Nghiên cứu xác định đồng thời Cytidine 5’-Monophosphate Disodium và Uridine 5’- Monophosphate Disodium trong thuốc tiêm đông khô bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Nội dung text: Nghiên cứu xác định đồng thời Cytidine 5’-Monophosphate Disodium và Uridine 5’- Monophosphate Disodium trong thuốc tiêm đông khô bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1. Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học - Tập 20, số 3/2015 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI CYTIDINE 5’-MONOPHOSPHATE DISODIUM VÀ URIDINE 5’- MONOPHOSPHATE DISODIUM TRONG THUỐC TIÊM ĐÔNG KHÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Đến tòa soạn 25 – 5 – 2015 Trần Đình Khải Công ty dược trang thiết bị y tế Bình Định Cao Văn Hoàng Khoa Hóa học trường Đại học Quy Nhơn Dương Thị Tú Anh Khoa Hóa học - trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên SUMMARY STUDY ON THE SIMULTANEOUS DETERMINE CYTIDINE 5’- MONOPHOSPHATE DISODIUM AND URIDINE 5’- MONOPHOSPHATE DISODIUM IN THE LYOPHILIZED INJECTION BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) METHOD A method is described for the determination of cytidine 5’-monophosphate disodium (CMP) and uridine 5’-monophosphate disodium (UMP) in the lyophilized injection by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The optimal condition for the determination of (CMP) and (UMP) were found: The mobile phase composition KH2PO4(0,01M): H2O was (95:5); the flow rate of the mobile phase was 1mL/min, the column oven was maintained at 260C. Under suitable conditions, the method gained high reproducibility of the CMP and UMP peak current: RSD = 2% (n=6), and low limit of detection ( 3 ): 0.01ppm for the CMP and UMP, and recoveries for the CMP and UMP are in the range of 99,0% to 100,4%. The developed approach is applied for the determination of the trace amounts of the CMP and UMP in the lyophilized injection in Vietname. 1. MỞ ĐẦU phức chất lipid và lipoprotein lập thành Cytidine 5’-monophosphate disodium phần cấu tạo hệ thống thần kinh; uridine (CMP) là hoạt chất cần thiết cho tổng hợp 5’monophosphate disodium (UMP) là 258
2. nguồn cung cấp năng lượng và có tác động urindine 5’- monophosphate disodium dinh dưỡng mô thần kinh và sợi cơ bổ sung trong thuốc tiêm đông khô bằng phương pháp cho tác động của CMP và UMP giúp tái tạo sắc ký lỏng hiệu năng cao. thần kinh ngoại biên [1,2,3]. Trong trường 2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ hợp thoái hóa thần kinh, xảy ra tình trạng 2.1. Hóa chất hủy men myelin thì sự tổng hợp proteolipid -Các hóa chất sử dụng là loại tinh khiết cần cho quá trình tái tạo lại myelin. Trong dùng cho HPLC của Merck (Đức), Sigma những trường hợp này, CMP và UMP giúp Aldrich: KH2PO4, tái tạo sợi trục và màng của sợi trục thần -Tráng rửa dụng cụ bằng nước cất 2 lần. kinh. CMP làm trung gian cho quá trình -Chất chuẩn: CMP (hàm lượng 99,90%) tổng hợp các lipid phức tạp là một thành của hãng Sigma Aldrich, Mỹ; Lô: phần cấu tạo màng tế bào thần kinh, đặc 041M0146V. UPM (hàm lượng 99,30%) biệt sphingomyelin, tiền chất lớp bao của hãng Sigma Aldrich, Mỹ; myelin. CMP cũng là tiền thân của các acid 2.2. Thiết bị và dụng cụ nucleic (ADN và ARN), là yếu tố cơ bản -Hệ thống HPLC Series 20A và các phụ của sự chuyển hóa tế bào như trong quá kiện đi kèm của hãng Shimadzu, Nhật Bản; trình tổng hợp protein [4,5,6,7]. UMP tác cột sắc ký pha đảo C18, 250 x 4,6 mm (dài động như coenzyme trong quá trình tổng x đường kính trong); kích thước hạt nhồi 5 hợp glycolipid của cấu trúc neuron và lớp μm; Hãng Merck, Đức. bao myelin, bổ sung hoạt động của CMP. - Máy UV - Vis 8453 Agilent và các phụ kiện Với vai trò quan trọng của CMP và UMP, đi kèm của hãng Agilent, Nhật Bản; việc nghiên cứu qui trình xác định hàm - Cân phân tích HM202 ( 0,01 mg) của lượng của chúng rất quan trọng. hãng AND, Nhật Bản; Hiện nay, trên thị trường ở nước ta, đang - Bộ lọc hút chân không; màng lọc thuỷ lưu hành một số loại thuốc chứa đồng thời tinh 0,45 µm; 2 hoạt chất CMP và UMP, nhưng cho đến - Các thiết bị khác: tủ sấy, máy lắc, bếp nay, quy trình bào chế các loại thuốc đó chưng cách thủy, máy cất nước hai lần, chưa được đưa ra trong các Dược điển Việt thiết bị lọc nước siêu sạch, phễu Buchner Nam, Dược điển Anh, Mỹ và Châu Âu. Mặt - Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức các khác, quy trình phân tích riêng và phân tích loại, pipet vạch và pipet bầu các loại, cốc đồng thời CMP và UMP cũng chưa được mỏ, syranh lọc mẫu, micropipet các loại công bố trong các dược điển nói trên. Rõ (0,5-10 L, 10-100 L, 100-1000 L, ) ràng, để phục vụ công tác kiểm nghiệm 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN dược phẩm, việc nghiên cứu xây dựng quy 3.1. Xác định bước sóng phát hiện trình phân tích riêng và đặc biệt là phân tích Tiến hành đo độ hấp thụ quang (Abs) đồng thời 2 hoạt chất trên trong các loại của dung dịch chuẩn CMP và UMP trong thuốc là rất cấp thiết. Bài báo này trình bày dải bước sóng (λ) 190 - 300 nm, thu được kết quả nghiên cứu xác định đồng thời kết quả ở hình 1. Kết quả cho thấy, CMP và cytidine 5’-monophosphate disodium và 259
3. UPM có độ hấp thụ cực đại tương ứng ở thể sử dụng một bước sóng mà tại đó độ bước sóng 269 nm và 262 nm. hấp thụ quang (Abs) của 2 chất đều đủ lớn. Khi sử dụng detector DAD, có thể chọn Hình 1 cho thấy, khoảng bước sóng thích một bước sóng (mà tại đó phổ của các chất hợp là 262 – 269 nm. Trong khoảng bước phân tích xen phủ nhau) để định lượng sóng đó, bước sóng 262 nm được chọn cho đồng thời các chất. Do không có bước sóng các thí nghiệm tiếp theo. cực đại chung cho 2 chất nêu trên, nên có (a) (b) (c) Hình.1. Phổ UV - Vis của dung dịch chuẩn CMP (trong nước) (a); dung dịch chuẩn UMP (trong nước) (b) và dung dịch hỗn hợp 2 chất chuẩn (c) Để thu được những kết quả rõ nét hơn, UV-Vis 2D của 2 chất chuẩn CMP và chúng tôi tiến hành ghi phổ UV-Vis 3D của UMP. Ở phổ 3D cho thấy các dải phổ rất dung dịch chuẩn CMP và dung dịch chuẩn bé, đỉnh pic rất cao và nhọn, điều đó cho UMP. Kết quả được thể hiện trên hình 2.a phép xác định bước sóng cực đại chính xác và 2.b: hơn so với phổ UV-Vis 2D. Kết quả phân tích cho thấy bước sóng cực đại cũng giống với bước sóng cực đại ở phổ Hình 2.a. Phổ UV - Vis 3D Hình2.b. Phổ UV - Vis 3D của dung dịch chuẩn CMP của dung dịch chuẩn UMP 3.2. Ảnh hưởng của thành phần pha động hợp KH2PO4 0,01M và nước. Pha động với Trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ nghiên 3 hệ có tỉ lệ thể tích thành phần 1 (KH2PO4 cứu thành phần pha động là dung dịch hỗn 0,01 M) : thành phần 2 (nước) khác nhau: 260
4. (a) Dung dịch KH2PO4 0,01 M : nước = (b) Dung dịch KH2PO4 0,01 M : nước = 90:10 100 : 0 (c) Dung dịch KH2PO4 0,01 M : nước = 95:05 (a) (b) (c) Hình 3. Thành phần pha động với tỷ lệ khác nhau của dung dịch Kali dihydro phosphatee 0,01 M và nước Kết quả hình 3 cho thấy: ứng là 0,886 và 1,452) và do vậy, cũng - Hệ dung môi (a) (KH2PO4 0,01 M : nước gây khó khăn cho định lượng. = 100 : 0) tách được hoàn toàn 2 pic với hệ - Hệ dung môi (c) ( KH2PO4 0,01M : nước = số đối xứng tốt (T 26.000). Tuy nhiên, do đường hoàn toàn với hệ số đối xứng tốt (T 2 ), số đĩa lý giảm độ phân giải các pic, dẫn đến độ tách thuyết lớn (N > 23.000 ) điều này đạt yêu 2 pic chưa tốt (độ phân giải pic nhỏ với R cầu cho phân tích định lượng. Vì vậy, hệ 20.000). Tuy nhiên hệ dòng pha động (u) với các tốc độ khác dung môi này cho ra 2 pic có độ đối xứng nhau: 1,0 mL/phút; 1,5 mL/phút và 1,6 kém với hệ số đối xứng lệch nhiều so với mL/phút, thu được kết quả ở bảng 1. giá trị 1 (T đối với CMP và UMP tương Bảng 1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động (*) Tốc độ pha Chất phân tích Thông số động (u) CMP UMP Thời gian lưu, phút 3,25 3,94 Hệ số đối xứng 0,995 1,132 1,0 mL/phút Độ phân giải - 2,89 Số đĩa LT 23149 25808 Thời gian lưu, phút 3,01 3,62 1,5 mL/phút Hệ số đối xứng 0,989 1,125 261
5. Tốc độ pha Chất phân tích Thông số động (u) CMP UMP Độ phân giải - 1,48 Số đĩa LT 24149 24808 Thời gian lưu, phút 2,89 3,48 Hệ số đối xứng 0,995 1,118 1,6 mL/phút Độ phân giải - 1,35 Số đĩa LT 24215 24325 (*) ĐKTN: CMP 0,5000 mg/mL; UMP 0,3000 mg/mL; thành phần pha động: KH2PO4 0,01M : Nước = 95 : 5; Các ĐKTN khác như ở ĐKTN (1)( ) 3.4. Khoảng tuyến tính, giới hạn phát giữa diện tích pic (A) và nồng độ chất phân hiện và giới hạn định lượng của phương tích (C) có tương quan tuyến tính tốt với R ≥ pháp HPLC 0,999. Do nồng độ CMP và UMP trong các Kết quả khảo sát tương quan tuyến tính mẫu thuốc thực tế (đang sử dụng trên thị giữa diện tích pic (A) và nồng độ chất phân trường hiện nay) thường dao động trong tích (C) trong dung dịch chuẩn chứa hỗn khoảng nồng độ trên, nên các đường chuẩn ở hợp 2 chất phân tích, thu được ở bảng 2 và hình 5 được sử dụng để định lượng CMP và hình 4 cho thấy: UMP trong các mẫu thực tế. Trong khoảng nồng độ 0,25 - 0,8 mg/mL đối với CMP và 0,15 - 0,48 mg/mL đối với UMP, Hình 4. Đường hồi quy tuyến tính của CMR (a) và UMP (b) Tiến hành xác định giới hạn phát hiện (LOD) LOD. Đường hồi quy tuyến tính được xây của phương pháp HPLC dùng detector DAD dựng trong khoảng nồng độ hẹp của CMP theo quy tắc 3σ [4], [5], giới hạn định lượng (0,25 - 0,8 mg/mL) và UMP (0,15 – 0,48 (LOQ) của phương pháp theo quy tắc 10σ [5], mg/mL). Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn [6] và áp dụng hồi quy tuyến tính để tính toán định lượng như sau: 262
6. Bảng 2. Kết quả xác định LOD và LOQ của CMP và UMP Chất Nồng độ (C), Diện tích pic Phương trình hồi quy tuyến LOD LOQ phân tích mg/mL (A), mAU tính, hệ số tương quan r và S mg/L mg/L 0,2500 4.204.808 0,4000 7.207.693 A = 22608064C-1618161 CMP r = 0,9993 0,01 0,03 0,5000 9759969 0,6000 11.800.148 S = 39 0,8000 16.587.137 0,1500 3.103.886 0,2400 4.966.218 A = 20215372 C + 98406 UMP 0,3000 6.192.720 r = 1,00 0,01 0,03 0,3600 7.372.913 S = 70 0,4800 9.785.813 Như vậy, phương pháp HPLC với detector đang lưu hành trên thị trường tỉnh Bình DAD đạt được LOD khá thấp đối với cả 2 Định, gồm 2 mẫu thuốc viên nang chất CMP và UMP (LOD đối với cả 2 chất (LEOLEN Forte, Nucleo CMP) và một mẫu đều là 0,01 ppm) khi xác định đồng thời thuốc đông khô (ALTON CMP), thu được chúng trong hỗn hợp. kết quả ở bảng 3 và 4. 3.5. Áp dụng thực tế Áp dụng các điều kiện nghiên cứu trên cho việc phân tích một số mẫu dược phẩm Bảng 3. Kết quả phân tích CMP trong một số mẫu thực tế (*) Khoảng tin cậy Hàm lượng (mg/đơn Hàm lượng 95% Mẫu vị đóng gói ) ɛ (95%) CMP trên (mg - mg) nhãn (mg) xi xtb 4,96 LEOLEN Forte 5,04 4,99 ± 0,11 5 4,88 - 5,10 4,97 4,99 Núcleo CMP 5,01 5,00 ± 0,03 5 4,97 - 5,03 5,01 9,94 ALTON CMP 10,05 9,98 ± 0,15 10 9,82 - 10,13 9,94 (* đối với mỗi mẫu, tiến hành 3 phép phân tích lặp lại (n = 3); xi – các kết quả riêng lẻ; xtb – kết quả trung bình; ɛ - biên giới tin cậy 95%; khoảng tin cậy 95% = xtb - ɛ đến xtb + ɛ. ɛ = 1/2 t(0,95;f = n – 1 = 2)×S/(n) ; trong đó, t là chuẩn student ở độ tin cậy 95% và bậc tự do f; S là độ lệch chuẩn; n (số phép đo lặp lại) = 3. 263
7. Bảng 4. Kết quả phân tích UMP trong một số mẫu thực tế (*) Kết quả định lượng ɛ với Hàm uridine 5’-monophosphate khoảng lượng Tên mẫu disodium (mg/ đơn vị đóng xtb - ɛ xtb + ɛ tin cậy trên nhãn gói ) 95% (mg) xi xtb 2,99 LEOLEN 3,04 3,01 ± 0,0691 3 2,9375 3,0757 Forte 2,99 3,01 Núcleo CMP 3,02 3,02 ± 0,0161 3 2,9992 3,0313 3,02 6,00 ALTON CMP 6,06 6,01 ± 0,0952 6 5,9174 6,1078 5,99 (*)đối với mỗi mẫu, tiến hành 3 phép phân tích lặp lại (n = 3); xi – các kết quả riêng lẻ; xtb – kết quả trung bình; ɛ - biên giới tin cậy 95%; khoảng tin cậy 95% = xtb - ɛ đến xtb + ɛ; ɛ như ở bảng 3 Kết quả ở bảng 3 và 4 cho thấy, hàm lượng với phép phân tích đồng thời 2 chất CMP ghi trên nhãn của hai hoạt chất CMP và và UMP trong hỗn hợp. UMP là tin cậy, do hàm lượng đó nằm + Đã xác định được khoảng tuyến tính, giới trong khoảng tin cậy 95% của hạn phát hiện và giới hạn định lượng của hàm lượng xác định được bằng phương pháp phương pháp HPLC đối với phép phân tích HPLC. đồng thời 2 chất CMP và UMP trong hỗn Các kết quả trên cũng cho phép khẳng định hợp thông qua mẫu chuẩn CMP và UMP rằng, hoàn toàn có thể áp dụng quy trình của hãng Sigma Aldrich, Mỹ; phân tích xây dựng được để phân tích đồng + Đã áp dụng các điều kiện thí nghiệm thời 2 chất CMP và UMP trong các mẫu khảo sát được vào việc phân tích một số dược phẩm. mẫu dược phẩm đang lưu hành trên thị 4. KẾT LUẬN trường tỉnh Bình Định, gồm 2 mẫu thuốc + Đã tiến hành xác định được bước sóng viên nang (LEOLEN Forte, Nucleo CMP) phát hiện CMP và UMP theo phương pháp và một mẫu thuốc đông khô (ALTON HPLC lần lượt là 269 nm và 262 nm. CMP) cho kết quả tốt. + Đã khảo sát được ảnh hưởng của thành (xem tiếp trang 285) phần pha động và tốc độ dòng pha động đối 264