩn đoán ở phòng thí nghiệm: ▪ Có khả năng hỗ trợ và kết luận nguyên nhân gây bệnh chính xác.
16. Phát hiện virus ▪ Phát hiện protein hay RNA của virus trực tiếp từ mẫu mô. Miễn dịch huỳnh quang (FA) trên mẫu vết phết kính, ELISA, RT-PCR, real time PCR. ▪ Mẫu được phân lập trên trứng gà có phôi 9-11 ngày tuổi bằng cách tiêm xoang niệu mô, trên tế bào MDCK, Vero hay tế bào sơ cấp như CEF và thận gà. Sau đó thực hiện phản ứng HA, HI, NI, RT-PCR hay real time PCR.
17. Phát hiện kháng thể ▪ Sử dụng các phản ứng huyết thanh học như ELISA, AGID, HI và miễn dịch huỳnh quang.
18. 3. Phòng chống bệnh cúm gia cầm a. Biện pháp an toàn sinh học ▪ Thực hiện các biện pháp vệ sinh thú y định kỳ như sát trùng chuồng trại, trang thiết bị chăn nuôi, kiểm soát phương tiện vận chuyển và người chăn nuôi ra vào khu chăn nuôi. Cách ly theo dõi đàn gia cầm mới nhập, không buôn bán gia cầm. ▪ Thực hiện các chính sách kiểm soát bệnh, giám sát dịch bệnh.
19. a. Phòng bệnh bằng vaccine ▪ Đáp ứng miễn dịch đối với kháng nguyên HA và một phần NA. ▪ Trong thực tế, khả năng bảo hộ của vaccine là nhờ subtype HA trong vaccine. ▪ Vaccine thông thường (vaccine vô hoạt đồng nhất hoàn toàn, vaccine vô hoạt không đồng nhất hoàn toàn. ▪ Các loại vaccine tái tổ hợp.
20. ▪ Các loại vaccine hiện đang được sử dụng tại Việt Nam: ▪ Vaccine vô hoạt H5N1, H5N2Harbin Weike, Trung Quốc. ▪ Vaccine vô hoạt Nobilis Influenza H5N2, Intervert, Hà Lan. ▪ Vaccine vô hoạt Bioflu H5N9 của Merial, Ý. ▪ Chủng virus vaccine NIBRG-14. ▪ Vaccine Trovac AIVH5, Meiral, Pháp. Vaccine sống tái tổ hợp sử dụng gen H5 của virus cúm gia cầm chủng A (turkey/ Ireland/ 1378/ 83H5N8) gắn vào virus đậu.
21. 4. Chủng virus vaccine NIBRG-14 ▪ Chủng virus A/Vietnam/ 1194/ 2004 (H5N1) được phân lập trên bệnh nhân nhiễm cúm gia cầm. ▪ kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetices), một chủng không có độc lực tạo ra nhờ sử dụng hệ thống 12 plasmid.
22. ▪ 2 plasmid mang đoạn gen HA và NA của virus A/ Vietnam/ 1194/ 2004 (H5N1). ▪ 6 plasmid mang sáu đoạn gen còn lại của virus cúm PR8. ▪ 4 plasmid biểu hiện chức năng hỗ trợ của virus PR8. ▪ Chuyển nạp các plasmid này vào tế bào Vero, sau đó được cấy chuyển liên tiếp hai đời trên phôi gà. ▪ Nước trứng thu hoạch ở lần tiêm truyền thứ hai. Trứng này được sử dụng làm chủng vaccine được đặt tên là chủng NIBRG-14.
23. ▪ Trình tự vị trí cắt HA của chủng virus A/ Vietnam/ 1194/ 2004 ▪ CCT CAA AGA GAG AGA AGA AGA AAA AAG AGA GCA TTA ▪ Ser Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg ↑ Gly Leu ▪ Vị trí lặp lại các acid amin kiềm Vị trí cắt HA thành HA1, HA2 ▪ Trình tự vị trí phân cắt HA của chủng virus vaccine NIBRG-14 ▪ CCT CCA CGA GAG loại bỏ ACG CGA GGA TTA ▪ Ser Gln Arg Glu Thr Arg ↑ Gly Leu ▪ Vị trí cắt HA thành HA1, HA2
24. ▪ Loại bỏ 15 nu. mã hóa cho 5 acid amin kiềm tại vị trí phân cắt HA. ▪ Đoạn gene NA được dòng hóa bình thường mà không có sự thay thế. ▪ Sự thay thế các gốc kiềm nhằm hạn chế khả năng hình thành trở lại của các chuỗi acid amin kiềm tại vị trí cắt HA. Những nucleotide gạch cuối là những vị trí có sự thay thế nhân tạo. Quá trình đồng hóa giúp giảm khả năng đảo nghịch của các acid amin.
25. 5. Sản xuất các tiểu đơn vị của virus cúm H9N2 ▪ Biểu hiện trong tế bào côn trùng Sf9 các tiểu phần của virus cúm A H9N2 A/Hong Kong/1073/99 nhờ baculovirus trong môi trường nuôi cấy VLPs. ▪ Các protein hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), và matrix (M1).
26. ▪ Virus cúm A/Hong Kong/1073/99 được cung cấp bởi Dr. K. Subbarao và Dr. N. Cox (Influenza Branch, CDC, Atlanta, GA). ▪ RNA của virus được tách chiết được bằng Trizol LS (Invitrogen, Carlsbad, CA). ▪ RT-PCR một bước với những primer chuyên biệt cho các gene.
27. ▪ Những cặp primer được sử dụng cho việc tổng hợp gene HA, NA, và M1, tương ứng: ▪ 5’-AGGATCCATGGAAACAATATCACTAATAAC-3’ & 5’-AGGTACCTTATATACAAATGTTGCATCTGC-3 ▪ 5’-AGAATTCATGAATCCAAATCAAAAGATAATA-3’ & 5’-CTTATATAGACATGAAATTGATATTC-3’ ▪ 5’ -AGAATTCATGAGTCTTCTAACCGAGGTCG-3’ & 5’ -AGGTACCTCACTTGAATCTCTGCATTTGC-3
28. ▪ Gene HA được tạo dòng như một đoạn DNA BamHI-KpnI (1.7 kb) dưới sự điều khiển của promotor AcMNPV polyhedrin trong vector chuyển bacmid pFastBac1 (Invitrogen) được cắt với 2 enzyme BamHI và KpnI. ▪ Gene NA và M1 được tạo dòng như những đoạn EcoRI-EcoRI DNA (1.4 và 0.8 kb, tương ứng) được cắt bởi EcoRI trong plasmid pFastBac1. ▪ Ba kết quả của những plasmid chuyển baculovirus chứa những gene của virus đã được thiết kế là pHA, pNA, và pM1.
29. ▪ (a) Thể hiện sự biểu hiện chuyên biệt của những protein cúm. ▪ (b) Mô tả sự đồng biểu hiện của các protein cúm. Đã chỉ ra là promoter polyhedrin (Polh), vùng tín hiệu polyadenilation, vùng Tn7, gene kháng gentamicin (Gm), và những gene của virus cúm A/Hong Kong/1073/99 (H9N2).
30. ▪ Tế bào côn trùng Spodoptera frugiperda Sf9 (ATCC CRL-1711). ▪ Nuôi cấy trong môi trường không huyết thanh côn trùng HyQ-SFX (HyClone, Logan, UT) ở 28oC. ▪ Những protein biểu hiện của virus cúm được nuôi trong flask lắc với mật độ 2 × 106 tế bào/ml với multiplicity of infection (MOI) = 0.05. ▪ Sau 72 nuôi cấy, phần nổi trên bề mặt nuôi cấy chứa các protein tái tổ hợp baculovirus được thu hoạch, tách bằng li tâm, và trữ ở 4oC.
31. ▪ Sự biểu hiện protein ▪ Xác định bằng điện di SDS–PAGE sử dụng gel polyacrylamide 4-12% (Invitrogen) và thuốc nhuộm Coomassie . ▪ kỹ thuật lai Western blotting sử dụng huyết thanh kháng thể chuyên biệt (không chỉ cho những protein chuyên biệt). ▪ Xác định bằng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA) sử dụng hỗn hợp tế bào được nhiễm với acetone.
32. III. Kết luận 1. Chủng virus vaccine NIBRG-14 ▪ Có khả năng nhân lên trong xoang niệu mô trứng gà có phôi 10 ngày tuổi và không gây chết phôi trứng. ▪ Không có khả năng nhân lên khi nghiên cứu trên tế bào xơ phôi gà CEF một lớp không bổ sung trypsin. ▪ Không gây chết và biểu hiện bệnh cho gà & vịt khi tiêm tĩnh mạch cánh trong vòng 10 ngày theo dõi. ▪ Có khả năng bảo hộ cho cả đàn gà và vịt 4 tuần tuổi sau khi tiêm 3 tuần.
33. 2. Sản xuất các tiểu đơn vị của virus cúm H9N2 ▪ Các tiểu phần của virus hiện tại là chiến lược tiềm năng cho việc phát triển vaccine cho người chống lại virus cúm A H9N2 và sử dụng trong chẩn đoán bệnh.
34. IV. Tài liệu tham khảo ▪ Nguyễn Ngọc Hải, 2007. Công nghệ sinh học trong thú y. NXB Nông nghiệp. ▪ Phan Xuân Thảo, 2005. Khảo sát đặc điểm dịch tễ bệnh cúm gia cầm trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh và kiểm nghiệm vaccine TROVAC AIV H5 để phòng bệnh. Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp. Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
35. ▪ Nguyễn Văn Dung, 2007. Khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng cúm gia cầm NIBRG-14. Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp. Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. ▪ Trần Xuân Hạnh, 2004. Một vài vấn đề phòng bệnh cúm gia cầm bằng vaccine. Tạp chí KHKT thú y, tập XI (3) 2004, 84-85. ▪ Trương Văn Dung, Nguyễn Viết Không, 2004. Một số hoạt động nghiên cứu khoa học của viện thú y quốc gia về bệnh cúm gia cầm và giải pháp khoa học công nghệ trong thời gian tới. Tạp chí KHKT thú y, tập XI (3), 2004, 62-65.