›
›

Xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 trong điều trị HIV/AIDS

pdf 151 trang ngocly 50
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 trong điều trị HIV/AIDS", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfxet_nghiem_dem_te_bao_t_cd4_trong_dieu_tri_hivaids.pdf

Nội dung text: Xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 trong điều trị HIV/AIDS

  1. BỘ Y TẾ XÉT NGHIỆM ĐẾM TẾ BÀO T-CD4 TRONG ĐIỀU TRỊ HIV/AIDS Hà Nội, tháng 12 năm 2012
  2. BỘ Y TẾ XÉT NGHIỆM ĐẾM TẾ BÀO T-CD4 TRONG ĐIỀU TRỊ HIV/AIDS Tài liệu đào tạo dành cho học viên Hà Nội, tháng 12 năm 2012 1
  3. THAM GIA BIÊN SOẠN TÀI LIỆU 1. Chủ biên - PGS. TS. Nguyễn Thanh Long, Thứ trưởng Bộ Y tế. 2. Phó chủ biên - PGS. TS. Bùi Đức Dương, Phó Cục trưởng Cục Phòng, chống HIV/AIDS, Bộ Y tế. - ThS. Phan Thị Thu Hương, Phó Cục trưởng Cục Phòng, chống HIV/AIDS, Bộ Y tế. 3. Nhóm biên soạn - PGS. TS. Trương Xuân Liên, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh. - TS. Nguyễn Văn Kính, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương. - ThS. Nguyễn Việt Nga, Cục Phòng, chống HIV/AIDS, Bộ Y tế. - TS. Lê Thị Hường, Cục Phòng, chống HIV/AIDS, Bộ Y tế. - TS. Hoàng Đức Mạnh, Cục Phòng, chống HIV/AIDS, Bộ Y tế. - TS. Tạ Việt Hưng, Bệnh viện 103. - TS. Nguyễn Ngọc Lan, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch. - TS. Nguyễn Thị Hoàng Lan, Văn phòng UBPC AIDS TP. Hồ Chí Minh. - ThS. Hoàng Thị Thanh Hà, ViệnVệ sinh dịch tễ Trung ương - ThS. Lê Chí Thanh, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh. 4. Thư ký biên soạn - ThS. Nguyễn Văn Hùng, Cục Phòng, chống HIV/AIDS. Cùng với sự tham gia của các chuyên gia - TS. Lê Xuân Hải, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương - BS. CKI. Trần Tôn, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh. - TS. Bùi Thị Thu Hiền, Văn phòng CDC Việt Nam. - TS. Dương Ngọc Cường, Văn phòng CDC Việt Nam. - ThS. Đỗ Thị Thu Thủy, Quỹ Clinton-Sáng kiến tiếp cận Hệ thống y tế. 2
  4. MỤC LỤC LỜI GIỚI THIỆU 5 HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG TÀI LIỆU 6 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 9 - /AIDS 10 1. Thông tin cơ bản về HIV/AIDS 10 2. Vai trò tế bào T-CD4 trong đáp ứng miễn dịch 12 2.1. Nguồn gốc và quá trình phát triển của tế bào T-CD4 12 2.2. Chức năng tế bào T-CD4 trong đáp ứng miễn dịch 13 2.3. Đáp ứng miễn dịch trong nhiễm HIV/AIDS 16 2.4. Ý nghĩa của xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 trong theo dõi điều trị HIV/AIDS 17 (Flow Cytometer) 22 1. Tổng quản về các kỹ thuật dùng trong xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 22 2. Lịch sử về máy đếm tế bào theo nguyên lý dòng chảy 23 3. Các bộ phận chính và nguyên lý cơ bản của máy đếm tế bào theo nguyên lý dòng chảy 24 3.1. Hệ thống tạo dòng chất lỏng (fluidics system) 24 3.2. Hệ thống quang học 25 3.3. Hệ thống điện tử (electronics system) 26 4. Cơ chế nhuôm kháng nguyên bề mặt tế bào và quá trình thu nhận tín hiệu 27 4.1. Cơ chế nhuộm kháng nguyên bề mặt 27 4.2. Quá trình thu nhận tín hiệu 27 5. Ứng dụng của máy đếm tế bào theo nguyên lý dòng chảy 30 5.1. Ứng dụng 30 5.2. Đếm tế bào lympho T-CD4 kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy 30 5.3. Quy trình kỹ thuật căn bản cho xét nghiệm đếm tế bào lympho T- CD4 bằng kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy 32 6. Giới thiệu một số loại máy đếm tế bào T-CD4 tại Việt Nam 33 Bài 3. QUẢN LÝ MẪU BỆNH PHẨM CHO XÉT NGHIỆM TẾ BÀO T-CD4 36 1. Lấy mẫu bệnh phẩm 36 1.1. Xác định đúng bệnh nhân 36 1.2. Lấy mẫu 37 2. Đóng gói, bảo quản và vận chuyển mẫu 37 2.1. Đóng gói và bảo quản mẫu 37 2.2. Vận chuyển mẫu máu 38 2.3. Tiếp nhận mẫu máu tại phòng xét nghiệm 39 2.4. Lưu giữ mẫu 40 2.5. Hủy bỏ mẫu 40 40 3. Nguyên nhân và giải pháp khắc phục một số lỗi thường gặp 40 3.1. Hiện tượng tan huyết 40 3
  5. 3.2 Hiện tượng cục máu đông hoặc đông một phần 41 Bài 4. TỔNG QUAN VỀ QUẢN LÝ CHẤT LƯỢNG TRONG ĐẾM TẾ BÀO T- CD4 44 1. Các khái niệm 44 2. Yêu cầu về quản lý chất lượng 44 2.1. Tổ chức và quản lý 45 2.2. Các tiêu chuẩn chất lượng 45 2.3. Tài liệu 45 2.4. Giám sát và đánh giá 46 2.5. Tập huấn 46 3. Yêu cầu về kỹ thuật: 46 Bài 5. KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG TRONG XÉT NGHIỆM ĐẾM TẾ BÀO T- CD4 51 1. Các khái niệm 51 1.1. Kiểm soát chất lượng: 51 1.2. Kiểm soát chất lượng nội bộ hay nội kiểm tra (Internal Quality Control-IQC): 51 2. Những yếu tố ảnh hưởng tới xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 51 3. Quy trình kiểm soát chất lượng nội bộ 52 3.1. Vẽ biểu đồ Levey-Jennings 52 3.2. Phân tích mẫu chuẩn máy và mẫu kiểm chứng 53 3.3. Phân tích kết quả 54 3.4. Các nguyên nhân gây ra lỗi 59 4. Đánh giá chất lượng bên ngoài (EQA) hay ngoại kiểm tra 59 4.1. Giới thiệu 59 4.2 Quy trình thực hiện mẫu ngoại kiểm tra (EQA) 60 Bài 6. QUẢN LÝ THÔNG TIN VÀ HỆ THỐNG BIỂU MẪU BÁO CÁO TRONG XÉT NGHIỆM ĐẾM TẾ BÀO T-CD4 63 1. Khái niệm thông tin và tầm quan trọng của thông tin trong xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 63 1.1. Khái niệm 63 1.2. Tầm quan trọng thông tin trong xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 63 2. Các loại thông tin và yêu cầu đối với thông tin trong xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 64 2.1. Các loại thông tin 64 2.2. Những yêu cầu đối với thông tin về xét nghiệm T-CD4 64 2.3 Các giai đoạn thu thập thông tin trong xét nghiệm đếm tế bào T- CD4 64 3. Hệ thống biểu mẫu báo cáo 65 3.1. Sổ xét nghiệm T-CD4 65 3.2. Sổ ghi chép vận chuyển mẫu 66 3.3. Sổ theo dõi lý lịch máy 66 3.4. Báo cáo tình hình xét nghiệm 68 3.5. Phiếu theo dõi nhiệt độ 69 (EQA) 69 4
  6. 4. Chế độ lưu giữ thông tin 69 Bài 7. AN TOÀN SINH HỌC TRONG XÉT NGHIỆM ĐẾM TẾ BÀO T-CD4 72 1. Hướng dẫn an toàn trong quá trình lấy mẫu và vận chuyển 72 1.1. Mục đích 72 1.2. Nguyên tắc an toàn đối với nhân viên lấy máu 72 1.3. Dụng cụ an toàn cho người vận chuyển mẫu 73 2. Bảo đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm 74 2.1. Nguyên tắc chung về an toàn sinh học 74 -CD4 75 3. Sự cố an toàn sinh học 76 3.1. Xử lý sự cố bị vật sắc nhọn đâm vào tay trong khi làm việc với tác nhân gây bệnh: 76 3.2. Xử lý sự cố làm đổ dung dịch chứa tác nhân gây bệnh trong tủ an toàn sinh học 77 3.3. Xử lý sự cố đổ dung dịch chứa tác nhân gây bệnh lên sàn nhà, bàn xét nghiệm hoặc trong quá trình vận chuyển 77 4. An toàn hóa học, lửa, điện, bức xạ và trang thiết bị 78 5. Quản lý mẫu bệnh phẩm 79 6. Xử lý rác thải 79 7. Quy chuẩn kỹ thuật về an toàn sinh học phòng xét nghiệm 79 8. Tổ chức quản lý 79 9. Thực hành tốt trong phòng xét nghiệm. 80 9.1 Yêu cầu về an toàn sinh học 80 9.2 Yêu cầu về kỹ năng thực hành của phòng xét nghiệm 80 10. Xử trí sau phơi nhiễm với HIV 81 10.1 Các dạng phơi nhiễm 81 10.2 Quy trình xử trí sau phơi nhiễm: 81 PHỤ LỤC: QUY TRÌNH KỸ THUẬT ĐỐI VỚI CÁC HỆ THỐNG MÁY 86 I. Quy trình đếm tế bào T-CD4 trên máy FACSCALIBUR 86 II. Quy trình đếm tế bào T-CD4 trên máy CYFLOW SL3 93 III. Quy trình đếm tế bào T-CD4 trên máy FACSCOUNT 105 IV. Quy trình đếm tế bào T-CD4 trên máy PCA-GUAVA 123 V. Quy trình đếm tế bàoT-CD4 trên máy PIMA 129 VI. Quy trình hướng dẫn lấy máu thực hiện xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 trên máy PIMA 139 ĐÁP ÁN 145 TÀI LIỆU THAM KHẢO 148 5
  7. HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG TÀI LIỆU 1. Mục đích của cuốn tài liệu Cuốn tài liệu Xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 trong điều trị HIV/AIDS nhằm mục đích cung cấp cho giảng viên, học viên, cán bộ y tế và những người quan tâm tới hoạt động xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 nâng cao các kiến thức và kỹ năng về xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 trong theo dõi điều trị HIV/AIDS, đảm bảo chất lượng và an toàn sinh học phòng xét nghiệm. Ngoài ra, cuốn tài liệu này sẽ được sử dụng làm căn cứ cho việc đào tạo cấp chứng chỉ hành nghề đối với cán bộ xét nghiệm. 2. Đối tượng sử dụng tài liệu Cuốn tài liệu này được biên soạn chủ yếu dành cho: - Cán bộ phòng xét nghiệm; - Cán bộ quản lý phòng xét nghiệm; - Cán bộ chăm sóc điều trị HIV/AIDS tại các Bệnh viện Đa khoa, Viện và các Bệnh viện Trung ương; - Những người quan tâm tới hoạt động xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 nhằm nâng cao các kiến thức và kỹ năng về xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 trong theo dõi điều trị HIV/AIDS. 3. Nội dung chủ yếu của tài liệu Tài liệu này bao gồm 07 bài, Phụ lục các quy trình thực hiện xét nghiệm trên các dòng máy xét nghiệm đếm tế bào T-CD4, câu hỏi lượng giá và đáp án, tài liệu tham khảo. Trong đó 01 bài giới thiệu về vai trò của tế bào T-CD4 trong đáp ứng miễn dịch, 01 bài giới thiệu về nguyên lý cơ bản của máy đếm tế bào T-CD4, 01 bài giới thiệu về thu thập và quản lý mẫu bệnh phẩm, 02 bài đề cập tới quản lý chất lượng xét nghiệm, 01 bài đề cập tới quản lý thông tin và hệ thống biểu mẫu báo cáo, 01 bài đề cập về an toàn sinh học trong xét nghiệm đếm tế bào T-CD4. 4. Tài liệu tham khảo Phần này tập hợp những tài liệu cơ bản nhất mà nhóm biên soạn đã sử dụng trong quá trình biên soạn và một số văn bản quy phạm pháp luật có liên quan đến xét nghiệm đếm tế bào T-CD4, thu thập và quản lý mẫu bệnh phẩm, an toàn phòng xét nghiệm. 5. Cách sử dụng tài liệu Đây là cuốn tài liệu được sử dụng đào tạo liên tục cho cán bộ y tế tham gia vào hoạt động xét nghiệm đếm tế bào T-CD4. Tuy nhiên, các bác sỹ và những người 7
  8. làm công tác quản lý cũng có thể tham khảo giúp nâng cao kiến thức về xét nghiệm đếm tế bào T-CD4. Với những người quản lý hoạt động xét nghiệm đếm tế bào T-CD4, tài liệu này sẽ được sử dụng như là nguồn tham khảo trong quá trình tham mưu xây dựng các chính sách, văn bản chỉ đạo, kế hoạch của đơn vị về triển khai hoạt động xét nghiệm đếm tế bào T-CD4. Người quản lý cũng có thể sử dụng tài liệu này như một hướng dẫn chuyên môn phục vụ cho công tác theo dõi, giám sát và đánh giá các hoạt động xét nghiệm HIV nói chung và xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 nói riêng triển khai trên địa bàn quản lý. Lưu ý rằng, trong quá trình sử dụng, một số nội dung, kiến thức trong tài liệu này có thể thay dổi do sự tiến bộ về kỹ thuật xét nghiệm, và các quy định có liên quan. Do vậy, người sử dụng tài liệu, đặc biệt là các giảng viên cần chú ý cập nhật thường xuyên. 8
  9. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ADN Acid Desoxyribonucleic AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome - Hội chứng Suy giảm Miễn dịch Mắc phải APC Angtigen Presenting Cell - Tế bào trình diện kháng nguyên ARN Acid Ribonucleic ARV Antiretrovirus – Thuốc kháng retrovirus. BD Becton & Dickinson BYT Bộ Y tế CD Cluster of Differentiation – Cụm biệt hóa EDTA Ethylene Di-amine Tetra Acetate EQA External Quality Assessment – Ngoại kiểm tra HIV Human Immunodeficience Virus – Vi rút gây Suy giảm Miễn dịch ở người HSC Hematopoietic Stem Cell – Tế bào gốc sinh máu IQC Internal Quality Control – Nội kiểm tra LPC Lymphoid Progenitor Cell – Tế bào gốc định hướng dòng Lympho MHC Major Histocompability Complex – Phức hợp hòa hợp mô chủ yếu MPC Myeloid Progenitor Cell – Tế bào gốc định hướng dòng tủy OPC – PAC – HIV/AIDS QASI Quality Assessment and Standardization for Immunological Measure – Đánh giá chất lượng và chuẩn hóa đối với kỹ thuật miễn dịch QC Quality Control – Kiểm soát chất lượng QMS Quality Management System – Hệ thống quản lý chất lượng SD Standard Deviation – Độ lệch chuẩn TCR T Cell Receptor – Thụ thể tế bào T TDTH Delayed Type Hypersensitivity T Cell – Tế bào Lympho T gây quá mẫn muộn 9
  10. BÀI 1. - /AIDS Mục tiêu bài học Sau khi học xong bài này, học viên có thể trình bày được: 1. Nguồn gốc của tế bào T-CD4. 2. Chức năng của tế bào T-CD4 trong đáp ứng miễn dịch. 3. Ý nghĩa của xét nghiệm tế bào T-CD4 trong theo dõi và điều trị HIV/AIDS. Thời gian học tập: 180 phút Nội dung bài học: 1. Thông tin cơ bản về HIV/AIDS Tháng 6 năm 1981, lần đầu tiên loài người biết đến một căn bệnh lạ trên thế giới, đó là Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người (AIDS). Kể từ đó đến nay, nhiễm HIV/AIDS được coi là đại dịch và là thảm họa của nhân loại bởi tốc độ lây truyền rất nhanh và rộng khắp. Hiện nay, chưa có vắc xin để dự phòng lay nhiễm HIV và cũng chưa có thuốc điều trị khỏi AIDS và do vậy tỷ lệ tử vong do AIDS là rất cao. HIV (Human Immunodeficiency Virus) là vi rút gây ra Hội chứng Suy giảm Miễn dịch Mắc phải ở người, làm cho cơ thể suy giảm khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh. AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) là Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người do HIV gây ra, thường được biểu hiện thông qua các nhiễm trùng cơ hội, các ung thư và có thể dẫn đến tử vong. Đây là giai đoạn cuối cùng của nhiễm HIV. Một người khi bị nhiễm HIV sẽ trở thành nguồn lây nhiễm suốt đời cho người khác. Hầu hết những người nhiễm HIV đều không có các dấu hiệu và triệu chứng của bệnh trong thời gian dài và có thể không biết rằng mình đã bị nhiễm bệnh, tuy nhiên họ vẫn có thể làm lây truyền vi rút cho những người khác. HIV được xếp vào phân nhóm Lenti vi rút thuộc họ Retro vi rút. Người ta đã phân lập được hai thể khác nhau về di truyền nhưng có liên quan với nhau là HIV-1 và HIV-2. Về cấu trúc, HIV có dạng hình cầu, đường kính 100-120 nm gồm 3 lớp: - Lớp vỏ ngoài: Là một màng lipid kép, gắn trên màng này là các gai nhú, bản chất là các phân tử glycoprotein, phân tử này có hai phần là gp120 và gp41, các phân tử này có ái tính gắn rất cao với các phân tử CD4. Qua đó, vi rút có thể 10
  11. bám và xâm nhập vào tế bào đích có thụ thể CD4 (lympho T hỗ trợ, bạch cầu đơn nhân, các đại thực bào ). Hình 1. Cấu trúc HIV - Lớp vỏ trong: Gồm 2 lớp protein có trọng lượng phân tử là 17 kilodalton (p17) và 24 kilodalton (p24). - Lớp lõi: Gồm bộ gen có 2 chuỗi ARN gắn enzym phiên mã ngược RT (reverse transcriptase), enzym này sẽ biến đổi mã gien của HIV là ARN thành ADN. Enzym intergrase (men tích hợp) giúp cho ADN của HIV được gắn vào trong ADN của tế bào bị nhiễm. Ngoài ra còn có enzym protease (men thủy phân protein) có tác dụng cắt các polyprotein được mã hóa thành các protein cấu trúc hoặc chức năng, tổng hợp thành một vi rút đầy đủ. Về vòng đời của HIV khi xâm nhậm vào cơ thể người: - Vi rút gắn lên bề mặt tế bào: HIV gắn vào bề mặt tế bào đích nhờ sự liên kết đặc biệt giữa phân tử gp120 với các thụ thể CD4 và các đồng thụ thể khác. Các tế bào đích là những tế bào có các thụ thể CD4 trên bề mặt (tế bào lympho T hỗ trợ, bạch cầu đơn nhân (monocyte), đại thực bào (macrophage), tế bào tua gai (dendritic cell), tế bào thần kinh đệm ). Tuy nhiên, tế bào T-CD4 vẫn là mục tiêu chính bởi tế bào này có rất nhiều thụ thể CD4, hơn hẳn các loại tế bào khác. Mặt khác, tế bào T-CD4 được quan tâm nhiều hơn do nó có vai trò “nhạc trưởng” trong đáp ứng miễn dịch của cơ thể do vậy sự suy giảm T-CD4 thường đồng hành với tình trạng suy giảm miễn dịch và nhiễm trùng cơ hội. 11
  12. - Vi rút xâm nhập tế bào: Sau khi bám vào tế bào đích, phân tử protein gp41 của vi rút cắm vào màng tế bào tạo nên hiện tượng hòa màng. Sau đó, bộ gen và enzym của HIV giải phóng vào trong tế bào. - Vi rút nhân lên trong tế bào: Nhờ men sao chép ngược, ADN chuỗi kép của HIV được tạo thành từ khuôn mẫu ARN của nó. Sau khi được tổng hợp, ADN kép chui vào nhân tế bào đích, tích hợp vào ADN tế bào nhờ men integrase. Nhờ vậy, HIV đã tránh được sự phát hiện của hệ thống bảo vệ (hệ thống miễn dịch) của cơ thể cũng như tránh được tác dụng trực tiếp của thuốc. Hình 2: Vòng đời của vi rút Khi vi rút xâm nhập tế bào, có hai khả năng xảy ra: - Vi rút “ngủ ” trong tế bào nhiễm, đây là giai đoạn không triệu chứng. Các tế bào T-CD4 bị nhiễm vi rút vẫn có thể lây cho người khác. Vi rút gây nhiễm các hạch bạch huyết và các đại thực bào. - Khi vi rút kết hợp được với tế bào T-CD4, nó gắn ADN của nó vào ADN của tế bào. Vì vậy, khi T-CD4 hoạt hóa, nó vô tình trở thành một nhà máy sản xuất HIV. Các vi rút mới được tạo ra sẽ phá vỡ tế bào (đây là cơ chế chính gây giảm tế bào lympho T-CD4 ở người nhiễm HIV), đồng thời khi ra khỏi tế bào sẽ tiếp tục gây nhiễm các tế bào lành khác. 2. Vai trò tế bào T-CD4 trong đáp ứng miễn dịch 2.1. Nguồn gốc và quá trình phát triển của tế bào T-CD4 Tế bào gốc sinh máu (HSC - Hematopoietic Stem Cell) trong tủy xương sinh ra tế bào gốc định hướng dòng lympho (LPC - Lymphocytic Progenitor Cell) và dòng tủy (MPC - Myeloid Progenitor Cell). Từ tế bào gốc định hướng dòng 12
  13. lympho chúng lại phân chia thành hai nhóm chính: tế bào B (B progenitor - pro B) và T (T progenitor - pro T). Tế bào B progenitor và T progenitor tiếp tục biệt hóa thành các tế bào lympho trưởng thành (lympho B, tương bào, lympho T-CD4, lympho T-CD8) để thực hiện các chức năng sống riêng biệt. Hình 3. Nguồn gốc tế bào T-CD4 và T-CD8 Khi qua tuyến ức, lympho T bị giữ lại nhờ sức hoá ứng động rất lớn của chất thymotaxin do chính tuyến ức tiết ra. Thoạt đầu nó “định cư” ở vùng vỏ tuyến ức, được sinh sản, biệt hoá và trưởng thành tại đây sau đó di cư vào vùng tuỷ tuyến ức, tiếp tục chín và tung ra máu để “định cư” lần 2 ở các cơ quan bạch huyết (hạch, lách, niêm mạc ). Trong quá trình phát triển, các tế bào lympho T có nhiều sự thay đổi về dấu ấn màng và thụ thể bề mặt, tạo ra hai nhóm tế bào T: αβ-T và γδ-T. Khi rời tuyến ức, chúng có tới trên 80% là cặp gen αβ-T, các cặp gen γδ-T rất ít (dưới 20%). Sau đó, αβ-T tạo ra hai dưới nhóm T-CD4 và T-CD8 tại tuyến ức T-CD4 và T- CD8 có chức năng khác nhau nhưng liên quan với nhau rất mật thiết, tuy nhiên T- CD4 đóng vai trò quyết định chi phối toàn bộ hoạt động của các tế bào miễn dịch. 2.2. Chức năng tế bào T-CD4 trong đáp ứng miễn dịch Tế bào T-CD4 là một phân nhóm quan trọng nhất của tế bào lympho T. Chức năng chính của nó là nhận biết kháng nguyên lạ và điều hòa hệ thống miễn dịch của cơ thể. 2.2.1. Chức năng nhận biết kháng nguyên Tế bào T-CD4 có vai trò quan trọng bậc nhất trong nhận biết kháng nguyên lạ (kháng nguyên ngoại sinh). Khi các kháng nguyên này xâm nhập vào cơ thể, hầu hết bị đại thực bào bắt giữ, cắt thành những mảnh peptid thẳng và hiện lên bề 13
  14. mặt tế bào nhờ các phân tử MHC lớp II. Phân tử này được gắn kết đặc hiệu với phân tử CD4 trên bề mặt tế bào T-CD4 nên các thụ thể của T-CD4 (TCR) mới có điều kiện nhận diện kháng nguyên (mảnh peptid) do MHC lớp II trình ra bề mặt đại thực bào. Khi có sự nhận diện kháng nguyên ngoại lai thông qua phức hợp TCR-HLA lớp II-peptid lạ sẽ tạo sự khuếch đại tương tác hai chiều giữa đại thực bào và tế bào lympho T-CD4. Đại thực bào tiết ra IL-1 để hoạt hóa T-CD4. T- CD4 đã được hoạt hóa sẽ tiết IFN-γ kích thích ngược lại làm cho đại thực bào trở thành các tế bào trình diện kháng nguyên (APC) tốt hơn. Hình 4. Cơ chế nhận biết kháng nguyên của tế bào T-CD4 Các kháng nguyên nội sinh (bản chất là các peptide bất thường được tổng hợp bởi các tế bào của cơ thể bị nhiễm vi rút hoặc từ các tế bào của cơ thể bị ung thư) được nhận diện bởi tế bào T-CD8 thông qua phân tử MHC lớp I. Nhưng lúc này, T-CD8 chưa có khả năng loại trừ ngay kháng nguyên mới nhận diện mà còn phải chờ sự “giúp đỡ” từ tế bào T-CD4 hoạt hóa thì mới phát huy được khả năng “tiêu diệt” tế bào đích của mình. Tóm lại, khi có kháng nguyên vào cơ thể, tùy theo bản chất kháng nguyên mà có các loại tế bào nhận diện khác nhau như đại thực bào, tế bào T-CD4, T-CD8, lympho B Tuy nhiên, tất cả chỉ dừng lại ở bước nhận diện, chưa thể có đáp ứng miễn dịch xảy ra nếu không có sự tương tác từ tế bào T-CD4 hoạt hóa. 14
  15. 2.2.2. Chức năng điều hòa miễn dịch Đây là giai đoạn diễn ra ngay sau khi nhận biết kháng nguyên. Sự hoạt hóa của tế bào T-CD4 thể hiện ở chỗ, các cytokin IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ mà nó tiết ra tác động lên một loạt các tế bào khác, mà trước hết là lên bản thân T-CD4, rồi T-CD8, lympho B, TDTH (hình 5). Kết quả là các tế bào T-CD4 phát triển mạnh mẽ; các đại thực bào, tế bào lympho B, tế bào T-CD8, tế bào NK được hoạt hóa và đồng loạt trở thành các tế bào thực thi (effector cell). Đại thực bào hoạt hóa sẽ có khả năng thực bào và trình diện kháng nguyên tốt hơn. Tế bào lympho B dưới tác dụng của IL-2, IL-4, IL-5 sẽ hoạt hóa thành các tương bào sinh kháng thể tham gia đáp ứng miễn dịch dịch thể chống lại vi khuẩn xâm nhập. Tế bào T-CD8 được hoạt hóa bởi IL-2 và IFN-γ do T-CD4 tiết ra sẽ có khả năng tiêu diệt tế bào đích, là những tế bào bị nhiễm vi rút hay tế bào ung thư. Hình 5. Vai trò của tế bào T-CD4 trong điều hòa miễn dịch Trong điều kiện sinh lý bình thường, các tế bào T-CD4 sẽ điều khiển và chi phối hoạt động miễn dịch một cách hiệu quả nhất làm cho cơ thể luôn ở trạng thái cân bằng. Tế bào T-CD4 tiết ra các cytokin thích hợp giúp cho sự sinh sản đủ mức của các tế bào thực thi, giúp chúng hoạt hóa vừa đủ để loại trừ kháng nguyên. Sự hoạt hóa của T-CD4 sẽ được kiểm soát (kìm hãm hoặc tăng cường) nhờ chính các sản phẩm và hiệu quả của tế bào thực thi. Ví dụ khi lượng kháng thể đủ cao, lượng TNF đủ lớn sẽ có hiện tượng ức chế ngược kìm hãm sự tăng tiết quá mức. Như vậy, chúng ta thấy rõ một điều là tế bào T-CD4 đóng vai trò trung tâm trong đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Vì một bệnh lý nào đó mà T-CD4 bị thiếu hụt sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng không những chỉ ở đáp ứng miễn dịch tế 15
  16. bào mà còn cả đáp ứng miễn dịch dịch thể, hậu quả làm cho cơ thể không có sức chống đỡ bệnh tật và do đó dễ mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội hay ung thư mà điển hình nhất đó là trong trường hợp nhiễm HIV/AIDS. 2.3. Đáp ứng miễn dịch trong nhiễm HIV/AIDS Do hướng tính đặc hiệu của gp120 HIV đối với thụ thể CD4 và thụ thể CD4 có nhiều trên các tế bào T-CD4, một tế bào đóng vai trò trung tâm của hầu hết các đáp ứng miễn dịch nên nhiễm HIV có ảnh hưởng rất lớn lên hệ thống miễn dịch. HIV làm ly giải các tế bào T-CD4 hoặc bất hoạt chức năng của tế bào này dẫn đến hệ thống miễn dịch của cơ thể suy giảm khả năng nhận diện kháng nguyên lạ (thông qua tương tác giữa T-CD4 với MHC lớp II) hoặc có nhận diện được kháng nguyên lạ nhưng T-CD4 không phát huy được vai trò “nhạc trưởng” hỗ trợ các tế bào có thẩm quyền miễn dịch khác thực thi vai trò bảo vệ hữu hiệu. Sau khi HIV gắn với thụ thể CD4 thì xảy ra hiện tượng hòa màng rồi xâm nhập và phát triển trong tế bào của vật chủ. Khi tế bào T-CD4 hoạt hóa tăng sinh thì đồng thời các HIV mới cũng song song được tạo ra bởi ADN của vi rút được gắn vào ADN của tế bào T-CD4. Các tế bào bị nhiễm HIV sẽ gây nhiễm cho các tế bào lành khác bằng nhiều cách khác nhau. Sau khi bị nhiễm HIV, các vi rút mới tổng hợp được giải phóng ra sẽ đến gắn vào các thụ thể CD4 của các tế bào lành khác rồi xâm nhập và diễn biến như trên. Phân tử gp120 được tổng hợp trong tế bào bị nhiễm HIV di chuyển ra bề mặt và gắn với thụ thể CD4 trên bề mặt tế bào lành gần đó, tạo nên các hợp bào. Hợp bào bị thay đổi tính chất, không còn chức năng của tế bào bình thường và sau đó sẽ bị vỡ. Vì vậy không chỉ những tế bào bị nhiễm HIV mà cả các tế bào lành khác cũng bị ảnh hưởng một cách nghiêm trọng. Đại thực bào, tế bào lympho B, tế bào tua gai cũng bị HIV tấn công và hủy diệt bởi trên nó cũng có các thụ thể CD4. Do đó, phần nào quá trình tương tác và trình diện kháng nguyên, khâu mở đầu của đáp ứng miễn dịch không thực hiện được. Tế bào T-CD4 không được hoạt hoá, không nhận diện được kháng nguyên và vì thế mà không sản xuất được các cytokin để kích thích hoạt hóa các tế bào miễn dịch khác. Hậu quả là các tế bào lympho B được hoạt hóa sinh kháng thể một cách yếu ớt, các tế bào T-CD8 (tế bào miễn dịch có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch chống virus) cũng không được hoạt hóa hoặc hoạt hóa không đầy đủ nên không tiêu diệt được vi rút. Nhìn chung, T-CD4 bị giảm số lượng, giảm chức năng, đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch tế bào cũng vì vậy mà giảm sút, hệ thống miễn dịch suy giảm không có khả năng chống đỡ bệnh tật. Trong nhiễm HIV/AIDS, bệnh nhân chết không phải do HIV mà do vi rút này hủy hoại hệ thống miễn dịch gây suy giảm miễn dịch nên bệnh nhân sẽ chết do nhiễm trùng cơ hội và ung thư. Tóm lại, trong số các tế bào có thụ thể CD4, sự biến động T-CD4 có liên quan mật thiết tới khả năng bảo vệ của hệ thống miễn dịch. Do vậy, việc theo dõi T-CD4 rất có giá trị tiên lượng tình trạng miễn dịch của cơ thể. 16
  17. 2.4. Ý nghĩa của xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 trong theo dõi điều trị HIV/AIDS 2.4.1. Diễn biến bệnh trong nhiễm HIV/AIDS Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), quá trình tiến triển của HIV được chia làm 4 giai đoạn, phụ thuộc vào mức độ suy giảm miễn dịch và các bệnh lý liên quan đến HIV. Nhiễm HIV tiến triển sang AIDS với mức độ và thời gian khác nhau. Trong giai đoạn sơ nhiễm ban đầu, HIV nhân lên một cách nhanh chóng và phá huỷ các tế bào lympho T-CD4, người nhiễm xuất hiện các triệu chứng không điển hình như sốt nhẹ, viêm họng, tiêu chảy Trong khoảng thời gian tương đối ngắn từ 4-8 tuần, cơ thể người bệnh hình thành các đáp ứng miễn dịch và giúp ngăn chặn sự nhân lên của vi rút. Cuối giai đoạn này có sự phục hồi nhẹ của số lượng tế bào T-CD4 và sự suy giảm nồng độ vi rút tự do trong máu người nhiễm (hình 5). Tiếp theo, người nhiễm sẽ chuyển sang giai đoạn nhiễm mãn tính không triệu chứng trong khoảng 3-7 năm. Trong giai đoạn này số lượng tế bào T-CD4 giảm dần, hệ miễn dịch mất kiểm soát sự nhân lên của vi rút và khả năng chống nhiễm của hệ miễn dịch cũng suy giảm theo. Giai đoạn cuối, khi nhiễm HIV chuyển sang AIDS, bệnh nhân có số lượng tế bào T-CD4 rất thấp (dưới 200 tế bào/mm3) và hầu như không có khả năng chống đỡ các bệnh nhiễm trùng thông thường, cơ thể xuất hiện các bệnh nhiễm trùng cơ hội, ung thư và chính các bệnh này thường là nguyên nhân gây tử vong cho người bệnh. Hình 6. Diễn biến miễn dịch tương ứng các giai đoạn lâm sàng Vậy thì khi nào bắt đầu điều trị ARV? Hiện nay đã có một thuốc điều trị HIV/AIDS (ARV), tác dụng chủ yếu là ngăn chặn hoặc ức chế sự xâm nhập, sự nhân lên của HIV giúp phục hồi hệ thống miễn dịch (số lượng T-CD4 tăng trở lại). Ngoài ra, cần điều trị các bệnh cơ hội và nâng cao thể trạng. “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị HIV/AIDS” ban hành kèm theo Quyết định số 4139/QĐ-BYT ngày 02/11/2011 và Quyết định số 3003/QĐ- BYT ngày 19/8/2009 của Bộ trưởng Bộ Y tế quy định tiêu chuẩn bắt đầu điều trị ARV cho người bệnh như sau: 17
  18. - Đối với người lớn: Tiêu chuẩn bắt đầu điều trị ARV: + Người nhiễm HIV có số lượng tế bào T-CD4 ≤ 350 tế bào/mm3 không phụ thuộc vào giai đoạn lâm sàng hoặc, + Người nhiễm HIV ở giai đoạn lâm sàng 3, 4 không phụ thuộc số lượng tế bào T-CD4. - Đối với trẻ em: Tiêu chuẩn bắt đầu điều trị bằng ARV ở trẻ em dựa vào tình trạng chẩn đoán nhiễm HIV, lứa tuổi, giai đoạn lâm sàng và giai đoạn miễn dich của trẻ. + Trẻ có chẩn đoán xác định nhiễm HIV: Trẻ dưới 24 tháng tuổi: điều trị ARV ngay, không phụ thuộc vào giai đoạn lâm sàng và số lượng tế bào T-CD4. Trẻ từ 24 tháng tuổi đến 60 tháng tuổi: điều trị ARV khi:  Trẻ có % tế bào T-CD4 ≤ 25% hoặc số lượng tế bào T-CD4 ≤ 750 tế bào/mm3 không phụ thuộc vào tình trạng lâm sàng.  Hoặc trẻ ở giai đoạn lâm sàng 3, 4 không phụ thuộc số lượng tế bào T-CD4. Trẻ từ 60 tháng tuổi trở lên: chỉ định điều trị ARV tương tự như người lớn nhiễm HIV theo quy định tại khoản 2 điều 1 Quyết định số 4139/QĐ-BYT ngày 02/11/2011 của Bộ trưởng Bộ Y tế về sửa đổi, bổ sung một số nội dung trong “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị HIV/AIDS” ban hành kèm theo Quyết định số 3003/QĐ-BYT ngày 19/8/2009 của Bộ trưởng Bộ Y tế. + Trẻ dưới 18 tháng tuổi có kết quả chẩn đoán PCR lần 1 dương tính: tiến hành điều trị ARV cho trẻ đồng thời tiếp tục xét nghiệm PCR lần 2. Dừng điều trị ARV nếu trẻ có kết quả chẩn đoán khẳng định nhiễm HIV âm tính. + Trẻ dưới 18 tháng tuổi chưa có chẩn đoán xác định nhiễm HIV: thực hiện điều trị ARV khi trẻ được chẩn đoán lâm sàng bệnh HIV/AIDS nặng. Thất bại điều trị là gì? - Thất bại lâm sàng: Xuất hiện mới hoặc tái phát các bệnh lý giai đoạn lâm sàng 4 sau khi điều tri ít nhất 6 tháng - Thất bại miễn dịch học: Số lượng T-CD4 giảm xuống mức như trước điều trị, hoặc giảm 50% đỉnh T-CD4 cao nhất đã đạt được, hoặc số lượng T-CD4 vẫn ở mức < 100 tế bào/mm3 sau 1 năm. 18
  19. - Thất bại vi rút học: Có sự nhân lên dai dẳng của vi rút (tải lượng HIV > 5000 bản sao/ml) trong khi bệnh nhân đang được điều trị bằng ARV. 2.4.2. Ý nghĩa của xét nghiệm tế bào T-CD4 Vì tế bào T-CD4 có vai trò đặc biệt quan trọng của hệ thống miễn dịch cơ thể và khi HIV xâm nhập, nó sẽ “hủy diệt” mạnh mẽ tế bào T-CD4 nên để đánh giá được một cách tổng thể hiện trạng của hệ thống miễn dịch cần phải xét nghiệm T-CD4. Ý nghĩa của xét nghiệm tế bào T-CD4 là: - Đánh giá mức độ suy giảm miễn dịch và giai đoạn bệnh trong nhiễm HIV. - Theo dõi diễn tiến bệnh. - Chỉ định điều trị dự phòng Cotrimoxazole. - Chỉ định điều trị thuốc kháng vi rút (ARV). - Theo dõi và đánh giá hiệu quả điều trị. Hiện nay, theo quy định của Bộ Y tế, bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS cần được theo dõi định kỳ bằng xét nghiệm T-CD4 để có chỉ định can thiệp kịp thời. * Chỉ số tham chiếu tế bào T-CD4 (Thái lan): - Người lớn: Xét nghiệm Số lượng (tế bào/mm3) T-CD3 960 - 2430 T-CD4 470 - 1404 T-CD8 360 - 1250 Tỷ lệ T-CD4/T-CD8 0,65 – 2,49 (tỷ lệ CD4/CD8) - Trẻ em Số lượng T-CD4% Tháng tuổi (tế bào/mm3) (CD4%) 1 - 5 2600 – 4000 37 - 48 6 - 11 2800 – 4200 33 - 43 12 - 17 2200 – 3200 31 - 38 ≥ 18 1900 – 3000 28 - 39 Tuy nhiên số lượng T-CD4 ở người bình thường cũng khác nhau tuỳ thuộc lứa tuổi, chủng tộc, địa lý, giới tính và cả thời gian lấy máu xét nghiệm. Ở người 19
  20. lớn, số lượng tuyệt đối của tế bào lympho nói chung và tế bào T-CD4 nói riêng thấp hơn so với trẻ nhỏ và cũng giảm dần theo lứa tuổi. Trong khi đó, tỷ lệ tương đối (T-CD4%) các phân nhóm tế bào lympho và tỷ lệ CD4/CD8 duy trì khá ổn định theo lứa tuổi. Vì thế tại các phòng xét nghiệm thường áp dụng tính số lượng tuyệt đối T-CD4 cho người lớn và tỷ lệ T-CD4% cho trẻ em. Ngoài ra, các yếu tố môi trường và di truyền cũng góp phần vào sự khác biệt giữa các quần thể, chính vì sự khác biệt này nên các phòng xét nghiệm cần thiết lập giới hạn tham chiếu cho T-CD4 và T-CD8 ở cộng đồng khoẻ mạnh tại địa phương. CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ Chọn phương án đúng cho các câu hỏi sau: 1. Nguồn gốc của tế bào T-CD4: a. Tuỷ xương. b. Hạch. c. Tuyến ức. d. Cả 3 trường hợp trên. 2. Tế bào lympho T-CD4 được biệt hoá thành tế bào chín ở đâu? a. Tuỷ xương. b. Hạch. c. Tuyến ức. d. Cả 3 trường hợp trên. 3. Tế bào T-CD4 có các dấu ấn sau trên bề mặt tế bào: a. CD3, CD8. b. CD3, CD4. c. CD4, CD8. 4. Tế bào T-CD4 nhận diện kháng nguyên nhờ phân tử nào? a. MHC lớp I. b. MHC lớp II. c. Cả 2 trường hợp trên. 5. Tế bào T-CD8 nhận diện kháng nguyên nhờ phân tử nào? a. MHC lớp I. b. MHC lớp II. 20
  21. c. Cả 2 trường hợp trên. 6. Xét nghiệm T-CD4 dùng để chẩn đoán nhiễm HIV: a. Đúng b. Sai 7. Ý nghĩa xét nghiệm tế bào T-CD4 : a. Đánh giá mức độ suy giảm miễn dịch và giai đoạn bệnh trong nhiễm HIV. b. Chỉ định điều trị thuốc kháng vi rút. c. Theo dõi hiệu quả điều trị và đánh giá thành công hay thất bại trong điều trị. d. Cả 3 trường hợp trên. 8. Trong phòng xét nghiệm thường sử dụng giá trị nào của xét nghiệm T-CD4 cho quản lý bệnh nhân nhi khoa: a. Tỷ lệ %. b. Số lượng tuyệt đối. c. Cả 2 loại trên. 21
  22. 2. (Flow Cytometer) : Sau khi học xong bài này, học viên có thể trình bày được: 1. Cấu tạo cơ bản của một máy đếm tế bào theo nguyên lý dòng chảy và nguyên lý hoạt động. 2. Giải thích cơ chế nhuộm kháng nguyên bề mặt tế bào và các thông số . 3. Các -CD4 bằng máy đếm tế bào dòng chảy. 4. Giới thiệu một số dòng máy đếm tế bào lympho T-CD4. : 180 Nội dung bài học: 1. Tổng quản về các kỹ thuật dùng trong xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 Các xét nghiệm đếm tế bào lympho T-CD4 ban đầu được thực hiện bằng cách sử dụng các hạt bi từ và đếm trên kính hiển vi. Trong phương pháp này người ta dùng các hạt bi từ gắn kháng thể kháng CD14 để loại bỏ tế bào mono (có CD4) sau đó dùng các hạt bi từ gắn kháng thể anti-CD4 để thu thập tế bào T-CD4 sau đó đếm số lượng các tế bào này trên kính hiển vi. Tuy giá thành xét nghiệm thấp, nhưng phương pháp này có nhiều điểm hạn chế về thời gian và số lượng mẫu được thực hiện. Tiếp đến, xét nghiệm đếm tế bào lympho T-CD4 dựa trên kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry) ngày càng trở nên phổ biến và cho đến nay phương pháp này được xem như là phương pháp chuẩn mực cho xét nghiệm đếm tế bào lympho T-CD4. Phương pháp đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry) là một phương pháp dùng để phân tích đồng thời các đặc điểm lý hóa của từng tế bào đơn với tốc độ phân tích từ vài trăm đến vài ngàn tế bào trong một giây. 22
  23. Hồng cầu Lympho bào: 6-15 μm Phiêu sinh vật Vi khuẩn Bạch cầu hạt trung tính Tế bào mono 10-30 μm Hình 7. Các loại tế bào có thể phân tích bằng máy đếm tế bào dòng chảy Phương pháp đếm tế bào dòng chảy là phương pháp có độ tin cậy cao đồng thời có thể thực hiện được một số lượng lớn xét nghiệm trong ngày. Các dòng máy được sử dụng phổ biến tại Việt Nam như FacsCalibur, Cytomics FC500, Partec Cyflow Coulter, FacsCount. Riêng dòng máy Guava PCA, mặc dù cũng sử dụng nguyên lý đo dòng chảy tế bào nhưng có điểm khác biệt là thay vì sử dụng dung dịch tạo dòng bao thì lại sử dụng ống vi mao có tiết diện nhỏ để tạo dòng tế bào đơn. Ngoài ra, hiện tại ở Việt Nam dòng máy Pima analyzer bắt đầu hiện diện trên thị trường. Đây là dòng máy đếm tế bào lympho T-CD4 có nguyên lý khác với nguyên lý đo dòng chảy tế bào, sử dụng các con chíp vi mạch kết hợp với các kỹ thuật phân tích hình ảnh. Việc triển khai dòng máy đếm tế bào nào tại cơ sở phụ thuộc rất lớn vào các điều kiện như số lượng mẫu, trình độ của kỹ thuật viên thực hiện, điều kiện lấy và vận chuyển mẫu, thờ, điều kiện bảo trì bảo dưỡng thiết bị Cho nên, các đơn vị khi triển khai xét nghiệm đếm tế bào lympho T CD4 cần xem xét điều kiện thực tế của đơn vị mình để áp dụng các hệ thống máy phù hợp. 2. Lịch sử về máy đếm tế bào theo nguyên lý dòng chảy Năm 1969, Lou Herzenberg phát minh ra kỹ thuật phân loại tế bào dựa vào việc sử dụng ánh sáng huỳnh quang (đèn argon) và phát triển thiết bị phân loại tế bào dựa trên kích hoạt huỳnh quang (FACS - Fluorescent Activated Cell Sorter). Đến năm 1990, Becton Dickinson (BD) tung ra thị trường máy FACSCount chuyên dụng cho đếm T-CD4, tại thời điểm đó, máy chưa được cấp giấy chứng nhận bởi FDA nhưng hiện nay đã được FDA công nhận. Năm 1996, BD tiếp tục 23
  24. đưa ra hệ thống FACSCalibur, và sau đó là các dòng máy FACS Canto, FACS Aria hiện đại và đa nhiệm. Năm 1996, Công ty Guava cũng bắt đầu giới thiệu dòng máy đếm tế bào đầu tiên của hãng. Năm 1999, Beckman Coulter công bố về dòng máy EPICS XL và năm 2003 cho ra đời dòng máy Cytomics FC500 và sau đó là các dòng máy Navious, Galious và Mo-Flow với các chức năng ngày càng hiện đại và tính đa nhiệm ngày càng cao. Năm 1998, hãng Partec sản xuất ra máy đếm CyFlow. Và năm 2000, cho ra dòng máy CyFlow SL, và sau này có dòng máy đa nhiệm CyFlow Space. Năm 2002, Guava đưa ra dòng máy PCA. Năm 2004, Guava cho ra đời dòng máy Guava EasyCD4 chuyên dùng cho đếm tế bào T-CD4. 3. Các bộ phận chính và nguyên lý cơ bản của máy đếm tế bào theo nguyên lý dòng chảy 3.1. Hệ thống tạo dòng chất lỏng (fluidics system) Hệ thống tạo dòng chất lỏng là bộ phận căn bản nhất của một máy đếm tế bào dòng chảy. Hệ thống tạo dòng chất lỏng gồm có 2 vùng chất lỏng có áp lực khác nhau. Dòng dịch lỏng bên ngoài (sheath fluid) còn được gọi là dung dịch tạo dòng bao: có tác dụng “nắn chỉnh” dòng dịch lỏng chứa mẫu bên trong (core fluid) còn gọi là dòng lõi thành một dòng hẹp tới mức các tế bào/hạt vật chất trong mẫu chỉ có thể đi qua khe hẹp đó từng cái một từ đó giúp tập trung tế bào/vật thể nhỏ có trong mẫu thành dòng tế bào đơn và vận chuyển dòng tế bào đơn này đi qua hệ thống quang học với tốc độ rất cao, khoảng 1000 tế bào/giây. Điều chỉnh mức độ chênh lệnh áp lực giữa dòng bao và dòng lõi có thể mở rộng hoặc thu hẹp tiết diện dòng lõi, phù hợp với yêu cầu phân tích (ví dụ phân tích tế bào máu thì cần dòng lõi lớn, phân tích ADN thì cần dòng lõi hẹp). Nhờ cơ chế này hệ thống mới có thể phân tích đồng thời nhiều đặc tính trên từng tế bào một cách chính xác, giảm được yếu tố nhiễu. Dịch dùng tạo dòng sheath thường phải đáp ứng 2 yêu cầu: (1) không gây ảnh hưởng tới tế bào (không làm tan tế bào); và (2) không là ảnh hưởng đến độ chiết quang và độ huỳnh quang của hệ thống. Ở một số dòng máy người ta sử dụng ống vi mao thay thế cho dòng bao. 24
  25. Buồng mẫu Dòng lõi (core fluid) Dòng tế bào đơn Hình 8. Hệ thống dòng chất lỏng trong buồng mẫu (flow cell) 3.2. Hệ thống quang học Bao gồm nguồn phát tia sáng (thường là các đèn laser hoặc đèn hồ quang), hệ thống kính lọc và các kênh thu tín hiệu quang học và tính hiệu huỳnh quang (FSC – Forward Scatter Chanel, dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc thẳng; SSC – Side Scatter Chanel, dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc bên, các FL (Fluoressen Light), dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng huỳnh quang từ kênh màu huỳnh quang và số kênh màu huỳnh quang có thể dao động từ 2 đến 18 FL tùy dòng máy; PMT – Photo Multiplier Tube, các ống nhân quang tương ứng với các kênh màu huỳnh quang có vai trò khuếch đại tín hiệu ánh sáng huỳnh quang). Khi một tế bào hay một vật thể đi qua nguồn sáng, ánh sáng của nguồn sáng sẽ tương tác với vật thể sẽ tạo ra các ánh sáng tán xạ (tán xạ góc thẳng và tán xạ góc bên) và nếu tế bào/vật thể đó được nhuộm màu huỳnh quang, dưới kích thích của nguồn sáng, chất màu huỳnh quang đó sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang. Sau đó các tia sáng này sẽ đi qua hệ thống kính lọc (đó là các thấu kính chỉ cho phép các tia sáng có bước sóng nhất định đi xuyên qua). Với hệ thống kính lọc này các tia sáng tán xạ và ánh sáng huỳnh quang sẽ được phân chia và đi đến hệ thống thu nhận tín hiệu một cách chính xác. 25
  26. Ánh sáng từ nguồn laser tương tác với tế bào nhuộm kháng thể gắn huỳnh quang sẽ sinh ra các ánh sáng sau: FSC liên quan tới kích cỡ tế bào, SSC liên quan đến độ phức tạp nhân và bào tương tế bào, các ánh sáng huỳnh quang như FITC, PE, PC5 đặc trưng cho các kháng nguyên tương ứng có trên bề mặt tế bào. Hình 9. Hệ thống quang học 3.3. Hệ thống điện tử (electronics system) Hệ thống điện tử về bản chất là một hệ thống có trong máy, các tín hiệu của ánh sáng tán xạ và tín hiệu huỳnh quang sau khi được khuếch đại ở PMT sẽ được hệ thống điện tử chuyển thành tín hiệu số đo đếm được và được biểu hiện dưới dạng biểu đồ cột, biểu đồ mật độ hay biểu đồ điểm trên máy tính thông qua các phần mềm chuyển đổi chuyên dụng theo máy. Chuyển tín hiệu ánh sáng huỳnh quang thành tín hiệu điện tử và biểu diễn dưới dạng đồ thị (ví dụ trong hình vẽ, tín hiệu quang được chuyển thành tín hiệu điện tử và thể được thể hiện trên màn hình máy tính dưới dạng các điểm- đồ thị Dot Plot. Hình 10. Hiển thị tín hiệu huỳnh quang bằng đồ thị điểm trên máy tính 26
  27. 4. Cơ chế nhuôm kháng nguyên bề mặt tế bào và quá trình thu nhận tín hiệu 4.1. Cơ chế nhuộm kháng nguyên bề mặt Trên bề mặt các tế bào đích có các kháng nguyên đặc trưng cho từng quần thể tế bào. Ví dụ: trong trường hợp tế bào T-CD4 sẽ có các kháng nguyên đặc trưng là CD3 và CD4. Thông qua việc xác định sự hiện diện các kháng nguyên trên bề mặt tế bào này, người ta có thể xác định sự có mặt cũng như số lượng và phần trăm các tế bào đích tương ứng trong quần thể tế bào phân tích. Thông thường, người ta sử dụng các kháng thể đơn dòng có gắn chất phát huỳnh quang có khả năng gắn đặc hiệu với các kháng nguyên bề mặt tế bào. Khi được ủ với mẫu phân tích, các kháng thể đơn dòng có gắn chất phát huỳnh quang sẽ gắn đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng chúng có trên bề mặt tế bào. Kháng thể đơn dòng có gắn chất phát huỳnh quang sẽ gắn vào kháng nguyên tương ứng nằm trên tế bào đích trong quá trình ủ. Hình 11. Nhuộm kháng thể đơn dòng. Các tế bào có kháng bề mặt được gắn đặc hiệu với kháng thể có gắn chất phát huỳnh quang khi đi qua chùm tia laser, chất phát huỳnh quang tiếp xúc và hấp thụ năng lượng cao từ nguồn sáng sẽ bị kích thích và giải phóng ra ánh sáng huỳnh quang để trở về trạng thái năng lượng thấp hơn. Các ánh sáng huỳnh quang sẽ qua hệ thống kính lọc được thu nhận bởi hệ thống thu nhận tín hiệu quang học của máy tại những kênh thu tín hiệu huỳnh quang (FL) xác định. 4.2. Quá trình thu nhận tín hiệu Tế bào/vật thể nhỏ khi di chuyển qua nguồn sáng sẽ tương tác với tia laser và sinh ra các tín hiệu sáng: 27
  28. Kính Kênh thu lọc tín hiệu Thấu kính Đèn laser Kính lọc Kênh thu tín hiệu Hình 12. Hệ thống quang học và hệ thống điện tử thu nhận tín hiệu Ánh sáng tán xạ góc thẳng sẽ được thu nhận qua các kênh FSC (Forward Scatter Chanel). Do được thu nhận thẳng góc (song song) với trục ánh sánh nguồn, ánh sáng tán xạ góc thẳng phản ánh kích thước tế bào/vật thể phân tích (hình minh họa). Ánh sáng tán xạ góc bên sẽ được thu nhận qua kênh SSC (Side Scatter Chanel). Do được thu nhận ở góc bên (90 độ) theo trục ánh sáng nguồn, ánh sáng tán xạ góc bên phản ánh độ phức tạp nhân và bào tương của tế bào. Hình 13. Tán xạ ánh sáng tia laser theo trục thẳng và vuông góc tạo thông số FSC và SSC Nếu tế bào có kích thước càng lớn, chỉ số FSC thu được càng lớn. Tế bào càng nhiều hạt hoặc khoang trong bào tương, nhân càng quận, chia múi thì chỉ số SSC càng cao. Như vậy, trong các thành phần bạch cầu có thể thấy chỉ số SSC của quần thể tế bào lympho là thấp nhất, của quần thể mono cao hơn quần thể lympho, và SSC của quần thể bạch cầu hạt đa nhân sẽ lớn nhất. 28
  29. Quần thể bạch cầu hạt trung tính có kích thước từ độ phức tạp nhân và bào tương đa dạng từ mức trung bình đến cao. Quần thể monocyte có kích thước lớn hơn lympho, độ phúc tạp nhân và bào tương ở mức trung bình thấp. Quần thể lympho có kích thước nhỏ nhất, nhân và bào tương đơn giản nhất Hình 14. Đồ thị 2 chiều SSC và FSC của mẫu máu toàn phần đã ly giải hồng cầu cho thấy các quần thế tế bào bạch cầu được phân tách thành 3 quần thể rõ rệt theo kích thước và mức độ phức tạp của cấu trúc bên trong tế bào. Các tín hiệu màu huỳnh quang (FL-Fluoressent Light) từ phức hợp kháng thể kháng nguyên trên bề mặt tế bào đích cũng được thu nhận theo các kênh màu huỳnh quang và được khuếch đại trong các ống nhân quang PMTs (photomultipliers tube). Khi tia laser chiếu vào các chất phát huỳnh quang này sẽ tạo ra các ánh sáng huỳnh quang và sau đó các tín hiệu sáng này sẽ được thu nhận, chuyển đổi thành tín hiệu điện tử và biểu thị dưới dạng biểu đồ gồm các quần thể dương tính và âm tính với các huỳnh quang tương ứng với các kháng nguyên cần khảo sát. FITC FITC FITC Các tế bào không gắn hoặc FITC FITC gắn rất ít với kháng thể đơn FITC FITC dòng sẽ biểu hiện thành cột FITC âm tính (góc trái) , quần thể FITC FITC tế bào gắn được nhiều kháng thể đơn dòng sẽ được biểu hiện thành cột dương tính (góc phải). bào tế Sốlượng Cường độ huỳnh quang Hình 15. Hiển thị tín hiệu huỳnh quang trên máy tính phân tích. . Thông thường các hãng khác nhau có đôi chút khác biệt trong việc bố trí đèn huỳnh quang và các hệ thống kính lọc, do vậy các kênh màu huỳnh quang 29
  30. cũng có đôi chút khác biệt. Điều này cần chú ý vì sẽ liên quan đến việc lựa chọn phối hợp màu huỳnh quang trong các phân tích đa màu. Tổng hợp các tín hiệu về ánh sáng tán xạ góc thẳng, ánh sáng tán xạ góc bên và các tín hiệu về ánh sáng huỳnh quang tương ứng của một tế bào sẽ giúp chúng ta phân biệt tế bào này với các nhóm tế bào khác trong quần thể. Ngoài ra, việc khoanh vùng (gating) quần thể mong muốn còn giúp thực hiện thống kê hoặc tiếp tục phân tích sâu hơn. 5. Ứng dụng của máy đếm tế bào theo nguyên lý dòng chảy 5.1. Ứng dụng Có rất nhiều ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng và trong nghiên cứu được triển khai trên máy đếm tế bào dòng chảy: - ểu hiện của các thụ thể trên bề mặt tế bào: đếm số lượng tế bào lympho T-CD4, xác định các dòng tế bào gây ung thư, đếm tế bào gốc, đếm tế bào hồng cầu lưới, định danh vi khuẩn, nghiên cứu sự biệt hóa tế bào động, thực vật - Phân tách tế bào: thu nhận các quần thể tế bào lai cho việc sản xuất kháng thể đơn dòng, các quần thể tế bào miễn dịch cho nuôi cấy tương tác invitro, thu nhận tế bào gốc, thu nhận tinh trùng X hoặc Y - ADN/ tế bào: xác định các giai đoạn của chu trình phân bào, khảo sát sự bất thường trong bộ nhiễm sắc thể, xác đinh tổn thương ADN, nghiên cứu tác dụng của thuốc kháng ung thư lên trên tế bào đích - Phát hiện cytokine: định lượng nồng độ cytokine trong dung dịch bằng kỹ thuật dùng hạt bi có gắn kháng thể đơn dòng đặc hiệu với phổ cytokines. Xác định tế bào đích sản xuất các cytokine và bán định lượng thông qua kỹ thuật đo cytokine nội bào - Ngoài ra, kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy còn được ứng dụng trong nghiên cứu biến dưỡng tế bào, hoạt động cá kênh ion, các cơ quan nội bào, pH nội bào, ảnh hưởng của thuốc lên trên sinh lý tế bào 5.2. Đếm tế bào lympho T-CD4 kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy Ứng dụng của nguyên lý tế bào dòng chảy được dùng trong việc xác định số lượng tuyệt đối và phần trăm số lượng tế bào lympho T-CD4 trong máu toàn phần còn được gọi là xét nghiệm đếm tế bào lympho T-CD4. Để xác định được quần thể tế bào lympho T-CD4 trong máu toàn phần, các hãng khác nhau sử dụng các chiến lược tạo cổng, kháng thể và cách thức tính số 30
  31. lượng tuyệt đối tế bào khác nhau để xác định số lượng và phần trăm tế bào lympho T-CD4 có trong máu toàn phần. Số lượng tuyệt đối lympho T-CD4 trong máu toàn phần thường có thể xác định thông qua việc sử dụng các hạt bi với số lượng xác định hoặc đo chính xác thể tích mẫu phân tích chính xác. Với nguyên lý đo thể tích, thông thường nhà sản xuất thiết kế máy có khả năng đo chính xác một lượng thể tích nhất định, sau đó căn cứ trên số tế bào thực tế đếm được, độ pha loãng và thể tích mẫu máu ban đầu cho vào để tính toán số lượng tuyệt đối lympho T-CD4/µl. Số lượng tế bào đếm được x Tổng thể tích mẫu sau T-CD4 tuyệt đối/µl = xử lý Thể tích mẫu được hút bởi máy x Thể tích mẫu máu ban đầu Trong khi đó, với nguyên lý xác định thể tích dựa trên bi chuẩn. Ban đầu nhà sản xuất hay người sử dụng cho một lượng bi chuẩn với số lượng biết trước vào trong ống tuýp xử lý mẫu. Sau khi trộn đều với mẫu máu, hỗn dịch tế bào máu và bi chuẩn xem như đồng nhất. Trong quá trình đếm, máy sẽ đếm được một lượng nhỏ xác định bi chuẩn và tế bào máu. Từ các thông số trên, máy sẽ tính toán ra giá trị số lượng tuyệt đối lympho T-CD4 Số lượng tế bào đếm được x Tổng số bi chuẩn ban T-CD4 tuyệt đối/µl = đầu Số bi chuẩn được đếm bởi máy x Thể tích mẫu máu ban đầu Các máy đếm tế bào lympho T-CD4 chuyên biệt có thể cho cả giá trị phần trăm và giá trị tuyệt đối của tế bào lympho T-CD4 trong máu toàn phần hay còn gọi là hệ thống 1 máy. Tuy nhiên, trong các trường hợp chỉ có thể ghi nhận giá trị phần trăm lympho T-CD4 hoặc số lượng tuyệt đối tế bào lympho T-CD4 trong máu toàn phần, người ta có thể kết hợp với giá trị tổng lympho bào trong máu thu nhận từ máy huyết học để có thể xác định thông số còn lại. Trong trường hợp sử dụng kết hợp máy đếm tế bào lympho T-CD4 và máy huyết học, người ta gọi đó là phương pháp hai máy. Cách tính giá trị phần trăm lympho T-CD4 khi có giá trị số lượng tế bào lympho T-CD4 và tổng lympho bào: 31
  32. 5.3. Quy trình kỹ thuật căn bản cho xét nghiệm đếm tế bào lympho T-CD4 bằng kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy - Khởi động máy: Chuẩn bị dung dịch nạp mẫu (sheath fluid) bao gồm các bước chuẩn bị dung dịch đệm, bật máy và chọn phần mềm tương thích, rửa máy khởi động và đuổi khí trong hệ thống buồng đếm (flow cell). - Chuẩn máy: Thông thường các hãng khác nhau có thể sử dụng các hóa chất tinh khiết để chuẩn máy. Chuẩn máy có thể được sử dụng để cân chỉnh các kênh thu nhận tín hiệu huỳnh quang hoặc có thể đánh giá độ chính xác của pipette (FacsCount, Guava). Nếu máy đạt các tình trạng tốt thì tiến hành xử lý và phân tích mẫu. - Xử lý mẫu: Mẫu máu toàn phần với thể tích xác định theo từng quy trình cụ thể sẽ được ủ với kháng thể đặc hiệu để có thể phát hiện quần thể tế bào lympho T-CD4.Tùy loại sinh phẩm được sử dụng mà kết quả thu nhận có thể có các giá trị về phần trăm lympho T-CD4, số lượng tuyệt đối lympho T-CD4 hoặc cả hai. Trong một quy trình chuẩn, mẫu chứng nội được sử dụng để đánh giá toàn bộ quy trình, đảm bảo tính chính xác của xét nghiệm. Mẫu chuẩn hoặc mẫu chứng phải được đưa vào phân tích đầu tiên và được đánh giá kết quả trước khi phân tích mẫu bệnh nhân. - Ly giải hồng cầu: Hồng cầu trong mẫu nhuộm sẽ được ly giải trước khi đưa vào phân tích bằng các dung dịch ly giải theo bộ sinh phẩm. Sau khi ly giải hồng cầu, mẫu có thể được đưa vào phân tích ngay hoặc ở một số quy trình hai máy thì có thể tiến hành trung hòa và loại bỏ mảnh vỡ tế bào thông qua rửa bằng dung dịch đệm PBS với tỉ lệ 1:1. - Chạy, phân tích mẫu và ghi nhận kết quả: Các quy trình một máy với bộ sinh phẩm theo máy thường được tiến hành phân tích tự động và không cho can thiệp. Tuy nhiên trong các trường hợp mẫu bất thường về hình thái cũng như mức độ nhuộm màu huỳnh quang, kỹ thuật viên cần nắm rõ các vấn đề về kỹ thuật cũng như các chiến lược tạo cổng và chọn lọc quần thể để tránh sai sót có thể xảy ra. Trong một số hệ thống máy, kỹ thuật viên phải tự phân tích và phân vùng quần thể để thu kết quả. - Rửa và tắt máy: Sau quá trình chạy mẫu thì việc rửa máy là hết sức quan trọng, nó giúp loại bỏ những mảng bám phát sinh trong quá trình chạy giúp hạn chế tắc nghẽn hệ thống dung dịch lỏng. Dung dịch rửa máy thường đi kèm theo bộ sinh phẩm thường có bản chất là chất tẩy nhẹ như Javel, sau quá trình rửa bằng chất tẩy thì máy bắt buộc phải rửa lại bằng nước cất để tránh bị ăn mòn. 32
  33. 6. Giới thiệu một số loại máy đếm tế bào T-CD4 tại Việt Nam Hiện có rất nhiều dòng máy hiện diện tại các phòng xét nghiệm đếm tế bào lympho T-CD4. Các máy đếm tế bào chuyên dụng có thể kể đến như: - FacsCalibur - Becton Dickinson (Mỹ). - Cytomics EC500 - Beckman Coulter (Mỹ). - Máy Facs Count - Becton Dickinson (Mỹ). - Máy Cyflow SL3, CyFlow Counter - Partec (Đức). - PCA – Guava – Milipore (Mỹ). - Pima analyser – Alere – (Anh). Bảng tổng hợp so sánh các dòng máy đếm tế bào Lympho T-CD4 Công suất Chứng Các chỉ tiêu có thể Tên máy Kỹ thuật máy theo nhà nhận thu thập sản xuất CD4 tuyệt đối, %, Đếm tế bào BD- 200-300 phân tích biểu hiện dòng chảy, sử FDA FacsCalibur mẫu/ngày thụ thể, phân tích dụng hạt bi ADN CD4 tuyệt đối, %, Đếm tế bào Cytomics 300-350 phân tích biểu hiện dòng chảy sử FDA FC500 mẫu/ngày thụ thể, phân tích dụng hạt bi ADN Đếm tế bào Partec Cyflow dòng chảy, đo CE- 200-250 CD4 tuyệt đối, % Counter thể tích chính IVD mẫu/ngày xác Đếm tế bào 50-60 BD- FacsCount dòng chảy, sử FDA CD4 tuyệt đối, % mẫu/ngày dụng hạt bi Đếm tế bào Guava-PCA dòng chảy, đo CE- 50-60 Auto CD4 tuyệt đối, % thể tích chính IVD mẫu/ngày CD4/CD4% xác Phân tích hình CE- 20-25 Pima Analyser ảnh, đo thể tích CD4 tuyệt đối IVD mẫu/ngày chính xác 33
  34. CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ Lựa chọn đáp áp đúng cho các câu hỏi sau: 1. Các bộ phận chính của máy đếm tế bào dòng chảy: a. Đèn hồ quang, kính lọc và các chất phát huỳnh quang. b. Hệ thống dòng chất lỏng, hệ thống điện tử và máy tính. c. Hệ thống điện tử, hệ thống quang học và dòng chất lỏng. d. Tất cả các câu trên đều sai. 2. Các chỉ tiêu mà một máy đếm tế bào dòng chảy có thể thu nhận được là a. Kích thước tế bào. b. Tính phức tạp nhân và bào tương tế bào (cấu trúc tế bào). c. Tín hiệu huỳnh quang. d. Tất cả các câu trên đều đúng. 3. Tín hiệu huỳnh quang có thể được thu nhận từ: a. Phức hợp đặc hiệu kháng thể gắn huỳnh quang và kháng nguyên. b. Kháng thể gắn huỳnh quang gắn không đặc hiệu trên màng tế bào đích. c. Một số tế bào có khả năng tự phát huỳnh quang. d. Tất cả các câu trên đều đúng. 4. Hệ thống quang học: a. Bao gồm đèn laser và các thấu kính. b. Có vai trò trong việc tạo tín hiệu huỳnh quang. c. Chuyển và khếch đại tín hiệu huỳnh quang. d. Tất cả các câu trên đều đúng. 5. Hệ thống điện tử: a. Tạo và nhân tín hiệu huỳnh quang. b. Khếch đại tín hiệu huỳnh quang và mã hóa. c. Chuyển tín hiệu điện tử thành dạng biểu đồ. d. Câu a và b đúng. e. Câu b và c đúng. 6. Các dòng máy đếm tế bào lympho T-CD4 sử dụng kỹ thuật đo thể tích chính xác: a. Cyflow và FacsCount. b. Guava và FacsCalibur. c. Cyflow và Guava. d. Facscount và FascCalibur. 7. Ứng dụng phổ biến của máy đếm tế bào dòng chảy: 34
  35. a. Xác định kiểu hình miễn dịch, phân tích cấu trúc mô, đo nồng độ cytokine nội bào b. Phân tích thụ quan bề mặt tế bào, khảo sát nồng độ cytokine trong dung dịch c. Xác định kiểu hình miễn dịch, đo cytokine nội bào, phân tách tế bào d. Tất cả các câu trên đều đúng 8. Phương pháp hai máy: a. Chính xác hơn phương pháp một máy b. Sai số cao hơn phương pháp một máy c. Độ tin cậy là tương đương phương pháp một máy d. Tất cả các câu trên đều sai 9. Máy FacsCount có thể đọc được các thông số như sau: a. SSC và hai màu huỳnh quang b. SSC và một màu huỳnh quang c. FSC và hai màu huỳnh quang d. FSC và một màu huỳnh quang 10. Máy Cyflow Counter có thể đọc được các thông số như sau: a. SSC và hai màu huỳnh quang b. SSC và một màu huỳnh quang c. FSC và hai màu huỳnh quang d. FSC và một màu huỳnh quang 35
  36. Bài 3. QUẢN LÝ MẪU BỆNH PHẨM CHO XÉT NGHIỆM TẾ BÀO T-CD4 Mục tiêu bài học: Sau khi học xong bài này, học viên có thể trình bày được: 1. Các yếu tố gây ảnh hưởng trước xét nghiệm 2. Cách lấy mẫu, đóng gói, vận chuyển và bảo quản mẫu thích hợp cho xét nghiệm 3. Các nguyên nhân gây sai sót trước khi tiến hành xét nghiệm và đưa ra các giải pháp khắc phục. Thời gian học tập: 120 phút Nội dung bài học: 1. Lấy mẫu bệnh phẩm 1.1. Xác định đúng bệnh nhân Xác định đúng bệnh nhân ngay trước khi lấy mẫu là một yếu tố thiết yếu. - Xác định đúng bệnh nhân bằng cách “hỏi” và kiểm tra đối chiếu với các thông tin của bệnh nhân được ghi trong phiếu yêu cầu xét nghiệm. Việc này cần được thực hiện trước khi lấy mẫu. - Các thông tin cần xác định bao gồm: M ). : -CD4 như: + Giới tính, chủng tộc, tuổi, căng thẳng tâm lý, chu kỳ kinh nguyệt + Thờ T-CD4 (thấp nhất lúc 12 giờ 30 phút, cao nhất lúc 20 giờ 30 phút). Do vậy, việc lấy máu xét nghiệm nên được thực hiện vào cùng thời điểm trong ngày để tiện cho việc đánh giá (ví dụ: lấy máu xét nghiệm tế bào T-CD4 lần thứ nhất vào buổi sáng thì lần thứ hai cũng phải lấy máu vào buổi sáng). + Mang thai làm loãng máu dẫn đến giảm một lượng ít tế bào T-CD4 nhưng không làm giả ần trăm tế bào T-CD4. + Một số loại thuốc làm giảm số lượng tế bào T-CD4 (ví dụ như corticosteroid, PEG-IFN, IFN và thuốc hóa trị liệu ung thư). + Một số bệnh lý làm tăng số lượng tế bào T-CD4 (ví dụ: cúm, nhiễm HTLV-I ). 36
  37. 1.2. Lấy mẫu - Sử dụng ống lấy mẫu có chất chống đông EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), . Chất chống đông EDTA phù hợp với các xét nghiệm công thức máu và phân tích các thành phần tế bào máu, vì EDTA bảo quản hình thái các tế bào máu tốt nhất. Nếu có điều kiện nên sử dụng chất chống đông K2EDTA hoặc K3EDTA và ống lấy máu có áp xuất âm. - Ghi ngày giờ lấy mẫu, mã số hoặc họ tên, tuổi, giới tính của bệnh nhân trên nhãn của ống đựng máu. - Vị trí lấy máu: Tĩnh mạch cánh tay (phổ biến nhất do lấy được thể tích lớn). - : Bằng bơm kim tiêm (21-23G) hoặc lấy bằng bộ lấy máu có áp suất âm. - – đông theo quy định của nhà sản xuất để đạt được kết quả xét nghiệm chính xác. - - chất chống đông, tránh đông vón, đông dây. - (18-25oC), t 24 giờ. 2. Đóng gói, bảo quản và vận chuyển mẫu 2.1. Đóng gói và bảo quản mẫu Kiểm tra tất cả các ống máu về thể tích máu, chất lượng mẫu máu và các thông tin trên ống. Thực hiện đóng gói theo các bước sau: Bước 1: định các ống mẫu. Đặt nhiệt kế vào giá đựng mẫu. Bước 2: Cho đủ vật thấm hút vào thùng vận chuyển để giảm va chạm hoặc hút thấm khi mẫu bị đổ ra. 37
  38. Bước 3: mẫu nếu nhiệt độ môi trường ngoài > 25oC, tránh tiếp xúc trực tiếp với mẫu. Đảm bảo mẫu được bảo quản và vận chuyển ở nhiệt độ phòng (18 – 25oC). Bước 4: Đậy nắp thùng đựng mẫu và khoá lại, nếu không có khoá thì dùng băng dính dán xung quanh. Bước 5: Dán hoặc in ký hiệu “NGUY HIỂM SINH HỌC” và số điện thoại, địa chỉ của cơ sở gửi mẫu bên ngoài thùng đựng mẫu. 2.2. Vận chuyển mẫu máu - Liên hệ gửi mẫu: Đơn vị gửi mẫu cần thông báo trước cho phòng xét nghiệm T-CD4 về thời gian bệnh phẩm sẽ tới để phòng xét nghiệm bố trí cán bộ tiếp nhận và thực hiện xét nghiệm đảm bảo theo quy định về thời gian lưu mẫu kể từ khi lấy mẫu. - Thời gian gửi mẫu: Mẫu bệnh phẩm phải được gửi tới phòng xét nghiệm kèm theo phiếu xét nghiệm điền đầy đủ các thông tin trong vòng 24 giờ kể từ thời điểm lấy máu và tốt nhất là trong ngày lấy máu. - Phương tiện vận chuyển: Tốt nhất là bằng xe ô-tô chuyên dụng. Trong trường hợp điều kiện không cho phép, có thể sử dụng xe gắn máy để vận chuyển nhưng phải buộc hộp chứa mẫu bệnh phẩm thật cẩn thận vào giá chở hàng, đảm bảo gọn gàng, tránh đổ, vỡ và tuân thủ đầy đủ các quy định về vận chuyển mẫu bệnh phẩm theo quy định 43/2011/TT-BYT ngày 05/12/2011 của 38
  39. Bộ trưởng Bộ Y tế về quy định chế độ quản lý mẫu bệnh phẩm bệnh truyền nhiễm. - Người vận chuyển mẫu bệnh phẩm phải là nhân viên của cơ sở chăm sóc, điều trị người bệnh HIV/AIDS hoặc cộng tác viên đã được tập huấn tập huấn. Khi vận chuyển cần mang theo găng tay, thuốc sát trùng và các dụng cụ an toàn để xử lý khi gặp sự cố. 2.3. Tiếp nhận mẫu máu tại phòng xét nghiệm - Kiểm tra nhãn, phiếu yêu cầu xét nghiệm, phiếu giao nhận mẫu. Đối chiếu thông tin trên nhãn ống bệnh phẩm và phiếu yêu cầu xét nghiệm. - Ghi chép vào sổ nhận mẫu. - Đánh giá chất lượng của mẫu: + Thực hiện theo hướng dẫn sau: • Kiểm tra ống đựng mẫu và thành phần trong ống ngay khi mẫu về đến nơi, phải kiểm tra kỹ xem có bị nứt hoặc vỡ không? • Kiểm tra mẫu có bị tan huyết hoặc bị đóng băng không? • Các mẫu chống đông có bị đông vón hoặc đông dây không? • Thời gian từ khi lấy mẫu đến khi nhận mẫu có đảm bảo với yêu cầu xét nghiệm không? • Chất chống đông sử dụng có đúng với yêu cầu xét nghiệm không? • Lượng mẫu có đủ làm xét nghiệm không? + Tiêu chuẩn loại bỏ mẫu: Loại bỏ mẫu và yêu cầu lấy lại mẫu khác trong những trường hợp sau: • . • Mẫu lấy nhầm, không phù hợp thông tin giữa mẫu và phiếu yêu cầu xét nghiệm. • và trên phiếu xét nghiệm không phù hợp. • Ống đựng máu với chất chống đông không phải EDTA, ống máu không phù hợp. • Ống đựng mẫu . • Mẫu máu bị tán huyết hoặc bị đông băng hoặc có hiện tượng đông vón. 39
  40. • Điều kiện bảo quản mẫu và vận chuyển không đúng yêu cầu. • Mẫu máu không đủ thể tích yêu cầu. • 24 giờ sau khi lấy máu. • Mẫu bị pha loãng trong trường hợp lấy máu từ đường đang truyền dịch. • Nhiệt độ trong thùng gửi mẫu cao hơn 30 oC. Lưu ý: Trong trường hợp loại bỏ mẫu, phải thông báo cho cơ sở gửi mẫu về chất lượng của việc lấy máu cũng như phải thông báo về việc làm xét nghiệm chậm do phải lấy lại mẫu. 2.4. Lưu giữ mẫu theo nhiệt độ khuyến cáo của nhà sản xuất để kiểm tra lại khi cần thiết. 2.5. Hủy bỏ mẫu Thực hiện theo các 43/2011/TT-BYT ngày 05/12/2011 của Bộ trưởng Bộ Y tế về quy định chế độ quản lý mẫu bệnh phẩm bệnh truyền nhiễm. HIV/AIDS. mẫu trong trường hợp này cũng phải thực hiện và hướng dẫn tại Mục 2.1 và 2.2. 3. Nguyên nhân và giải pháp khắc phục một số lỗi thường gặp 3.1. Hiện tượng tan huyết Nguyên nhân Cách khắc phục Gặp khó khăn với quá trình lấy máu Tập huấn cách lấy máu và tuân thủ quy tĩnh mạch như trong các trường hợp lấy trình chuẩn lấy máu. được ít máu hoặc máu chảy vào dụng cụ lấy máu chậm. Kéo piston của bơm tiêm quá nhanh Tuân thủ quy trình chuẩn lấy máu Lắc hoặc trộn ống máu hoặc trong quá Đảo ngược ống máu nhẹ nhàng 5-6 lần, trình vận chuyển mẫu không được giữ tuân thủ quy trình chuẩn vận chuyển 40
  41. Nguyên nhân Cách khắc phục gìn cẩn thận. mẫu máu. Có kẽ dò không khí do không lắp chặt Kiểm tra việc lắp chặt kim vào ống kim. bơm tiêm hoặc ống lấy máu . . Kiểm tra ống lấy máu trước khi sử này để lấy dụng máu 3.2 Hiện tượng cục máu đông hoặc đông một phần Gây ra hiện tượng số lượng tế bào đếm thấp giả tạo trong xét nghiệm do các thành phần tế bào bị tóm vào lưới fibrin, đông vón tiểu cầu. Nguyên nhân Cách khắc phục Gặp khó khăn với quá trình lấy máu . tĩnh mạch như trong các trường hợp lấy được ít máu hoặc máu chảy vào dụng cụ lấy máu chậm. Kiểm tra . . Tỷ lệ máu nhiều hơn so với chất chống Sử dụng ống đựng máu phù hợp với đông. thể tích máu lấy. Lắc hoặc trộn ống máu không đều. Đảo ngược ống máu nhẹ nhàng 8-10 lần để máu được trộn đều với chất chống đông. CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ 1. Hãy kể m -CD4? 2. Hãy nêu biện pháp để có thể kiểm soát được các yếu tố trong việc lấy mẫu bệnh phẩm có thể tránh được? 3. Anh (chị) cho biết mẫu nào sau đây tương ứng với - Mẫu bị tan huyết. - Dưỡng chấp. 41
  42. - Mẫu bị vàng. - Mẫu bình thường. 4. Anh (chị) hãy nêu giải pháp để tránh các lỗi trong lấy máu sau đây : Lỗi Giải pháp Không đúng thông tin xác định ??? bệnh nhân / Sai nhãn Không sử dụng đúng chất chống ??? đông/ống lấy máu Tỷ lệ máu so với chất chống đông ??? không đúng Mẫu bị đông vón một phần ??? Tan huyết ??? Máu bị pha loãng ??? 5. Anh (chị) hãy cho biết quá trình xử lý bệnh phẩm này có gì sai? 42
  43. 6. Các tiêu chuẩn loại bỏ mẫu là gì? 7. Anh (chị) cho biết số lượng tế bào T-CD4 cao nhất vào thời điểm nào trong ngày: a) 8 giờ 30. b) 12 giờ. c) 18 giờ. d) 20 giờ 30. 8. Anh (chị) cho biết quá trình lấy mẫu máu, đóng gói và vận chuyển thuộc giai đoạn nào sau đây: a) Giai đoạn trước xét nghiệm. b) Giai đoạn xét nghiệm. c) Giai đoạn sau xét nghiệm. 43
  44. Bài 4. TỔNG QUAN VỀ QUẢN LÝ CHẤT LƯỢNG TRONG ĐẾM TẾ BÀO T-CD4 Mục tiêu bài giảng: Sau khi kết thúc bài giảng, học viên có khả năng trình bày: 1. Các khái niệm về chất lượng, quản lý chất lượng, đảm bảo chất lượng, kiểm soát chất lượng và cải thiện chất lượng; 2. Hai yêu cầu quan trọng trong xét nghiệm đếm tế bào T-CD4: về quản lý và về kỹ thuật. Thời gian học tập: 120 phút Nội dung bài học: 1. Các khái niệm 1.1. Chất lượng (Quality): Là tập hợp các đặc tính của một sản phẩm hoặc một dịch vụ nhằm thỏa mãn nhu cầu của người sử dụng sản phẩm/dịch vụ đó. 1.2. Hệ thống quản lý chất lượng (Quality Management System-QMS): Là một loạt các hoạt động phối hợp để chỉ dẫn và điều khiển một phòng xét nghiệm nhằm liên tục cải tiến và nâng cao hiệu quả các hoạt động. 1.3. Đảm bảo chất lượng (Quality Assurance-QA): Là các hoạt động được lập kế hoạch và mang tính hệ thống, quy trình được thực hiện để đảm bảo việc tiến hành thu thập mẫu, thực hiện xét nghiệm, ghi chép và báo cáo kết quả là đạt tiêu chuẩn chất lượng đề ra. 1.4. Kiểm soát chất lượng (Quality Control): Là những phép đo bắt buộc trong quá trình xét nghiệm nhằm kiểm định xem các phép đo có đúng hay không. 1.5. Cải thiện chất lượng (Quality Improvement-QI): Là một quá trình để phân tích, xác định các nguyên nhân chính dẫn đến các vấn đề phát sinh, các sai xót đã được chỉ ra thông qua hoạt động Kiểm soát chất lượng và Đảm bảo chất lượng, sau đó đưa ra các biện pháp khắc phục và xây dựng kế hoạch để cải thiện chất lượng của hệ thống đang thực hiện. 2. Yêu cầu về quản lý chất lượng Cần tập trung vào các yếu tố thiết yếu sau: - Hệ thống tổ chức và quản lý. - Các tiêu chuẩn chất lượng. - Tài liệu. 44
  45. - Giám sát và đánh giá. - Tập huấn. 2.1. Tổ chức và quản lý - Trưởng phòng xét nghiệm chịu trách nhiệm tổng thể trong khâu thiết kế, triển khai, duy trì và cải thiện hệ thống chất lượng nhưng đảm bảo chất lượng là trách nhiệm của tất cả nhân viên phòng xét nghiệm. - Phòng xét nghiệm cần xây dựng sổ tay chất lượng trong đó nêu rõ chính sách chất lượng, cam kết của phòng xét nghiệm nhằm đạt được mục tiêu chất lượng đã đề ra. Trưởng phòng xét nghiệm sẽ giao trách nhiệm và quyền hành cho cán bộ thích hợp chịu trách nhiệm trực tiếp về việc thực hiện chính sách và hệ thống chất lượng. - Để tạo thuận lợi cho việc xây dựng và triển khai hệ thống chất lượng, Ban Lãnh đạo của đơn vị cần phải cam kết thực hiện đảm bảo chất lượng cũng như phân bổ đầy đủ các nguồn lực nhằm triển khai các hoạt động đã lập kế hoạch và phê duyệt để thực hiện. 2.2. Các tiêu chuẩn chất lượng - Tiêu chuẩn chất lượng là một phần bắt buộc của hệ thống chất lượng nhằm đảm bảo tính an toàn và sự đồng nhất của hệ thống chất lượng. Các hoạt động của phòng xét nghiệm cần phải thực hiện theo các tiêu chuẩn này để đáp ứng các yêu cầu hiện hành của cơ quan quản lý để giám sát chức năng của phòng xét nghiệm. - Tiêu chuẩn quản lý và tiêu chuẩn kỹ thuật cần phải được giám sát và điều chỉnh kịp thời nhằm đảm bảo chất lượng nhưng cũng cần phải phù hợp với luật pháp sở tại. 2.3. Tài liệu - Tài liệu là các hướng dẫn bao gồm chính sách chất lượng, sổ tay chất lượng, quy trình, tiêu chuẩn kỹ thuật, các bản báo cáo, bản mô tả công việc của phòng xét nghiệm; và cũng bao gồm các tài liệu gốc bên ngoài (ví dụ: các quy định, các tiêu chuẩn của cơ quan quản lý). Các tài liệu này có thể được lưu trữ dưới các hình thức khác nhau bằng văn bản giấy hoặc văn bản điện tử. - Hệ thống chất lượng của các phòng xét nghiệm cần xác định và xây dựng các quy trình để kiểm soát tất cả các tài liệu và thông tin (nội bộ và bên ngoài). Các văn bản mới có liên quan cần phải có sẵn ở tất cả các bộ phận triển khai những hoạt động cần thiết cho việc vận hành hiệu quả hệ thống chất lượng. 45
  46. 2.4. Giám sát và đánh giá - Trưởng phòng xét nghiệm phải xây dựng và triển khai các chỉ số về chất lượng để đánh giá và giám sát một cách hệ thống việc thực hiện xét nghiệm. Việc giám sát và đánh giá giúp phát hiện được các sai sót và xác định được các cơ hội cải thiện chất lượng trong phòng xét nghiệm, trưởng phòng xét nghiệm sẽ thực hiện các hành động thích hợp để khắc phục các sai sót. Công tác quản lý các sai sót cũng cần được thực hiện một cách chặt chẽ và sát sao. - Ngoài ra, còn có một số công cụ đánh giá chất lượng khác đó là thông qua việc đánh giá nội bộ và tham gia vào chương trình đánh giá chất lượng từ bên ngoài và kết quả đánh giá này sẽ đưa ra định hướng giúp nhóm cán bộ quản lý cải thiện thêm về chất lượng 2.5. Tập huấn - Phòng xét nghiệm phải xây dựng chương trình tập huấn phù hợp cho tất cả các nhân viên để đảm bảo thực hiện tốt các công việc được giao. - Chương trình đào tạo cần làm cho học viên hiểu được tại sao chất lượng lại quan trọng và chương trình đào tạo cần đi đôi với thực hành tại phòng xét nghiệm. Tập huấn cho nhân viên cần phải dựa trên năng lực và phải triển khai các hoạt động hỗ trợ sau tập huấn. 3. Yêu cầu về kỹ thuật: Bao gồm các thành tố sau: - Nhân sự. - Cơ sở hạ tầng và điều kiện môi trường. - Thiết bị phòng xét nghiệm. - Các giai đoạn trước, trong và sau xét nghiệm. - Báo cáo kết quả. - Kiểm soát chất lượng . 3.1. Nhân sự - Nhân sự là nguồn lực quan trọng nhất của phòng xét nghiệm. Nhân viên phòng xét nghiệm cần có vốn kiến thức phù hợp và có đủ kinh nghiệm để thực hiện các nhiệm vụ được giao. Phòng xét nghiệm cần có đủ nhân viên để đáp ứng công việc được giao cũng như thực hiện các chức năng khác của hệ thống quản lý chất lượng. - Trưởng phòng xét nghiệm phải xây dựng kế hoạch tổ chức bao gồm chính sách về nhân sự, sơ đồ báo cáo, bản mô tả công việc (trong đó có quy định rõ về 46
  47. trình độ và nhiệm vụ của tất cả các nhân viên). Phòng xét nghiệm cần lưu giữ hồ sơ của tất cả nhân viên bao gồm bản mô tả công việc, bằng cấp, sơ yếu lý lịch và trình độ đào tạo. 3.2. Cơ sở hạ tầng và điều kiện môi trường Phòng xét nghiệm phải có đủ diện tích cho khối lượng công việc và được thiết kế phù hợp để đảm bảo an toàn và sự thoải mái cho nhân viên. 3.3. Trang thiết bị - Phòng xét nghiệm phải được trang bị đầy đủ các thiết bị cần thiết cho việc cung cấp các dịch vụ (từ lấy mẫu, xử lý mẫu, xét nghiệm mẫu và lưu trữ mẫu). Tất cả các thiết bị cần đảm bảo hoạt động tốt và yêu cầu phải có tài liệu hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất và sổ tay vận hành. - Phòng xét nghiệm phải có kế hoạch thẩm định, hiệu chuẩn và bảo dưỡng định kỳ các trang thiết bị. Các trang thiết bị cần được quản lý chặt chẽ, ghi tên nhãn mác, phải có tài liệu hướng dẫn sử dụng cũng như hồ sơ liên quan (như sổ theo dõi vận hành thiết bị, sổ theo dõi bảo dưỡng thiết bị ), phải được bảo dưỡng đầy đủ và thống nhất theo quy định của hướng dẫn chất lượng. - Cán bộ sử dụng cần phải được tập huấn về sử dụng thiết bị, nếu thiết bị cần được sửa chữa thi sau khi nhận lại thì phải kiểm tra, hiệu chuẩn lại trước khi sử dụng. 3.4. Các giai đoạn xét nghiệm - Giai đoạn trước xét nghiệm: Mẫu máu cần phải được lấy, dán nhãn, bảo quản, đóng gói và vận chuyển đúng cách. Các tiêu chí chấp nhận và loại bỏ mẫu phải được xây dựng và tuân thủ một cách nghiêm ngặt nhằm bảo đảm tính nguyên vẹn của mẫu máu (tham khảo bài Quản lý mẫu bệnh phẩm). - Giai đoạn trong xét nghiệm: Phòng xét nghiệm phải tuân thủ đúng hướng dẫn của nhà sản xuất và các hướng dẫn quốc gia trong khi tiến hành xét nghiệm. Ngoài ra, phòng xét nghiệm cũng nên xây dựng các quy trình chuẩn (SOP) riêng dựa vào hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc hướng dẫn quốc gia. Các quy trình chuẩn cần được lưu trữ ở vị trí giúp nhân viên có thể dễ dàng tiếp cận và phải tuân thủ chặt chẽ các quy trình này. - Giai đoạn sau xét nghiệm: Trưởng phòng xét nghiệm phải kiểm tra các kết quả xét nghiệm trước khi trả kết quả. Mẫu bệnh phẩm phải được lưu giữ theo chính sách/quy định của phòng xét nghiệm và sau đó được thải bỏ theo đúng quy định về an toàn sinh học. 47
  48. 3.5 Báo cáo kết quả - Trưởng phòng xét nghiệm phải rà soát và kiểm tra các kết quả xét nghiệm một cách hệ thống và trước khi trả kết quả cho bệnh nhân. - Báo cáo cần phải rõ ràng, không mơ hồ và ghi rõ ngày tháng, thời gian, quy trình được sử dụng, danh tính và địa chỉ của bệnh nhân cũng như họ tên của cán bộ cho phép công bố báo cáo có kèm chữ ký. - Phòng xét nghiệm cũng nên giữ lại tất cả hồ sơ, bảng biểu và mẫu báo cáo trong hai năm hoặc theo các chính sách đã được thông qua. - Tùy theo loại máy được sử dụng mà cán bộ xét nghiệm phải ghi lại tất cả các thông số cần được báo cáo trong biểu mẫu trả lời kết quả (ví dụ: tỉ lệ phần trăm và số tuyệt đối số tế bào lympho T-CD4, hoặc % tế bào lympho T-CD4). 3.6 Kiểm soát chất lượng (tham khảo bài Kiểm soát chất lượng) CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ Chọn câu trả lời đúng cho các câu hỏi sau: 1. Hệ thống quản lý chất lượng (QMS) là: a. Những phép đo bắt buộc trong quá trình xét nghiệm nhằm kiểm định xem các phép đo có đúng hay không? b. Chương trình tổng thể nhằm đảm bảo rằng kết quả xét nghiệm cuối cùng là đúng. c. Tất cả các phương tiện phục vụ cho quá trình quản lý chất lượng (tổ chức, nhân sự, quy trình, quá trình, ) d. Cả 3 câu đều đúng. 2. Quá trình đảm bảo chất lượng xét đến tất cả các yếu tố gây ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm tính từ khi: a. Người bệnh được yêu cầu làm xét nghiệm cho tới khi báo cáo kết quả xét nghiệm. b. Phòng xét nghiệm thu nhận mẫu bệnh phẩm cho tới khi báo cáo kết quả xét nghiệm. c. Phòng xét nghiệm phân tích kết quả cho tới khi trả kết quả xét nghiệm. d. Câu (a) và (c) 3. : 48
  49. a. . b. -CD4. c. Các biểu mẫu cho sẵn được dùng để điền các thông tin về bệnh nhân hay kết quả xét nghiệm ví dụ: Phiếu yêu cầu xét nghiệm d. Cả câu (a) và (c) 4. - quản : a. Nhân sự; Tổ chức; Tập huấn; Đánh giá và Kiểm soát chất lượng. b. Nhân sự; Tổ chức và quản lý; Các tiêu chuẩn chất lượng; Tài liệu và Kiểm soát chất lượng c. (b). c. Hệ thống tổ chức và quản lý; Các tiêu chuẩn chất lượng; Tài liệu; Giám sát và đánh giá và Tập huấn. d. Hệ thống tổ chức và quản lý; Các tiêu chuẩn chất lượng; Tài liệu; Giám sát và đánh giá và Kiểm soát chất lượng. 5. - : a. c ; . b. Nhân sự; Cơ sở hạ tầng và điều kiện môi trường; Thiết bị phòng xét nghiệm; Các giai đoạn trước, trong và sau xét nghiệm; Báo cáo kết quả; Kiểm soát chất lượng. c. Nhân sự; Tổ chức; Báo cáo kết quả; Kiểm soát chất lượng; Trang thiết bị; Báo cáo kết quả; d. Nhân sự; Các tiêu chuẩn chất lượng; Thiết bị phòng xét nghiệm; Báo cáo kết quả; Đánh giá giám sát; Câu 6: Giai đoạn trong xét nghiệm yêu cầu: a. Cán bộ xét nghiệm phải xây dựng SOP về tiêu chí chấp nhận và loại bỏ mẫu bệnh phẩm. b. Cán bộ xét nghiệm phải xây dựng SOP để kiểm tra báo cáo kết quả xét nghiệm cho bệnh nhân. c. Cán bộ xét nghiệm phải xây dựng tất cả các SOP liên quan đến toàn bộ quy trình từ khâu lấy mẫu đến trả kết quả. 49
  50. d. Cán bộ xét nghiệm phải xây dựng SOP về việc thực hiện xét nghiệm dựa theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Câu 7: Sau khi thực hiện xong xét nghiệm, các kết quả xét nghiệm được: a. Cán bộ xét nghiệm trả ngay cho bệnh nhân b. Trưởng phòng xét nghiệm phải rà soát và kiểm tra trước khi trả cho bệnh nhân. c. Được cán bộ xét nghiệm lưu vào sổ và trả cho bệnh nhân d. Cả câu (b) và (c) Câu 8: Báo cáo kết quả xét nghiệm thuộc: a. Giai đoạn trước xét nghiệm b. Giai đoạn trong xét nghiệm c. Giai đoạn sau xét nghiệm d. Câu (b) và (c) 50
  51. Bài 5. KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG TRONG XÉT NGHIỆM ĐẾM TẾ BÀO T-CD4 Mục tiêu bài giảng: Sau khi kết thúc bài giảng, học viên có khả năng trình bày: 1. Các khái niệm về kiểm soát chất lượng, nội kiểm tra, ngoại kiểm tra, chất chuẩn máy, chất kiểm chứng. 2. Cách sử dụng biểu đồ Levey-Jennings và phân tích kết quả nội kiểm. Thời gian bài học: 120 phút Nội dung bài học: 1. Các khái niệm 1.1. Kiểm soát chất lượng: Là những phép đo bắt buộc trong quá trình xét nghiệm nhằm kiểm định xem các phép đo có đúng hay không. Kiểm soát chất lượng bao gồm nội kiểm tra và ngoại kiểm tra. 1.2. Kiểm soát chất lượng nội bộ hay nội kiểm tra (Internal Quality Control- IQC): Là quy trình theo dõi độ tập trung và độ chính xác của kết quả chạy mẫu chuẩn và mẫu chứng trước mỗi đợt làm xét nghiệm trên mẫu bệnh phẩm để phát hiện ra các sai sót chính trong quá trình thực hiện. Thực hiện kiểm tra bao gồm: - Mẫu chuẩn máy (calibrators): Là chất có thành phần không giống mẫu bệnh nhân, có độ tinh khiết cao và giá trị đã được biết trước. Mẫu chuẩn được sử dụng để hiệu chuẩn máy tại giá trị máy được cài đặt và đánh giá độ chính xác. - Mẫu kiểm chứng (controls): Là chất có thành phần tương tự như mẫu bệnh nhân với giá trị được biết trước. Mẫu chứng được sử dụng để đảm bảo quy trình xét nghiệm đang thực hiện đúng và đánh giá độ tập trung. 1.3. Đánh giá chất lượng bên ngoài hay ngoại kiểm tra (External Quality Assessment-EQA): Là một hệ thống để đánh giá khách quan về năng lực của phòng xét nghiệm thông qua một đơn vị hay tổ chức bên ngoài. 2. Những yếu tố ảnh hưởng tới xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 - Kiến thức cơ bản cùng kỹ năng của nhân viên phòng xét nghiệm. - Tình trạng mẫu bệnh phẩm. - Mẫu kiểm chứng sử dụng trong quá trình xét nghiệm. - Hóa chất, sinh phẩm. 51
  52. - Trang thiết bị. - Đọc kết quả xét nghiệm. - Sao chép kết quả xét nghiệm. - Báo cáo kết quả xét nghiệm. 3. Quy trình kiểm soát chất lượng nội bộ 3.1. Vẽ biểu đồ Levey-Jennings - Biều đồ Levey Jennings gồm 7 đường thẳng: Giá trị trung bình; Giá trị trung bình ± 1 độ lệch chuẩn (± 1SD); Giá trị trung bình ± 2 độ lệch chuẩn (± 2SD); Giá trị trung bình ± 3 độ lệch chuẩn (± 3SD)trong đó trục tung thể hiện giá trị của chứng, trục hoành là thời điểm (lần) thực hiện mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng). - Tính toán giá trị trung bình và độ lệch chuẩn: Phòng xét nghiệm cần phải tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn riêng của phòng xét nghiệm từ mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) đã biết trước giá trị do nhà sản xuất hoặc đơn vị đảm bảo chất lượng cung cấp. Bước 1: Chạy mẫu kiểm chứng trên để thu 20-30 điểm số liệu trong 20 ngày hoặc ít nhất trong 10 ngày. Bước 2: Loại bỏ những kết quả không nằm trong giới hạn cho phép của nhà sản xuất hoặc đơn vị đảm bảo chất lượng. Bước 3: Tính giá trị trung bình theo công thức dưới đây: X X X X X 1 2 3 n n Trong đó: X là giá trị trung bình cộng (X = mean) X1,2,3 n: giá trị thu được của lần chạy thứ 1,2,3 đến lần thứ n n: số lần chạy Bước 4: Tính giá trị độ lệch chuẩn 2 (x1 x) SD n 1 Trong đó: SD = Standard Deviation: Độ lệch chuẩn X1: giá trị thu được của lần chạy thứ 1 X: giá trị trung bình cộng n: số lần chạy 52
  53. Bước 5: Từ giá trị trung bình và độ lệch chuẩn ở trên tính tiếp X ±1SD; X±2SD và X±3SD và vẽ biểu đồ Levey -Jennings như hình 22 Lưu ý: Trong thời gian phòng xét nghiệm chưa thu được 20 điểm số liệu thì phòng xét nghiệm sử dụng giá trị trung bình (X= Mean) trên chai/túi của mẫu chuẩn máy và mẫu kiểm chứng do nhà sản xuất hoặc đơn vị đảm bảo chất lượng cung cấp để tính độ lệch chuẩn (SD) tương ứng với các mẫu chuẩn máy (một hay nhiều mẫu chuẩn máy). Trong trường hợp giá trị của mẫu chuẩn máy và mẫu kiểm chứng cho dưới dạng giá trị trung bình ± 10% (X ± 10%) thì lấy 1SD = 5% của giá trị trung bình, 2SD = 10% của giá trị trung bình. Từ đó, vẽ biểu đồ Levey- Jennings (hình 22). - Nếu phòng xét nghiệm CD4 sử dụng nhiều hơn 1 mẫu chuẩn máy và mẫu kiểm chứng thì mỗi mẫu phải được vẽ riêng trên mỗi biểu đồ Levey-Jennings. Hình 22. Biểu đồ Levey – Jenning theo dõi kết quả chạy mẫu chuẩn hoặc mẫu chứng 3.2. Phân tích mẫu chuẩn máy và mẫu kiểm chứng Trước mỗi đợt thực hiện xét nghiệm cho bệnh nhân cần chạy mẫu chuẩn máy và mẫu chứng đã biết trước về giá trị do nhà sản suất hoặc đơn vị đảm bảo chất lượng cung cấp. 3.2.1. Chạy mẫu chuẩn máy theo quy trình của nhà sản xuất - Điền kết quả chạy mẫu chuẩn lên biểu đồ Levey-Jennings, đối chiếu và phân tích kết quả chạy chuẩn máy với giá trị đã được cho trước (tham khảo mục 3.3). - Nếu kết quả chạy mẫu chuẩn máy đạt, chạy mẫu kiểm chứng. - Nếu kết quả chạy mẫu chuẩn máy không đạt, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn máy. 53
  54. 3.2.2 Chạy mẫu kiểm chứng giống như quy trình thực hiện xét nghiệm trên mẫu bệnh phẩm. - Điền kết quả chạy mẫu chuẩn lên biểu đồ Levey –Jennings, đối chiếu và phân tích kết quả với giá trị đã được cho trước (tham khảo mục 3.3). - Nếu kết quả chạy mẫu chứng đạt, thực hiện xét nghiệm trên mẫu bệnh nhân. - Nếu kết quả chạy mẫu chứng máy không đạt, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chứng. 3.3. Phân tích kết quả Việc phân tích kết quả nội kiểm phụ thuộc vào số lần chạy mẫu chứng với mẫu bệnh nhân. Áp dụng các quy luật Westgard để phân tích kết quả chạy mẫu chuẩn và mẫu chứng. 3.3.1. Định nghĩa luật Westgard: Luật Westgard là các luật kiểm soát chất lượng (Quality control - QC) được xây dựng dựa trên các phương pháp thống kê, nhằm phân tích xem các kết quả chạy mẫu chuẩn hoặc mẫu chứng nằm trong hay ngoài giới hạn cho phép. 3.3.2. Các quy luật Westgard Luật 12S: Khi một kết quả chạy mẫu chuẩn hoặc mẫu chứng nằm nằm ngoài giới hạn ± 2 SD nhưng vẫn nằm trong giới hạn ± 3 SD và không có các lỗi khác xảy ra thì nguyên nhân có thể là do lỗi ngẫu nhiên, trường hợp này cảnh báo cho phòng xét nghiệm cần giám sát các lần xét nghiệm tiếp theo và không cần làm lại xét nghiệm. Luật 13S: Khi một kết quả chạy mẫu chuẩn hoặc mẫu chứng nằm ngoài giới hạn ± 3 SD, nguyên nhân có thể là do lỗi ngẫu nhiên, trường hợp này phòng xét nghiệm phải loại bỏ kết quả của lần chạy và làm lại xét nghiệm trước khi thực hiện xét nghiệm trên mẫu bệnh nhân. 54
  55. Luật 22S: Áp dụng qua các lần chạy liên tiếp nhau của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng); hoặc trong cùng một lần chạy của các mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) khác nhau: - Khi hai kết quả liên tiếp của một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) nằm cùng một phía ngoài giới hạn + 2SD hoặc – 2SD thì lần chạy này không đạt, đây là lỗi hệ thống, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng. - Khi kết quả của hai mức mẫu chứng khác nhau trong cùng lần chạy nằm ngoài giới hạn + 2SD hoặc – 2SD (ví dụ: kết quả của mức mẫu chuẩn thấp (hoặc mẫu kiểm chứng thấp) nằm ngoài giới hạn + 2SD và kết quả của mức mẫu chuẩn trung bình (hoặc mẫu kiểm chứng trung bình) cũng nằm ngoài giới hạn + 2SD) thì lần chạy này không đạt, đây là lỗi hệ thống, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng. 55
  56. Luật R4S: Áp dụng qua các lần chạy liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng); hoặc trong cùng một lần chạy của các mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) khác nhau. - Khi hai kết quả liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) có sự chênh lệch vượt quá ± 4SD (ví dụ: khi một kết quả nằm ngoài giới hạn + 2SD và kết quả xét nghiệm tiếp theo nằm ngoài giới hạn – 2SD hoặc ngược lại) kết quả chạy mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) không đạt, đây là lỗi ngẫu nhiên, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng. Khi kết quả trong cùng một lần chạy ở hai mức mẫu chứng khác nhau có sự chênh lệch vượt quá ± 4SD (ví dụ: khi một kết quả của mức mẫu chứng thấp nằm ngoài giới hạn +2SD và kết quả của mức mẫu chứng trung bình nằm ngoài giới hạn -2SD và ngược lại) thì lần chạy này không đạt, đây là lỗi ngẫu nhiên, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng Luật 41S: Áp dụng ở các lần chạy liên tiếp nhau của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng); hoặc của các mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) khác nhau. - Khi 4 kết quả liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) cùng nằm trên giới hạn + 1SD hoặc dưới giới hạn -1SD thì kết quả lần chạy này không đạt, đây là lỗi hệ thống, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng. Khi 2 kết quả liên tiếp của hai mức mẫu chuẩn (hoặc hai mẫu kiểm chứng) cùng nằm phía trên + 1SD hoặc dưới giới hạn -1SD (ví dụ: hai kết quả liên tiếp của mức mẫu chuẩn thấp nằm phía trên + 1SD và hai kết quả liên tiếp của mức mẫu chuẩn trung bình cũng nằm cùng nằm trên giới hạn + 1SD hoặc dưới giới hạn -1SD), kết quả lần chạy này không đạt, đây là lỗi hệ thống, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng 56
  57. Luật 10X: Áp dụng ở các lần chạy liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) hoặc của hai mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) khác nhau. - Khi 10 kết quả liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) cùng nằm về 1 phía trên hoặc dưới giá trị trung thì kết quả lần chạy này không đạt, đây là lỗi hệ thống, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng. - Khi 5 kết quả liên tiếp của mỗi mức mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng cùng nằm phía trên hoặc dưới giá trị trung bình (ví dụ: 5 kết quả liên tiếp của mức mẫu chứng thấp đều nằm phía trên giá trị trung bình và 5 kết quả liên tiếp của mức mẫu chứng cao cũng nằm phía trên giá trị trung bình) thì kết quả lần chạy này không đạt, đây là lỗi hệ thống, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng Luật 2:32S: Áp dụng qua các lần chạy liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng); hoặc qua các lần chạy của các mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) khác nhau. - Khi 3 kết quả liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) cùng nằm về một phía và trong đó có 2 kết quả liên tiếp hoặc không liên 57
  58. tiếp nằm ngoài giới hạn +2SD hoặc -2SD, thì lần chạy này không đạt, đây là lỗi hệ thống tìm hiểu nguyên nhân, thực hiện biện pháp khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng. - Trường hợp có 3 mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) thì trong cùng một lần chạy, kết quả của mức mẫu chuẩn thấp và cao vượt ngoài giới hạn +2SD hoặc -2SD còn kết quả của mức mẫu chuẩn trung bình vẫn nằm trong giới hạn ± 2SD, thì lần chạy này không đạt, đây là lỗi hệ thống, tìm hiểu nguyên nhân, thực hiện biện pháp khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng. Luật 31S: Áp dụng trong trường hợp có 3 mức mẫu chứng ở các lần chạy liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng); hoặc trong cùng một lần chạy của các mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) khác nhau: - Khi 3 kết quả liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) cùng nằm trên giới hạn + 1SD hoặc dưới giới hạn -1SD, thì kết quả lần chạy này không đạt, đây là lỗi hệ thống, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng. - Khi 3 kết quả của ba mức mẫu chuẩn (hoặc ba mẫu kiểm chứng) trong cùng một lần chạy cùng nằm trên giới hạn + 1SD hoặc dưới giới hạn -1SD, thì kết quả lần chạy này không đạt, đây là lỗi hệ thống, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng. 58
  59. Luật 6X: Áp dụng trong trường hợp có 3 mức mẫu chứng ở các lần chạy liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) hoặc của ba mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) khác nhau. - Khi 6 kết quả liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) cùng nằm về phía trên hoặc dưới giá trị trung bình thì kết quả lần chạy này không đạt, đây là lỗi hệ thống, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng. Khi 2 kết quả liên tiếp của mỗi mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) cùng nằm phía trên hoặc dưới giá trị trung bình (ví dụ: 2 kết quả liên tiếp của mức mẫu chứng thấp nằm phía trên giá trị trung bình, 2 kết quả liên tiếp của mức trung bình nằm phía trên giá trị trung bình và 2 kết quả liên tiếp của mức cao cũng nằm phía trên giá trị trung bình) thì kết quả lần chạy này không đạt, đây là lỗi hệ thống, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng. 3.4. Các nguyên nhân gây ra lỗi 3.4.1. Lỗi ngẫu nhiên: Có thể do thay đổi dòng điện, pipette, nhà phân phối, tạp nhiễm, thay đổi thể tích, có bọt trong đường ống dẫn sinh phẩm 3.4.2. Lỗi hệ thống: Có thể do sự thay đổi lô chất chuẩn máy, thay đổi nhiệt độ của máy ủ, nguồn chiếu sáng bị hỏng, điện từ, lô sinh phẩm thay đổi. 4. Đánh giá chất lượng bên ngoài (EQA) hay ngoại kiểm tra 4.1. Giới thiệu - Đánh giá chất lượng bên ngoài là rất quan trọng để cải thiện hệ thống chất lượng phòng xét nghiệm và là phương pháp hữu hiệu để phát hiện các vấn đề về quy trình thực hiện trong phòng xét nghiệm nhằm đưa ra biện pháp khắc phục phù hợp để cải thiện chất lượng. - Tất cả các phòng xét nghiệm nên tham gia vào một chương trình ngoại kiểm tra. Chương trình ngoại kiểm tra có thể được tổ chức ở các mức độ khác 59
  60. nhau như khu vực, quốc gia hay quốc tế và các chương trình này có thể yêu cầu mất phí hoặc được miễn phí tùy thuộc vào mục đích của từng tổ chức. - Tổ chức/đơn vị cung cấp mẫu EQA bên ngoài gửi mẫu chưa được biết trước về giá trị (mẫu mù) cho các phòng xét nghiệm tham gia, các kết quả xét nghiệm của các phòng được phân tích, so sánh và báo cáo kết quả sẽ được gửi trả cho các phòng xét nghiệm. Các kết quả EQA của từng phòng xét nghiệm sẽ được giữ bí mật chỉ có đơn vị cung cấp dịch vụ ngoại kiểm .và phòng xét nghiệm của chính mình mới được biết kết quả. - Khi tham gia vào chương trình ngoại kiểm tra, phòng xét nghiệm cần xây dựng quy trình quản lý nhằm đảm bảo rằng tất cả các mẫu EQA đều được thực hiện giống như các mẫu máu của bệnh nhân. 4.2 Quy trình thực hiện mẫu ngoại kiểm tra (EQA) 4.2.1 Nhận mẫu EQA: Phòng xét nghiệm nhận các mẫu ngoại kiểm tra trực tiếp từ đơn vị cung cấp mẫu hoặc thông qua đơn vị đảm bảo chất lượng quốc gia. 4.2.2 Chuẩn bị và phân tích mẫu: Phòng xét nghiệm phải thực hiện phân tích mẫu EQA trong vòng 3-5 ngày kể từ khi nhận mẫu và thực hiện trong cùng đợt xét nghiệm cho bệnh nhân. Quy trình chạy mẫu EQA giống như quy trình thực hiện các mẫu máu của bệnh nhân (theo đúng quy trình của nhà sản xuất); 4.2.3. Ghi chép, báo cáo và lưu hồ sơ - Các kết quả EQA cần phải được ghi chép vào sổ ngoại kiểm và gửi cho đơn vị đảm bảo chất lượng. - Các báo cáo đánh giá kết quả EQA cần phải được lưu giữ trong một khoảng thời gian nhất định để có cơ sở đánh giá mức độ cải thiện năng lực của phòng xét nghiệm sau này. 4.2.4 Lưu giữ mẫu EQA: Các mẫu EQA phải được xử lý đúng cách và bảo quản để sử dụng khi cần thực hiện lại. 4.2.5 Nhận kết quả đánh giá từ đơn vị đảm bảo chất lượng: Trong trường hợp PXN có kết quả đánh giá EQA chưa đạt, có vấn đề tiềm ẩn trong luồng công việc cần phải kiểm tra tất cả các khía cạnh trong quy trình và phải đưa ra biện pháp khắc phục. CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ Chọn câu trả lời đúng cho các các câu hỏi sau: 1. Mục đích của việc thực hiện Kiểm soát chất lượng: a. Phòng ngừa các sai sót và để đảm bảo kết quả cuối cùng là đúng. 60
  61. b. Phát hiện và phòng ngừa sai sót trong quá trình thực hiện xét nghiệm để đảm bảo rằng kết quả cuối cùng là chính xác. c. Phát hiện, đánh giá và thực hiện các biện pháp khắc phục để đảm bảo rằng kết quả cuối cùng là chính xác. d. Cả câu (a) và (c) 2. Mẫu chuẩn máy là: a. Mẫu có thành phần giống như mẫu bệnh phẩm được dùng để đánh giá độ chính xác. b. Mẫu có thành phần không giống mẫu bệnh phẩm được dùng để đánh giá độ tập chung c. Mẫu có thành phần giống như mẫu bệnh phẩm được dùng để đánh giá độ tập trung. d. Mẫu có thành phần không giống như mẫu bệnh phẩm được dùng để đánh giá độ chính xác. 3. - : a. theo thời gian và đánh giá quy trình xét nghiệm nằm trong mức kiểm soát hay ngoài mức kiểm soát. b. Đánh giá quy trình xét nghiệm nằm trong mức kiểm soát hay ngoài mức kiểm soát. c. Nhắc cán bộ xét nghiệm về việc cần phải thực hiện nội kiểm định kỳ và đánh giá quy trình xét nghiệm nằm trong mức kiểm soát hay ngoài mức kiểm soát. d. 3 câu (a), (b) và (c) 4. : a. Được cán bộ phòng xét nghiệm thực hiện để giám sát kết quả xét nghiệm của các ngày khác nhau. b. Được thực hiện bởi một cơ quan bên ngoài triển khai để đánh giá định kỳ và mang tính hồi cứu việc thực hiện của phòng xét nghiệm. c. Được thực hiện bởi một đơn vị độc lập tại đơn vị triển khai để đánh giá định kỳ và mang tính hồi cứu việc thực hiện của phòng xét nghiệm. d. Được thực hiện bởi ban giám đốc của đơn vị để đánh giá năng lực của cán bộ xét nghiệm. 5. Luật R4S áp dụng: 61
  62. a. Khi 4 kết quả liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng); hoặc của các mức mẫu khác nhau cùng nằm trên giới hạn + 1SD hoặc dưới giới hạn -1SD b. Khi hai kết quả liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) có sự chênh lệch vượt quá ± 4SD. c. Khi 2 kết quả của 2 mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) cùng nằm trên giới hạn + 2SD hoặc cùng nằm dưới giới hạn -2SD d. Cả câu (b) và (c) 6. Luật 2:32S áp dụng: a. Khi 3 kết quả liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) cùng nằm về một phía và trong đó có 2 kết quả liên tiếp hoặc không liên tiếp nằm ngoài giới hạn +2SD hoặc -2SD. b. Khi 3 kết quả liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) cùng nằm ngoài giới hạn +2SD hoặc -2SD. c. Khi 2 kết quả liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) nằm ngoài giới hạn +3SD hoặc -3SD. d. Khi 3 kết quả liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) cùng nằm về một phía và trong đó có 2 kết quả không liên tiếp nằm ngoài giới hạn +2SD hoặc -2SD. 7. Mẫu ngoại kiểm tra (EQA) được thực hiện: a. Sau khi máy được hiệu chuẩn. b. Tương tự như quy trình thực hiện xét nghiệm trên mẫu bệnh nhân. c. Theo một quy trình riêng do phòng xét nghiệm xây dựng. d. Trước khi thực hiện xét nghiệm trên mẫu bệnh nhân 8. Lỗi ngẫu nhiên thường gặp ở các luật: a. Luật 22s hay10x b. Luật 22s hay41S c. Luật R4s hay10x d. Luật 13s hay R4s 62
  63. Bài 6. QUẢN LÝ THÔNG TIN VÀ HỆ THỐNG BIỂU MẪU BÁO CÁO TRONG XÉT NGHIỆM ĐẾM TẾ BÀO T-CD4 Mục tiêu bài học Sau khi học xong bài này, học viên có thể: 1. Trình bày được quá trình quản lý, lưu giữ thông tin của quá trình thực hiện xét nghiệm đếm tế bào T-CD4. 2. Hoàn thiện hệ thống biểu mẫu báo cáo theo đúng quy định. 3. Quản lý và lưu giữ thông tin, hồ sơ, sổ sách theo đúng quy định. Thời gian học tập: 90 phút Nội dung bài học: 1. Khái niệm thông tin và tầm quan trọng của thông tin trong xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 1.1. Khái niệm - Thông tin là sự phản ánh sự vật, sự việc, hiện tượng của thế giới khách quan và các hoạt động của con người trong đời sống xã hội. - Thông tin trong xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 là những thông tin mô tả về các yếu tố liên quan tới xét nghiệm CD4 bao gồm cơ sở xét nghiệm, cán bộ thực hiện xét nghiệm, bệnh nhân được làm xét nghiệm T-CD4, quá trình lấy mẫu, đóng gói, vận chuyển, chuẩn bị xét nghiệm, thực hiện xét nghiệm và trả lời kết quả. Thông tin này có thể mô tả các yếu tố khác nhau trong ngành y tế và ngoài ngành y tế có liên quan đến xét nghiệm T-CD4. - Quản lý thông tin là một hoạt động nhằm quản lý các sự kiện, hiện tượng. Quản lý thông tin một cách khoa học giúp cho việc tra cứu, chia sẻ và bảo mật trở nên nhanh chóng, dễ dàng và đơn giản hơn. Hệ thống quản lý thông tin là hệ thống cung cấp thông tin cho công tác quản lý của tổ chức bao gồm con người, thiết bị và quy trình thu thập, phân tích, đánh giá và phân phối những thông tin cần thiết, kịp thời, chính xác cho những người có thẩm quyền trong các quyết định về tổ chức và triển khai thực hiện. 1.2. Tầm quan trọng thông tin trong xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 - Phản ánh hiện trạng và những công việc đã làm trong suốt quá trình thực hiện xét nghiệm tế bào T-CD4 cho bệnh nhân bao gồm: Trước xét nghiệm, trong xét nghiệm và sau xét nghiệm. - Đánh giá tiến độ thực hiện và phối hợp các hoạt động. - Lựa chọn loại dịch vụ cần thiết phù hợp với bệnh nhân nhằm giảm chi phí. 63
  64. - Giúp cho cán bộ quản lý giám sát, ki , lựa chọn mục tiêu, lựa chọn ưu tiên, hoạch định chính sách, xây dựng tiêu chuẩn để điều phối các hoạt động. - Quản lý, l được thực hiện xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 là tư liệu tốt để: + T . + Sao chép kết quả hoặc tái thiết thông tin liên quan đến toàn bộ quá trình xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 cho bệnh nhân. + Kích hoạt tính năng theo dõi chi tiết và xử lý sự cố. + T /AIDS. + Làm căn cứ cho việc báo cáo, nghiên cứu khoa học và xây dựng kế hoạch. 2. Các loại thông tin và yêu cầu đối với thông tin trong xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 2.1. Các loại thông tin - Thông tin thường xuyên: Được thu thập qua các sổ sách ghi chép và biểu mẫu báo cáo định kỳ. - Thông tin không thường xuyên: Được thu thập qua các báo cáo giám sát, báo cáo kỹ thuật, đánh giá, nghiên cứu từ nhiều khía cạnh khác nhau. 2.2. Những yêu cầu đối với thông tin về xét nghiệm T-CD4 - Thông tin phải đầy đủ, toàn diện. - Thông tin phải chính xác. - Thông tin phải có tính đặc hiệu. - Thông tin phản ánh cả số lượng và chất lượng. 2.3 Các giai đoạn thu thập thông tin trong xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 - Giai đoạn trước xét nghiệm: bao gồm các thông tin về quá trình lấy mẫu, đóng gói và vận chuyển (chi tiết tham khảo bài “Lấy mẫu, đóng gói, vận chuyển mẫu bệnh phẩm trong xét nghiệm đếm tế bào T-CD4”). - Giai đoạn xét nghiệm: bao gồm các thông tin về x , phân tích kết quả, thực hiện nội kiểm và ngoại kiểm máy xét nghiệm. - xét nghiệm: bao gồm các thông tin về sao chép kết quả xét nghiệm từ máy hoặc phiếu trả kết quả vào sổ xét nghiệm, trả kết quả cho bác sĩ/ bệnh nhân, việc trao đổi của cán bộ xét nghiệm với bác sỹ lâm sàng và người quản lý, việc lưu giữ thông tin về toàn bộ quá trình xét nghiệm T-CD4 cho bệnh nhân và báo cáo tình hình xét nghiệm T-CD4 64
  65. 3. Hệ thống biểu mẫu báo cáo 3.1. Sổ xét nghiệm T-CD4 Hướng dẫn ghi chép sổ xét nghiệm T- CD4: (1,3) Giờ lấy máu/nhận mẫu máu. (2,4) Ngày lấy máu/nhận mẫu máu. (5) Họ và tên của bệnh nhân hoặc mã số của bệnh nhân. (6) Mã số phòng xét nghiệm sử dụng tương ứng với mẫu bệnh phẩm đó. (7), (8) Điền tuổi của bệnh nhân nam vào ô số 7 và bệnh nhân nữ vào ô số 8. (9) Tên phòng khám, nơi gửi mẫu bệnh phẩm tới phòng xét nghiệm. (10) Nhận xét chất lượng mẫu bệnh phẩm: (11, 12) Số lượng T-CD4 tuyệt đối hoặc phần trăm T-CD4 được in ra từ máy. (13) Ngày trả kết quả của bệnh nhân cho đơn vị gửi mẫu. (14) Tên và chữ ký của nhân viên – cán bộ thực hiện xét nghiệm. 65
  66. 3.2. Sổ ghi chép vận chuyển mẫu Hướng dẫn ghi chép: (1) Số thứ tự chuyển mẫu. (2) Số lượng mẫu chuyển đi trong lần vận chuyển. (3) Tên của chương trình/dự án tài trợ. (4,6,8,10) Giờ lấy máu/chuyển mẫu/nhận mẫu/trả hoặc nhận kết quả. (5,7,9,11) Ngày lấy máu/chuyển mẫu/nhận mẫu/trả hoặc nhận kết quả. (12) Tên đơn vị chuyển mẫu đến. (13) Xác nhận của nơi gửi mẫu. (14) Tên và chữ ký của cán bộ tiếp nhận mẫu. (15) Nhận xét tình trạng mẫu lúc nhận. 3.3. Sổ theo dõi lý lịch máy - Các thông tin về máy, thời gian bảo trì sửa chữa. - Cơ sở thực hiện theo hướng dẫn và lưu tại phòng. 66
  67. LÝ LỊCH MÁY Tên thiết bị: Mã số Nơi sử dụng Ngày nhận máy: Ngày đưa vào sử dụng: Nhãn hiệu máy (Model): Nước sản xuất: Công suất: Số máy (Serial): Nguồn cấp máy: Phụ kiện của máy nếu có (dụng cụ và phụ tùng kèm theo) STT Tên phụ tùng Quy cách Số lượng Ghi chú STT Người quản Ngày, Mô tả chi tiết hoạt động Người thực hiện Hướng giải lý thiết bị Ghi tháng, bảo trì, (ký và ghi rõ họ quyết (ký và ghi rõ chú năm bảo dưỡng, sửa chữa tên) họ tên) 67
  68. 3.4. Báo cáo tình hình xét nghiệm - Cơ sở xét nghiệm thực hiện báo cáo định kỳ hàng tháng gửi về Trung tâm Phòng, chống HIV/AIDS trước ngày cuối cùng của tháng; - Trung tâm Phòng, chống HIV/AIDS gửi báo cáo về Cục Phòng, chống HIV/AIDS trước ngày 05 hàng tháng. (1) Số thứ tự. (2) Tên sinh phẩm/ vật dụng xét nghiệm: Điền tên các hoá chất, các vật dụng xét nghiệm cần có tuỳ theo từng loại máy của phòng xét nghiệm. (3) Đơn vị tính: Ghi rõ: ống, cái, chiếc, hộp, bình (4) Số lô: Điền đầy đủ số lô của loại sinh phẩm tương ứng có tại cơ sở. (5) Hạn dùng: Điền ngày hết hạn của sản phẩm (thường là thông tin ngày tháng sau chữ Exp. hoặc "Expiry date"). (6) Tồn đầu kỳ: Số lượng sinh phẩm/ vật dụng xét nghiệm vào đầu tháng báo cáo. Tồn đầu kỳ của mỗi tháng chính là tồn cuối kỳ của tháng liền kề trước đó. (7) Nhận trong tháng: Số lượng sinh phẩm/ vật dụng xét nghiệm nhận được trong tháng báo cáo từ phân phối thường kỳ hoặc điều chuyển từ cơ sở khác. 68
  69. (8) Chuyển trong tháng: Số lượng sinh phẩm/ vật dụng xét nghiệm điều chuyển cho các cơ sở khác. (9) Sử dụng trong tháng: Số lượng sinh phẩm/vật dụng xét nghiệm sử dụng cho công tác xét nghiệm tại phòng xét nghiệm hoặc chuyển tới phòng khám (ống EDTA, kim 2 đầu ). (10) Số lượng hư hao: Số lượng hư hao bao gồm sinh phẩm/vật dụng xét nghiệm bị hỏng trước hoặc trong quá trình sử dụng và sinh phẩm/vật dụng xét nghiệm sử dụng trong quá trình làm lại xét nghiệm. (11) Số lượng sẽ hết hạn trong vòng 3 tháng tới. (12) Tồn cuối kỳ: - Số lượng sinh phẩm/vật dụng xét nghiệm còn lại vào cuối kỳ chốt báo cáo (theo số liệu kiểm kho). - Theo lý thuyết, tồn cuối kỳ = tồn đầu kỳ + nhận trong kỳ - sử dụng - hư hao. (13) Tổng sử dụng trong tháng: (13) = (9) + (10) 3.5. Phiếu theo dõi nhiệt độ Cơ sở xét nghiệm thực hiện việc theo dõi , tủ lạnh lưu giữ hóa chất, sinh phẩm theo quy định. 3.6. Hồ sơ (EQA) - . - Cơ s đếm tế bào T- . 4. Chế độ lưu giữ thông tin - . - Hồ sơ lưu giữ là những tài liệu cụ thể rõ ràng ở dạng văn bản viết, văn bản in hay file điện tử cho thấy bằng chứng của quá trình hoạt động xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 trong phòng xét nghiệm. - Toàn thể nhân viên làm việc tại phòng xét nghiệm có trách nhiệm lưu giữ hồ sơ, sổ sách trong phạm vi được phân công quản lý. - . 69
  70. - STT Thời gian lưu giữ 1 05 năm 2 Kết quả xét nghiệm in ra từ máy 02 năm 3 Sổ xét nghiệm T-CD4 10 năm 4 Sổ ghi chép vận chuyển mẫu 10 năm 5 6 Phiếu theo dõi nhiệt độ 01 năm Các báo cáo liên quan đến xét nghiệm 7 10 năm đếm tế bào T-CD4 CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ Câu 1: Thông tin về xét nghiệm T-CD4: a. Phản ánh hiện trạng và những công việc đã làm trong suốt quá trình thực hiện ( trước, trong và sau) xét nghiệm tế bào T-CD4 cho bệnh nhân. b. Đánh giá tiến độ hoạt động và phối hợp các hoạt động, chọn loại dịch vụ cần thiết phù hợp với bệnh nhân và giảm chi phí. c. Giúp cho cán bộ quản lý , lựa chọn mục tiêu, chọn ưu tiên, hoạch định chính sách, xây dựng tiêu chuẩn để điều phối dịch vụ. d. Cả 3 ý trên đều đúng -CD4 để: a. - /AIDS, có tác dụng quan trọng trong công tác nghiên cứu khoa học. b. Sao chép kết quả hoặc tái thiết thông tin liên quan đến toàn bộ quá trình xét nghiệm T-CD4 cho bệnh nhân, kích hoạt tính năng theo dõi chi t /AIDS, có tác dụng quan trọng trong công tác nghiên cứu khoa học. Câu 3: Thông tin về xét nghiệm T-CD4 là: a. Những thông tin mô tả về các yếu tố liên quan đến cơ sở xét nghiệm, người thực hiện xét nghiệm và bệnh nhân làm xét nghiệm T-CD4. 70
  71. b. Những thông tin này mô tả cả các yếu tố khác nhau trong ngành y tế và ngoài ngành y tế có liên quan đến xét nghiệm T-CD4. c. Cả 1 và 2 đều đúng. Câu 4: Sổ nào sau đây cần lưu giữ trong giai đoạn trước xét nghiệm a. Sổ giao nhận mẫu b. Sổ xét nghiệm c. Sổ trả kết quả Câu 5: Thời gian lưu giữ kết quả xét nghiệm in ra từ máy. a. 6 tháng b. 1 năm c. 2 năm d. 5 năm Câu 6: Sổ nào sau đây cần lưu giữ trong giai đoạn xét nghiệm a. Sổ giao nhận mẫu b. Sổ xét nghiệm c. Sổ trả kết quả Câu 7: Người chịu trách nhiệm lưu giữ hồ sơ, sổ sách trong phòng xét nghiệm a. Tất cả nhân viên b. Cán bộ trực tiếp thực hiện xét nghiệm c. Nhân viên được phân công Câu 8: Thời gian lưu giữ sổ lý lịch máy a. 2 năm b. 5 năm c. 10 năm d. Tới thời điểm thanh lý máy 71
  72. Bài 7. AN TOÀN SINH HỌC TRONG XÉT NGHIỆM ĐẾM TẾ BÀO T- CD4 Mục tiêu bài học: Sau khi học xong học viên có thể trình bày: 1. Các quy 4. 2. Các quy định về an toàn phòng xét nghiệm và các qui định về quản lý mẫu bệnh phẩm và xử lý chất thải. 3. Các quy định và hướng dẫn giải quyết sự cố khi xảy ra tai nạn trong quá trình công tác. Thời gian học tập: 180 phút Nội dung bài học: 1. Hướng dẫn an toàn trong quá trình lấy mẫu và vận chuyển 1.1. Mục đích - . - Bảo vệ các mẫu bệnh phẩm tránh bị nhiễm chéo, bị hư hỏng. - . 1.2. Nguyên tắc an toàn đối với nhân viên lấy máu đếm tế bào T- xác định là , : - Phải sử dụng găng tay khi tiếp xúc trực tiếp với máu của bệnh nhân. - Khi có vết thương hở hoặc các tổn thương da rỉ nước, phải băng kỹ và tốt nhất không tiếp xúc với máu cho đến khi vết thương lành. - . - Những ống đựng máu phải được đậy kín. Thành ngoài ống phải được lau chùi sạch (không được dính máu) bằng các dung dịch tẩy uế như hypoclorit 0,1% chất clo (1gr/lít). - Khi máu dính trên mặt bàn hay mặt sàn, công việc đầu tiên là phải lấy giấy hay vải có thể hút nước đắp lên. Sau 72