Báo cáo đề tài Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật Elisa - Trần Thị Quế

Nội dung text: Báo cáo đề tài Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật Elisa - Trần Thị Quế

1. CHẨN ĐOÁN VIRUS CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT ELISA Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Trần Thị Quế 1
2. Nội dung báo cáo ❖I. Đặt vấn đề ❖II.Giới thiệu chung • 1. Lịch sử hình thành bệnh • 2. Căn bệnh • 3. Bệnh do virus cúm gia cầm gây ra • 4. Phòng chống bệnh cúm gia cầm ❖III. Chẩn đóan virus cúm bằng phương pháp ELISA. ❖IV. Kết luận 2
3. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Nguy cơ lây lan của dịch cúm gia cầm khắp toàn cầu. Đại dịch cúm cướp đi sinh mạng của hàng trăm triệu người cùng những thiệt hại về kinh tế. Nhiều biện pháp phòng chống bệnh cúm gia cầm nhằm hạn chế sự lây lan và phát tán của mầm bệnh. việc phát hiện, chẩn đoán virus cúm gia cầm một cách có hiệu quả, nhanh, chính xác, rẻ tiền là một vấn đề bức thiết. 3
4. II. GIỚI THIỆU CHUNG 4
5. 1. LỊCH SỬ BỆNH 5
6. 2. CĂN BỆNH Giới thiệu chung về virus cúm gia cầm A. Hình thái và cấu trúc • Cúm gà hay cúm gia cầm là một loại bệnh cúm do virus gây ra cho các loài gia cầm (hay chim), và có thể xâm nhiễm một số loài động vật có vú. • Virus cúm gà: avian influenza (AI), nhóm virus cúm A, họ Orthomyxociridae. Là retrovirus, vật liệu di truyền là RNA, sợi đối mã (sợi âm tính), có dạng đa hình thái, kích thước 80-120nm. • Cấu trúc bộ gene của virus gồm 8 phân đoạn, mã hóa cho các protein: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS. 6
7. Các phân nhóm (subtype) của virus cúm gia cầm được xác định dựa trên cấu trúc của các protein bề mặt HA và NA. ✓16 subtype HA ✓9 subtype NA 7
8. Haemagglutinin (HA) • Là một protein bề mặt, có khả năng bám trên các thụ thể tế bào chứa sialic acid, giúp virus nhân lên và gây bệnh. • Kích thích cơ thể vật chủ sinh kháng thể Hemagglutinin bảo hộ HI. 8
9. Neuraminidase (NA) • Là protein bề mặt, có hoạt tính sialidase, giúp virus phân cắt HA ra khỏi màng. • Là kháng nguyên bề mặt kích thích cơ thể vật chủ tạo kháng thể NI. Neuraminidase 9
10. Miễn dịch • Đáp ứng miễn dịch cục bộ tại niêm mạc và miễn dịch toàn thân. • Mức độ đáp ứng miễn dịch: gà > gà lôi > gà tây > cút > vịt. • Sau 5 ngày gây nhiễm, chủ yếu thấy xuất hiện IgM và một ít IgG. • Đáp ứng sinh kháng thể từ các protein bề mặt ( HA và NA) là các kháng thể trung hòa có tính đặc hiệu cao. 12
11. Chẩn đoán: Chẩn đoán lâm sàng Chẩn đoán phòng thí nghiệm Dịch tễ, triệu chứng, Phát hiện virus bệnh tích Phát hiện kháng thể Phát hiện protein Phân lập virus hoặc DNA virus •ELISA, •AGID, •miễn dịch huỳnh quang • HI, •ELISA, •miễn dịch • RT-PCR • huỳnh quang. •real-time PCR 13
12. 1. Giới thiệu chung về kỹ thuật ELISA • ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. • Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể. 14
13. 2 loại: ✓ ELISA trực tiếp nhằm tìm kiếm kháng nguyên (ELISA capture hoặc ELISA sandwich) ✓ ELISA gián tiếp nhằm tìm kiếm kháng thể (indirect hoặc ELISA cạnh tranh = competitive ELISA). 15
14. 2. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật ELISA • Lấy mẫu và bảo quản mẫu: +Dùng tăm bông lấy mẫu dịch khí quản hoặc mẫu phân ở lỗ huyệt gia cầm sống hoặc chết => tăm bông được cho vào môi trường vận chuyển vô trùng chứa kháng sinh. +Mô (gan, lách, thận, tụy, não ) đặt vào túi plastic vô trùng. Bảo quản riêng các mô đường ruột và đường hô hấp. 16
15. + Xét nghiệm mẫu trong vòng 48 giờ sau khi thu thập=> bảo quản ở 4oC, mẫu được giữ lâu hơn => bảo quản ở -70oC. + Mô: nghiền thành huyễn dịch 5-10% trong môi trường vận chuyển và được lắng lọc bằng ly tâm với tốc độ thấp. 17
16. a. Phát hiện kháng nguyên • Bản chất kháng nguyên của cúm gia cầm phụ thuộc chính vào hai yếu tố H và N => phát hiện và phân biệt các subtype kháng nguyên virus cúm cần ít nhất 2 bộ kit và 2 lần xét nghiệm. • Lần 1: Xác định yếu tố HA (Hemaglutinin). • Lần 2: Xác định yếu tố NA (Neuraminidase). 18
17. Phương pháp: dùng ELISA trực tiếp Direct competitive ELISA to detect soluble antigens. Ag = antigen; Ab = antibody; E = enzyme. 19
18. Steps of a Sandwich Elisa. (1) A monoclonal or polyclonal antibody is usually attached to the plate. (2) Incubation with the unknown sample. (3) Addition of the conjugate. (4) Substrate addition. Every step is preceded by incubations and washings 20
19. Direct ELISA: • Nhanh, tránh được phản ứng chéo của kháng thể thứ cấp với các thành phần trong mẫu. • Đòi hỏi đánh dấu tất cả các kháng thể được sử dụng=> tốn thời gian, chi phí. • Một số kháng thể không phù hợp với việc đánh dấu trực tiếp. • Thường thiếu sự khuyếch đại tín tín hiệu thêm vào mà có thể đạt được với việc sử dụng kháng thể thứ cấp. 22
20. • b. Phát hiện kháng thể: • Bản chất kháng nguyên của cúm gia cầm là H và N => virus cúm xâm nhập vào cơ thể nó kích thích cơ thể tạo ra 2 loại kháng thể trung hòa có tính đặc hiệu cao: • HA kích thích cơ thể tạo kháng thể HI. • NA kích thích cơ thể tạo kháng thể NI. 2 bộ kit ELISA, chẩn đoán 2 lần: Xác định kháng thể kháng HA trước sau đó là kháng thể kháng NA. 23
21. Phương pháp chẩn đoán: ELISA gián tiếp. 24
22. Indirect ELISA steps: (1) Antigen is bound to the plate. (2) Addition of test serum. (3) Addition of the conjugate. (4) Addition of the substrate 25
23. Indirect ELISA • Kháng thể thứ cấp được sử dụng rộng rãi với nhiều kháng thể sơ cấp (vd: all mouse monoclonal antibodies). • Kháng thể thứ cấp gia tăng độ nhạy của phản ứng (do khuyếch đại tín hiệu thêm vào). 27
24. KẾT LUẬN • Việc chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng phương pháp ELISA giúp cho việc phát hiện và phân loại virus nhanh chóng và dễ dàng hơn. • Đơn giản, đặc hiệu, nhạy và nhanh. • Xét nghiệm được một số lượng mẫu lớn. • Giúp tầm soát nguồn bệnh tốt hơn. • được ứng dụng rỗng rãi trong thực tế nhất là khi đại dịch cúm bùng phát trên diện rộng. 28
25. TÀI LIỆU THAM KHẢO • Công nghệ sinh học trong thú y. 2007. Nguyễn Ngọc Hải • • • nidase,_Tamiflu_and_Relenzawww.khoahoc.com.vn Protocol.html • • • Inhibitors • 29