Tạo dòng biểu hiện tiết và khảo sát khả năng sử dụng đuôi CBM3a để tinh chế Endoglucanse A trong Bacillus subtilis

Nội dung text: Tạo dòng biểu hiện tiết và khảo sát khả năng sử dụng đuôi CBM3a để tinh chế Endoglucanse A trong Bacillus subtilis

1. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T3- 2016 Tạo dòng biểu hiện tiết và khảo sát khả năng sử dụng đuôi CBM3a để tinh chế Endoglucanse A trong Bacillus subtilis Nguyễn Hoàng Ngọc Phương Nguyễn Thành Phước Phạm Lương Thắng Nguyễn Đức Hoàng Trần Linh Thước Phan Thị Phượng Trang Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (Bài nhận ngày 27 tháng 07 năm 2015, nhận đăng ngày 06 tháng 05 năm 2016) TÓM TẮT Các phương pháp tinh chế protein tái tổ hợp thô từ dịch tiết sẽ giúp quá trình sản xuất protein truyền thống có giá thành cao và không phù hợp tái tổ hợp trên quy mô lớn được thuận lợi và đạt khi áp dụng tinh chế protein dạng tiết với lượng hiệu quả kinh tế cao. Trong nghiên cứu này, thể tích lớn. Cellulose Binding Module 3a chúng tôi sử dụng hệ thống plasmid pHT để khảo (CBM3a) thuộc phức hệ cellulosome từ chủng sát tinh chế protein chỉ thị CelA (endoglucanase Clostridium thermocellum là một module có ái A) dung hợp với CBM3a dưới dạng tiết trên lực cao với cơ chất cellulose. Như vậy, nếu dung Bacillus subtilis WB800N. Kết quả khảo sát cho hợp protein mục tiêu với CBM3a và nhờ vào ái thấy protein CelA được tiết ra môi trường nuôi lực của CBM3a với cơ chất cellulose sẽ giúp tinh cấy và có thể tinh chế thông qua việc gắn kết của chế được protein mục tiêu với giá thành thấp. CBM3a lên cơ chất Regenerated Amorphous Các khảo sát ứng dụng CBM3a trong tinh chế Cellulose (RAC). Nghiên cứu này làm tiền đề cho protein tái tổ hợp trước đây đa phần đều thực các nghiên cứu sâu hơn về khả năng ứng dụng hiện trong hệ thống biểu hiện nội bào. Việc thu CBM3a làm đuôi tinh chế protein tái tổ hợp trên nhận protein từ dịch tiết hoặc sử dụng chế phẩm hệ thống biểu hiện B. subtilis. Từ khóa: Bacillus subtilis, Cellulose Binding Module, Clostridium thermocellum, endoglucanase A, tinh chế protein MỞ ĐẦU Để thủy phân cellulose, vi khuẩn kị khí, ưa thường có chi phí cao và hiệu suất thấp do giá nhiệt C. thermocellum sử dụng phức hệ thành của vật liệu cao và các hóa chất đắt tiền. cellulosome có cấu tạo gồm một giá đỡ CipA và Sajjad và cộng sự [3] đã chứng minh CBM3a các enzyme phụ trợ [3]. CBM3a là module thuộc dung hợp với CelA trong hệ thống biểu hiện nội protein khung CipA giúp phức hệ cellulosome bào Escherichia coli vẫn giữ được hoạt tính và có gắn vào sợi cellulose. Các biện pháp tinh chế thể bám lên cơ chất cellulose giá rẻ Regenerated protein tái tổ hợp sử dụng phổ biến hiện nay Amorphous Cellulose (RAC). Một kết quả Trang 5
2. Science & Technology Development, Vol 19, No.T3-2016 nghiên cứu khác cho thấy tinh chế protein GFP nội bào hoặc ngoại bào trong hệ thống biểu hiện dung hợp với CBM3a ở E. coli cho hiệu suất tinh B. subtilis. chế khá cao, 1 g RAC có khả năng hấp phụ 365 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP mg protein GFP dung hợp với CBM3a. Việc tách Chủng vi sinh vật, plasmid và môi trường nuôi protein tái tổ hợp ra khỏi RAC rất dễ dàng và ít cấy tốn kém bởi chất có tính hoạt động bề mặt như TM ethylene glycol hoặc glycerol [5]. Ngoài ra, cũng Chủng E. coli OmniMAX (F′ {proAB+ đã có nghiên cứu chứng minh có thể sử dụng lacIqlacZΔM15Tn10(TetR) Δ(ccdAB)} mcrAΔ CBM3-tag trong việc tinh chế protein dung hợp (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80(lacZ)ΔM15 CBM3-intein-EGFP (enhanced green fluorescent Δ(lacZYA-argF)U169endA1recA1supE44thi- protein) ở nấm men Pichia pastoris [11]. Do đó, 1gyrA96relA1tonApanD) (Invitrogen) [6] được CBM đã và đang được nghiên cứu để triển khai sử dụng làm chủng chủ trong các bước dòng hóa. ứng dụng trong sản xuất, tinh chế protein tái tổ Chủng B. subtilis WB800N đột biến loại bỏ 8 hợp đặc biệt là trên qui mô sản xuất lớn hoặc tinh protease ngoại bào được sử dụng để biểu hiện chế protein từ dịch nuôi cấy có thể tích lớn. protein mục tiêu dưới dạng tiết, giúp giảm sự phân hủy protein mục tiêu khi tiết ra môi trường Hệ thống biểu hiện ngoại bào ở B. subtilis [7]. với các ưu điểm như: (i) chủng vi sinh vật an toàn; (ii) có khả năng lên men ở mật độ cao; (iii) Plasmid pHT43 chứa trình tự tín hiệu tiết có khả năng hiệu quả tiết protein ra ngoài tế bào SamyQ của α-amylase, pHT43 không mang gen giúp dễ dàng cho việc tinh chế protein mục tiêu cbm3a và celA được sử dụng làm đối chứng âm [1, 9, 10]. Tuy nhiên, các đuôi dung hợp thường trong quá trình kiểm tra biểu hiện protein tái tổ bị chủng chủ loại bỏ, do đó chủng B. subtilis hợp. Plasmid pHT43-celA [4] (Hình 1) chứa trình WB800N với đột biến bất hoạt 8 protease ngoại tự tín hiệu tiết SamyQ và gen celA được sử dụng bào được sử dụng nhằm tăng cường hiệu quả biểu làm khung sườn để thiết kế plasmid pHT1733 hiện. Bên cạnh đó, promoter Pgrac cảm ứng cho chứa CelA dung hợp CBM3a. Ngoài ra pHT43- B. subtilis [8] được dung hợp từ promoter mạnh celA còn được dùng làm mẫu đối chứng trong groESL có nguồn gốc từ B. subtilis với lac quá trình chứng minh đặc tính gắn của CBM3a operator (lacO) từ E. coli, sử dụng chất cảm ứng lên RAC. là isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), Tế bào được nuôi cấy lắc trên môi trường cho khả năng biểu hiện protein mục tiêu lên đến Luria Broth (LB) ở 37 oC, kháng sinh được thêm 15 % protein tổng số, gấp 50 lần so với Pspac vào với nồng độ tương ứng (Ampicillin 100 [9]. Để có thể ứng dụng đặc tính bám cơ chất µg/mL đối với E. coli và Chloramphenicol 10 cellulose của CBM3a trong tinh chế protein tái tổ µg/mL đối với B. subtilis). Tế bào được trải trên hợp trên hệ thống biểu hiện B. subtilis, trong môi trường thạch chứa 0,5 % carboxymethyl nghiên cứu này CBM3a được dung hợp với cellulose (CMC) để sàng lọc khả năng tiết CelA- protein CelA nhằm khảo sát khả năng biểu hiện CBM3a. tiết của protein tái tổ hợp và nghiên cứu đặc tính Sàng lọc và biểu hiện CelA-CBM3a bám của protein tái tổ hợp CBM3a-CelA lên cơ Sàng lọc chủng có khả năng biểu hiện protein tái chất RAC. Nghiên cứu này làm tiền đề cho các tổ hợp nghiên cứu ứng dụng đuôi tinh chế CBM3a trong biểu hiện, tinh chế protein tái tổ hợp dưới dạng Chủng B. subtilis WB800N mang plasmid tái tổ hợp pHT1733 được sàng lọc trên môi trường LB-agar có bổ sung kháng sinh Chloramphenicol Trang 6
3. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T3- 2016 o và cơ chất CMC, ủ đĩa ở 30 C trong 24 giờ, 50 mM có bổ sung 10 mM CaCl2 bằng phương nhuộm đĩa với thuốc thử Congo Red. Chọn pháp DNS [4]. khuẩn lạc có khả năng biểu hiện protein tái tổ Chứng minh CelA-CBM3a biểu hiện tiết từ B. hợp thông qua vòng phân giải CMC xung quanh subtilis có khả năng bám lên cơ chất RAC khuẩn lạc. Thực hiện tương tự với mẫu đối chứng Để có thể chứng minh khả năng bám của (-) là chủng B. subtilis mang plasmid pHT43 CelA-CBM3a lên cơ chất cellulose, hút 1200 µL không biểu hiện CelA. dịch nuôi cấy có chứa protein tái tổ hợp CelA- CBM3a đã loại bỏ tế bào được ký hiệu là (S) vào AflII SphI 600 µL RAC 0,5 % pha trong đệm succinate 50 AflIII MunI mM có bổ sung 10 mM CaCl2, ủ trong đá 30 phút AhdI BsaI NheI SacI cho CelA-CBM3a bám lên RAC nhưng ức chế ColE1 Cm EcoRV hoạt tính phân cắt RAC của CelA-CBM3a. Ly Amp ApaI tâm 6.000 g trong 5 phút, thu 2 phân đoạn: phân XhoI AflIII 8000 LacI đoạn dịch nổi chỉ có CelA-CBM3a được ký hiệu pHT43-celA 2000 là (S1) và phân đoạn tủa chứa RAC và CelA- ORF-2 9404 bps PgroES CBM3a bám lên RAC được ký hiệu là (P1). Tiến ClaI 6000 SamyQ KpnI 4000 hành đo hoạt tính thủy phân CMC 0,25 % của AflIII ORF-1 dịch nuôi cấy (S) và phân đoạn dịch nổi (S1) ORF-1 dockerin type I celA SexAI bằng phương pháp DNS. Hiệu số giữa hoạt tính ORF-3 BamHI AflIII AflIII thủy phân CMC của dịch nuôi cấy (S) và phân EcoRV đoạn dịch nổi (S1) chính là hoạt tính của CelA- PstI EcoRV AatII CBM3a đã bám lên cơ chất RAC trong pha tủa SmaI AflIII (P1). Thực hiện tương tự trên mẫu đối chứng Hình 1. Sơ đồ plasmid pHT43-celA. CelA không dung hợp với CBM3a. Ngoài ra, sự hiện diện của CelA-CBM3a trong pha tủa với Biểu hiện protein tái tổ hợp CelA-CBM3a RAC (P1) và pha tan (S1) còn được xác định Chủng B. subtilis WB800N mang plasmid tái bằng phương pháp Western Blot với kháng thể sơ tổ hợp pHT1733 được nuôi cấy trên môi trường cấp là kháng thể thỏ anti-CelA và kháng thể thứ LB có bổ sung kháng sinh chloramphenicol ở 30 cấp là kháng thể anti-rabbit IgG-HRP từ thỏ, phát oC và lắc với tốc độ 250 vòng/phút, tiến hành hiện vạch lai với kháng thể bằng phản ứng tạo màu với tetramethylpentadecane (TMPD). cảm ứng biểu hiện bằng IPTG (Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside) khi OD600 đạt 0,8 với các Tinh chế CelA-CBM3a dựa trên ái lực giữa nồng độ 0,001 mM ; 0,01 mM; 0,1 mM và 1 mM. CBM3a và RAC Mẫu được thu ở 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ và 24 giờ Phương pháp thực hiện tương tự như phương sau khi cảm ứng. Thực hiện tương tự với mẫu đối pháp chứng minh hoạt tính gắn của CBM3a lên chứng âm là chủng B. subtilis WB800N mang RAC. Thể tích dịch nuôi cấy là 500 mL. Phân plasmid pHT43. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần đoạn tủa (P1) chứa RAC và CelA-CBM3a được trên 3 khuẩn lạc khác nhau. Mẫu sau khi thu được rửa 3 lần với đệm succinate 50 mM có bổ sung ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 5 phút để loại bỏ 10 mM CaCl2 để loại bỏ protein tạp. Các phân tế bào. Xác định điều kiện biểu hiện CelA- đoạn rửa được thu nhận và tủa bằng CBM3a tốt nhất dựa trên hoạt tính thủy phân cơ Trichloroacetic acid TCA 10 % (W1, W2, W3) chất CMC 0,5 % trong dung dịch đệm succinate nhằm kiểm tra mức độ rửa trôi của CelA-CBM3a Trang 7
4. Science & Technology Development, Vol 19, No.T3-2016 ra khỏi RAC. Protein CelA-CBM3a hấp phụ trên Sàng lọc và biểu hiện CelA-CBM3a bề mặt RAC được dung ly bởi glycerol 100 % Khi cấy đồng thời 2 chủng B. subtilis bằng cách huyền phù phân đoạn tủa sau khi rửa WB800N mang plasmid tái tổ hợp pHT1733 và trong đệm succinate 50 mM có bổ sung 10 mM plasmid đối chứng (-) pHT43 trên cùng một đĩa CaCl2 sao cho được thể tích 30 mL và thêm môi trường LB-Agar-Cm có bổ sung 0,25 % glycerol 100 % vào với thể tích gấp 4 lần thể tích CMC và 0,1 mM IPTG, ủ ở 30 oC trong 24 giờ, huyền phù RAC. Ly tâm 18.000 g trong 15 phút nhuộm đĩa với thuốc thử Congo Red. Kết quả và thu 2 phân đoạn: phân đoạn dịch nổi chính là trên Hình 3 cho thấy khuẩn lạc vi khuẩn mang protein CelA-CBM3a dung ly ra khỏi RAC được plasmid pHT1733 tạo vòng phân giải CMC lớn ký hiệu là (P2A); phân đoạn tủa gồm RAC và so với đối chứng (-). Chứng tỏ đã chọn lọc được một số CelA-CBM3a còn bám lại trên RAC được chủng B. subtilis WB800N mang plasmid ký hiệu là (P2R). Các phân đoạn trên được xử lý pHT1733 cho phép biểu hiện protein CelA- để thực hiện điện di SDS-PAGE và Western CBM3a dưới dạng tiết ra môi trường nuôi cấy. blot. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thiết kế plasmid tái tổ hợp pHT1733 mang gen celA dung hợp với cbm3a Plasmid pHT1733 được thiết kế từ việc chèn gen cbm3a từ C. thermocellum ATCC27405 vào plasmid pHT43-celA tại vị trí cắt của 2 enzyme Hình 3. Kết quả sàng lọc chủng có khả năng tiết cắt giới hạn BsrGIvà SmaI tạo đoạn dung hợp enzyme phân cắt CMC tạo vòng phân giải CMC. samyQ-celA-cbm3a. Vùng trình tự đoạn chèn pHT43 : khuẩn lạc B. subtilis WB800N mang plasmid cbm3a trên plasmid tái tổ hợp pHT1733 cũng đã pHT43 không biểu hiện enzyme làm mẫu đối chứng () ; pHT1733 : khuẩn lạc B. subtilis WB800N mang được kiểm tra bằng phương pháp giải trình tự và plasmid pHT1733 cho phép biểu hiện enzyme CelA- cho kết quả tương đồng 100 % với trình tự thiết CBM3a dưới dạng tiết. kế lý thuyết (Hình 2 và Hình P1 phần Phụ lục). Plasmid pHT1733 được dùng để biến nạp vào Để thu được lượng protein tái tổ hợp CelA- chủng chủ biểu hiện B. subtilis WB800N nhằm CBM3a đủ để nghiên cứu khảo sát đặc tính bám biểu hiện protein CelA-CBM3a dưới dạng tiết ra của CBM3a lên cơ chất RAC, cần khảo sát điều môi trường nuôi cấy nhờ tín hiệu tiết SamyQ. kiện cảm ứng biểu hiện phù hợp nhất cho chủng AflII B. subtilis WB800N mang plasmid pHT1733 đã SphI PciI AflIII o MunI được sàng lọc bên trên. Nhiệt độ nuôi cấy ở 30 C AhdI NheI BsaI EcoRI SacI ColE1 Cm ứng với điều kiện sản xuất được chọn để khảo sát EcoRV Amp ApaI XhoI BglII AflIII với nồng độ chất cảm ứng thay đổi 0 mM; 0,01 LacI 8000 pHT1733 2000 ORF-2 mM; 0,1 mM và 1 mM trong 6 giờ cảm ứng. Kết 9688 bps PgroES ClaI SamyQ KpnI ORF-1' 6000 4000 quả Hình 4A cho thấy hoạt tính phân giải CMC ở AflIII celA' ORF-1 SexAI CBD chủng B. subtilis WB800N mang plasmid Strep BamHI PciI ORF-3 AflIII AflIII BsrGI pHT1733 luôn cho hoạt tính phân giải CMC cao EcoRI EcoRI MunI AflIII PciI XbaI hơn mẫu đối chứng và nồng độ chất cảm ứng AatII SmaI AflIII BglII IPTG 0,1 mM là nồng độ tốt nhất cho việc cảm ứng biểu hiện CelA-CBM3a. Ở điều kiện cảm Hình 2. Sơ đồ plasmid pHT1733. ứng IPTG 0,1 mM khi thời gian cảm ứng khác Trang 8
5. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T3- 2016 nhau hoạt tính enzyme có khác nhau nhưng chủng được nuôi cấy ở 30 oC, cảm ứng bằng 0,1 không nhiều. Thời gian cảm ứng tốt nhất là 18 mM IPTG trong 18 giờ. giờ (Hình 4B). Như vậy các thí nghiệm tiếp theo, Hình 4. Khảo sát điều kiện cảm ứng biểu hiện CelA-CBM3a dạng tiết sử dụng chủng B. subtilis WB800N thông qua hoạt tính phân cắt CMC. A: Tổng đường khử (mg/mL) trung bình của 2 khuẩn lạc nuôi cấy ở 30 oC ở các nồng độ IPTG 0 đến 1 mM tại thời điểm thu mẫu sau cảm ứng 6 giờ; B: Tổng đường khử (mg/mL) trung bình của 2 khuẩn lạc nuôi cấy ở 30 oC, nồng độ IPTG 0,1 mM ở các thời điểm khác nhau. Chứng minh CelA-CBM3a biểu hiện tiết từ B. đối chứng chỉ chứa enzyme CelA giảm 21 % so subtilis có khả năng bám lên cơ chất RAC với hoạt tính enzyme trước khi ủ với RAC, hoạt Dịch nuôi cấy đã được kiểm tra không có khả tính bám của CelA lên cơ chất RAC trong trường năng thủy phân cơ chất RAC ở nhiệt độ 4 oC (kết hợp này có lẽ là do tương tác giữa enzyme và cơ quả không trình bày), đây là điều kiện để tiến chất. Trong khi đó, hoạt tính trong pha tan S1 sau hành thí nghiệm ủ dịch nuôi cấy với RAC cho khi ủ với RAC của mẫu chứa enzyme CelA- CBM3a-CelA gắn lên RAC mà không phân cắt CBM3a giảm đến 78 % so với hoạt tính enzyme RAC. Từng phân đoạn enzyme được xác định lại trước khi ủ với RAC, hoạt tính bám của CelA lên hàm lượng enzyme thông qua hoạt tính của cơ chất RAC trong trường hợp này so với mẫu enzyme trên cơ chất CMC 0,25 %. Kết quả Hình đối chứng (CelA) là do tương tác của CBM3a lên 5A cho thấy sau khi ủ với RAC, trong phân đoạn cơ chất RAC. CBM3a trong CBM3a-CelA có dịch nổi (S1) hoạt tính của cả 2 mẫu dịch tiết hoạt tính bám RAC được xác định một lần nữa chứa CelA và mẫu dịch tiết chứa CelA-CBM3a bằng phương pháp Western blot (Hình 5B). đều cho hoạt tính enzyme phân cắt CMC giảm so Kết quả Western blot trên Hình 5B cho thấy với mẫu trước khi ủ với RAC. Điều này chứng tỏ sự khác biệt rõ giữa khả năng bám của CBM3a- cả 2 loại enzyme này đều có khả năng gắn với cơ CelA lên cơ chất RAC so với trường hợp CelA chất RAC nên một số enzyme đã bị lắng xuống không dung hợp với CBM3a. Khi ủ với kháng thể cùng với RAC trong pha tủa (P1) nên làm giảm đặc hiệu với CelA, tín hiệu chỉ xuất hiện khi lượng enzyme trong pha tan (S1). Tuy nhiên hoạt protein mục tiêu là CelA hoặc phải dung hợp với tính trong pha tan S1 sau khi ủ với RAC của mẫu CelA. Do vậy, phân đoạn dịch nổi sau khi ủ với Trang 9
6. Science & Technology Development, Vol 19, No.T3-2016 RAC (S1) và phân đoạn tủa sau khi ủ với RAC (P1) của mẫu chứa CelA và CBM3a-CelA đều (P1) của mẫu đối chứng âm (-) không chứa CelA cho tín hiệu lai trên màng lai. Tuy nhiên, tín hiệu đều không cho tín hiệu với kháng thể kháng CelA lai rất khác biệt giữa 2 phân đoạn của 2 mẫu này. (Hình 5B, (-)). Kết quả này cho thấy kháng thể Đối với mẫu chứa CelA tín hiệu lai xuất hiện đều kháng CelA không bắt chéo với bất kỳ protein trên cả 2 phân đoạn S1 và P1, trong khi mẫu chứa nào khác tiết ra từ chủng B. subtilis WB800N. CBM3a-CelA tín hiệu lai hầu như chỉ xuất hiện Trong khi đó, phân đoạn dịch nổi sau khi ủ với trong phân đoạn tủa với RAC (P1) và tín hiệu rất RAC (S1) và phân đoạn tủa sau khi ủ với RAC thấp trong phân đoạn dịch nổi S1. A B Trước khi ủ với RAC Sau khi ủ với RAC 100% 79% 80% 60% 40% 22% 20% 0% CelA CBM3a-CelA Hình 5. Chứng minh tính bám của CelA-CBM3a biểu hiện tiết từ B. subtilis lên cơ chất RAC. (A) độ giảm hoạt tính phân giải CMC (%) của dịch nuôi cấy chứa enzyme sau khi ủ với RAC so với mẫu trước khi ủ với RAC; (B) Western blot với kháng thể kháng CelA; M: thang protein chuẩn; S1: phân đoạn dịch nổi của dịch nuôi cấy sau khi ủ với RAC; P1: phân đoạn tủa chứa RAC và enzyme bám với RAC sau khi ủ dịch nuôi cấy với RAC; (-) mẫu đối chứng âm không chứa enzyme CelA cũng như CBM3a. Như vậy, tương tác giữa CelA và RAC ngặt để đạt được độ tinh sạch cao của protein không bền chặt như trường hợp CelA-CBM3a. mục tiêu sau tinh chế hay không thì cần được Do CelA chỉ liên kết với cơ chất để thực hiện chứng minh qua thử nghiệm tinh chế protein tái phản ứng, còn CelA-CBM3a ngoài tương tác tổ hợp CelA-CBM3a bằng các hạt RAC. Kết quả giữa CelA và RAC còn có tương tác của CBM3a SDS-PAGE và Western blot trên Hình 6B cho gắn chuyên biệt và hiệu quả với cơ chất RAC. thấy, so với dịch nuôi cấy trước khi ủ RAC (S) Tinh chế CelA - CBM3a dựa trên ái lực giữa thì lượng protein CelA và CBM3a-CelA giảm đi CBM3a và RAC nhiều so với phân đọan dịch nổi sau khi ủ với RAC (S1). Trong đó, ở giếng S1 của dịch nuôi CBM3a đã được chứng minh có thể liên kết cấy chứa CBM3a-CelA hầu như không phát hiện mạnh với cơ chất RAC, tuy nhiên tương tác này protein mục tiêu. Chứng tỏ protein mục tiêu đã có dễ dàng để ứng dụng trong tinh chế trực tiếp gắn hoàn toàn lên RAC. Trong khi giếng S1 của protein tái tổ hợp từ dịch nuôi cấy thể tích lớn và dịch nuôi cấy chứa CelA thì vẫn cho tín hiệu lai liên kết này có đủ bền để đảm bảo độ bám dính rõ. của protein mục tiêu qua những bước rửa nghiêm Trang 10
7. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T3- 2016 Ở các phân đoạn rửa (W1, W3), chỉ có mẫu chứa CBM3a-CelA, mà chỉ xuất hiện vạch lai chứa CelA cho tín hiệu lai với kháng thể kháng trong phân đoạn dung ly (S2A) và phân đoạn tủa CelA trong tất cả các phân đoạn rửa. Như vậy, RAC còn lại sau dung ly (P2R). Như vậy, CelA tuy có khả năng gắn lên RAC nhưng sự liên CBM3a giúp cho protein tái tổ hợp CelA-CBM3a kết này không chặt chẽ (tương tác enzyme-cơ bám rất chặt và đặc hiệu lên cơ chất RAC. Vì thế, chất trong phản ứng) nên CelA dễ dàng bị tách CBM3a có thể ứng dụng trong tinh chế protein khỏi RAC trong quá trình rửa. Ngược lại, tín hiệu tái tổ hợp. lai không xuất hiện ở các phân đoạn rửa của mẫu A B Hình 6. Kết quả thí nghiệm chứng minh khả năng ứng dụng đuôi CBM3a trong tinh chế protein tái tổ hợp trên cơ chất RAC.(A) Kết quả SDS-PAGE và (B) Western blot với kháng thể kháng CelA; M: thang protein chuẩn; S: phân đoạn dịch nuôi cấy trước khi ủ với RAC; S1: phân đoạn dịch nổi sau khi ủ với RAC; W1, W3: các phân đoạn sau khi rửa; S2A: phân đoạn protein được dung ly ra khỏi RAC trong glycerol; P2R: phân đoạn protein còn bám lại trên RAC sau khi dung ly bằng glycerol. KẾT LUẬN Nghiên cứu này đã tạo được plasmid tái tổ hợp với quy mô lớn, đặc biệt là protein tái pHT1733 mang đoạn gen cbm3a dung hợp với tổ hợp tiết ra môi trường nuôi cấy với thể tích celA. Protein tái tổ hợp CBM3a-CelA đã được lớn. Tuy nhiên, để ứng dụng đuôi tinh chế biểu hiện dưới dạng tiết có hoạt tính thủy phân CBM3a cho hệ thống biểu hiện tinh chế protein cellulose vô định hình, đặc biệt là đuôi dung hợp tái tổ hợp trên B. subtilis cần có nhiều khảo sát CBM3a có ái lực cao với cơ chất RAC. Đây là tiếp theo trên các protein chỉ thị khác cũng như tiền đề có ý nghĩa trong việc xây dựng phương hệ thống biểu hiện nội bào và ngoại bào. pháp tinh chế protein tái tổ hợp thông qua đuôi Lời cảm ơn: Một phần nghiên cứu của đề tinh chế CBM3a trên cơ chất RAC, nhằm giảm tài này được tài trợ bởi Đại học Quốc gia Tp. Hồ chi phí và đơn giản hóa quá trình sản xuất protein Chí Minh, mã số đề tài: C2014-18-19. Trang 11
8. Science & Technology Development, Vol 19, No.T3-2016 Using cellulose binding module of CBM3A as the purification tag for secreted Endoglucanase A (CelA) in Bacillus subtilis Nguyen Hoang Ngoc Phuong Nguyen Thanh Phuoc Pham Luong Thang Nguyen Duc Hoang Tran Linh Thuoc Phan Thi Phuong Trang University of Science, VNU-HCM ABSTRACT Traditional methods of recombinant protein extracellular Bacillus subtilis WB800N purification are uneconomic and inconvenient to expression system to investigate the CBM3a-tag the secreted proteins at large-volume. CBM3a, a fused with endoglucanase CelA into plasmid module from cellulosome’s scaffoldin of pHT. The results indicated that protein CelA was Clostridium thermocellum, directs the binding of secrected and purified by CBM3a-tag binding on the cellulase complex on the cheap cellulose the Regenerated Amorphous Cellulose (RAC) substrate. Most of previous studies about CBM3a subtrate. This can be used for further fused with cellulases as the purification tag were improvement in protein purification tag conducted in intracellular Escherichia coli designing. system. In this research, we used the Key words: Bacillus subtilis, Cellulose Binding Module, Clostridium thermocellum, endoglucanase A, protein purification TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. C.R. Harwood, Bacillus subtilis and its carbohydrates, Annu Rev Biochem, 79, relatives: molecular biological and 655-681 (2010). industrial workhorses, Trends Biotechnol, [4]. T.K. Ghose, Measurement of cellulase 10, 247-256 (1992). activities, Pure and Applied Chemistry, [2]. M. Sajjad, M.I. Mahmood Khan, R. Zafar, 59, 2, 12 (1987). S. Ahmad, U. Niazi, M.W. Akhtar, [5]. J. Hong, X. Ye, Y. Wang, Y.H. Zhang, Influence of positioning of carbohydrate Bioseparation of recombinant cellulose- binding module on the activity of binding module-proteins by affinity endoglucanase CelA of Clostridium adsorption on an ultra-high-capacity thermocellum, J Biotechnol, 161, 3, 206- cellulosic adsorbent, Anal Chim Acta, 621, 212 (2012). 2, 193-199 (2008). [3]. C.M. Fontes, H.J. Gilbert, Cellulosomes: [6]. H.D. Nguyen, T.T. Phan, W. Schumann, highly efficient nanomachines designed to Analysis and application of Bacillus deconstruct plant cell wall complex subtilis sortases to anchor recombinant Trang 12
9. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T3- 2016 proteins on the cell wall, AMB Express, 1, [9]. W. Schumann, Production of recombinant 1, 22 (2011). proteins in Bacillus subtilis, Adv Appl [7]. T.T. Phan, H.D. Nguyen, W. Schumann, Microbiol, 62, 137-189 (2007). Novel plasmid-based expression vectors [10]. W. Wan, D. Wang, X. Gao, J. Hong, for intra- and extracellular production of Expression of family 3 cellulose-binding recombinant proteins in Bacillus subtilis, module (CBM3) as an affinity tag for Protein Expr Purif, 46, 2, 189-195 (2006). recombinant proteins in yeast, Appl [8]. M. Schallmey, A. Singh, O.P. Ward, Microbiol Biotechnol, 91, 3, 789-798 Developments in the use of Bacillus (2011). species for industrial production, Can J Microbiol, 50, 1, 1-17 (2004). Trang 13
10. Science & Technology Development, Vol 19, No.T3-2016 PHỤ LỤC Hình P1. Kết quả giải trình tự plasmid pHT1733 bằng mồi ON314 nằm ngoài đoạn gene cbm3a dung hợp ở đầu 3’ của gene celA. Trang 14