Luận văn Đánh giá chất lƣợng và khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn Hà Giang

Nội dung text: Luận văn Đánh giá chất lƣợng và khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn Hà Giang

1. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGÔ VĂN DƢƠNG ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA CẠN HÀ GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGÔ VĂN DƢƠNG ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA CẠN HÀ GIANG Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN LAM ĐIỀN Thái Nguyên - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố. Tác giả Ngô Văn Dƣơng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4. LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Lam Điền đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin cảm ơn KTV Cao Phƣơng Thảo (phòng Thực vật học), KTV Đào Thu Thủy (phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào), CN Nguyễn Ích Chiến (phòng thí nghiệm Di truyền học và Công nghệ gen), Khoa Sinh- KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên) đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm và các thầy cô giáo, cán bộ khoa sinh - KTNN, Ban giám hiệu Trƣờng THPT Bắc Sơn, Sở GD&ĐT Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian làm luận văn. Tác giả luận văn Ngô Văn Dƣơng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5. MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU . 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây lúa 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây lúa 3 1.1.2. Giá trị kinh tế của cây lúa 4 1.1.3. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và ở Việt Nam . 5 1.1.4. Thành phần hoá sinh của hạt lúa 10 1.1.5. Đặc điểm sinh học của cây lúa cạn 11 1.2. Hạn và cơ chế chịu hạn của thực vật 13 1.2.1. Khái niệ m về hạ n . 13 1.2.2. Tính chịu hạn và tác động của hạn đến thực vật 14 1.2.3. Cơ sở sinh lý , sinh hoá và di truyề n củ a tí nh chị u hạ n ở cây lú a . 16 1.2.4. Nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây lúa 21 1.3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thức vật vào việc đánh giá khả năng chống chịu ở cây lúa 22 1.3.1. Hệ thố ng nuôi cấ y 22 1.3.2. Mộ t số thành tựu về đá nh giá khả năng chố ng chị u và chọn dòng tế bào soma bằ ng kỹ thuậ t nuôi cấ y in vitro 23 Chƣơng 2. VẬ T LIỆ U VÀ PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U 2.1. Vậ t liệ u và đị a điể m nghiên cƣ́ u 25 2.1.1. Vật liệu thực vật 25 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 25 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu 26 2.2. Phƣơng phá p nghiên cƣ́ u 27 2.2.1. Phƣơng pháp phân loại các giống lúa cạn 26 2.2.2. Phƣơng phá p hó a sinh 26 2.2.3. Đá nh giá khả năng chị u hạ n ở giai đoạ n mạ bằ ng phƣơng phá p gây hạ n 29 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6. nhân tạ o 2.2.4. Phƣơng phá p nuôi cấ y in vitro . 31 2.2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu và tính toán kết quả 33 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân loạ i, đặ c điể m hì nh thá i củ a cá c giố ng lú a 34 3.1.1. Phân loạ i cá c giố ng lú a 34 3.1.2. Đặc điểm hình thái các giống lúa 35 3.2. Đá nh giá chấ t lƣợ ng hạ t . 37 3.2.1. Đá nh giá chấ t lƣợ ng hạ t trên phƣơng diệ n cả m quan . 37 3.2.2. Đá nh giá chấ t lƣợ ng hạ t trên phƣơng diệ n hó a sinh 38 3.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lúa 42 3.3.1. Khả năng chịu hạn của các giống ở giai đoạn nảy mầm 42 3.3.2. Khả năng chịu hạn của các giống ở giai đoạn mạ 51 3.4. Khả năng chịu han của các giống lúa nghiên cứu ở giai đoạn mô sẹo 59 3.4.1. Thăm dò khả năng tạo mô sẹo, tốc độ sinh trƣởng và khả năng tái sinh của các giống lúa nghiên cứu 59 3.4.2. Độ mất nƣớc của mô sẹo 60 3.4.3. Khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo 61 3.4.4. Tốc độ sinh trƣởng của mô sẹo sau khi sử lý thổi khô 62 3.4.5. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo sau khi xử lý thổi khô 63 3.4.6. Xác định nhanh sức sống của tế bào mô sẹo bằng phƣơng pháp nhuộm TTC 64 KẾ T LUẬ N VÀ ĐỀ NGHỊ . 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7. DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Diện tích, năng xuất và sản lƣợng lúa của toàn Thế giới giai đoạn từ 1970 đến 2007 6 Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lƣợng lúa của 10 nƣớc có sản lƣợng lúa hàng đầu thế giới năm 2007 7 Bảng 1.3. Tình hình sản xuất và xuất khẩu lúa gạo của Việt Nam giai đoạn 1990 – 2007 9 Bảng 2.1. Các giống lúa cạn sử dụng làm vật liệu nghiên cứu 25 Bảng 3.1. Phân loại các giống lúa nghiên cƣ́ u 34 Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái và khối lƣợng 1000 hạt của các giống lúa 35 Bảng 3.3. Mộ t số chỉ tiêu chấ t lƣợ ng hạ t củ a các giống lúa 37 Bảng 3.4. Hàm lƣợng protein, đƣờ ng tan củ a cá c giố ng lú a (% khố i lƣợ ng khô) 39 Bảng 3.5. Hàm lƣợng axit amin dƣ̣ trƣ̃ trong hạt của các giống lúa (g axit amin /100g mẫ u) 40 Bảng 3.6. Thành phần và lƣợng axit amin trong protein hạt của các giống lúa (g axit amin/ 100g protein) 41 Bảng 3.7. Thành phần và hàm lƣợng các axit amin không thay thế trong hạ t củ a các giống lúa (g axit amin/ 100g protein) 41 Bảng 3.8. Hoạt độ của -amylase trong giai đoạ n hạ t nả y mầ m khi xƣ̉ lý sorbitol 5% ( ĐVHĐ/mg hạ t nả y mầ m) 43 Bảng 3.9. Hàm lƣợng đƣờng tan của các giố ng lú a khi xƣ̉ lý sorbitol 5% ở giai đoạ n nả y mầ m(%) . 45 Bảng 3.10. Tƣơng quan giƣ̃ a hoạ t đô enzyme α-amylase vớ i hà m lƣợ ng đƣờ ng tan của các giống lúa 46 Bảng 3.11. Hoạt độ protease củ a cá c giố ng lú a khi xƣ̉ lý sorbitol 5% ở giai đoạ n nảy mầm (ĐVHĐ/mg) 47 Bảng 3.12. Hàm lƣợng protein của cá c giố ng lú a giai đoạ n nả y mầ m khi xƣ̉ lý 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8. sorbitol 5 % (%) Bảng 3.13. Tƣơng quan giƣ̃ a hoạ t độ protease vớ i hà m lƣợ ng protein tan ở giai đoạ n nảy mầm của các giống lúa . 50 Bảng 3.14. Tỷ lệ thiệt hại do hạn của các giống lúa ở giai đoạn mạ (%) . 52 Bảng 3.15. Khả năng giữ nƣớc của các giống lúa (%) . 53 Bảng 3.16. Chiề u dà i rễ tạ i cá c thờ i điể m gây hạ n củ a cá c giố ng lú a ở giai đoạn mạ (cm) 54 Bảng 3.17. Chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các giống lúa ở giai đoạn mạ 56 Bảng 3.18. Hàm lƣợng proline của các giống lúa ở giai đoạn mạ (mM/g khố i lƣợ ng tƣơi) . 58 Bảng 3.19. Thăm dò khả năng tạo mô sẹo, tốc độ sinh trƣởng và khả năng tái sinh của 5 giống lúa 60 Bảng 3.20. Kiểm tra sức sống của các giống lúa cạn bằng phƣơng pháp nhuộm TTC 64 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9. DANH MỤC HÌNH Trang Hình 3.1. Hình thái hạt của các giống lúa nghiên cứu . 36 Hình 3.2. Hàm lƣợng axit amin không thay thế của các giống lúa nghiên cứu vớ i tiêu chuẩ n củ a FAO . . 42 Hình 3.3. Sự biến động hoạt độ enzyme α-amylase củ a cá c giố ng lú a . 44 Hình 3.4. Đị nh tí nh hoạ t độ enzyme α-amylase củ a cá c giố ng lú a 44 Hình 3.5. Sự biến động hàm lƣợng đƣờng tan các giống lúa ở giai đoạn nảy 45 mầ m Hình 3.6. Sự biế n độ ng hoạ t độ củ a enzyme protease củ a cá c giố ng 47 lúa . Hình 3.7. Ảnh định tính hoạt độ enzyme protease của các giống lúa 48 Hình 3.8. Hàm lƣợng protein các giống lúa ở giai đoạn nảy mầm 49 Hình 3.9. Tỷ lệ thiệ t hạ i do hạ n củ a cá c giố ng lú a ở giai đoạn mạ 52 Hình 3.10. Chiề u dà i rễ củ a cá c giố ng lú a ở giai 7 ngày hạn . 54 Hình 3.11. Đồ thị hình rada biểu thị khả năng chịu hạn của các giống lúa ở giai đoạn mạ 55 Hình 3.12. Ảnh các giống lúa trƣớc và sau 5 ngày gây hạn ở giai đoạn mạ 57 Hình 3.13. Sự biến động hàm lƣợng proline ở giai đoạn mạ của các giống lúa 58 Hình 3.14. Tốc độ mất nƣớc của mô sẹo các giống lúa sau khi xử lý thổi khô . 60 Hình 3.15. Khả năng sống sót của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô (%) . 62 Hình 3.16. Tốc độ sinh trƣởng tƣơng đối của mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy 62 Hình 3.17. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo sau khi xử lý thổi khô 63 Hình 3.18. Đánh giá khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo các giống lúa cạn 64 Hình 3.19. Khả năng phục hồi và tái sinh sau thổi khô của các giống lúa cạn ở mức độ mô sẹo . 65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
10. CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic Acid ATPaza Adenosin triphosphatase (Enzym phân giải ATP giải phóng năng lƣợng) ADN Deoxyribose Nucleic Acid AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Tính đa hình chiều dài các phân đoạn đƣợc nhân bản) ASTT Áp suất thẩm thấu 2,4D Axit 2,4 – Dichlorphenoxyacetic cADN Complementary ADN (ADN bổ sung đƣợc tổng hợp nhờ enzym phiên mã ngƣợc từ ARN thông tin) CS Cộng sự CSCHTĐ Chỉ số chịu hạn tƣơng đối ĐVHĐ Đơn vị hoạt độ ĐVMS Đơn vị mô sẹo EDTA Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt) IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa quốc tế) Kb Kilobase MS Murashige Skoog (Môi trƣờng theo Murashige và Skoog) LEA Late Embryogenesis Abundant protein (Protein tổng hợp với số lƣợng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình phát triển phôi) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RAPD Random Amplified Polymorphism ADN (Phân tích ADN đa hình đƣợc nhân bản ngẫu nhiên) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Phân tích chiều dài các phân đoạn ADN cắt hạn chế) sHSP Small heat shock protein (Protein sốc nhiệt nhỏ từ 10 - 30 kDa) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11. 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Lúa ( oryza Sativa L.) là nguồn lƣơng thực chủ yếu của hơn một nửa dân số trên thế giới. Ở Việt Nam, lúa là cây nông nghiệp có vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Nghề trồng lúa ở Việt Nam có từ cổ xƣa và là trung tâm đa dạng về cây lúa trồng hiện nay [52]. Hiện hay hơn 60% dân số nƣớc ta sống bằng nghề trồng lúa , nên lúa không chỉ có ý nghĩa vế mặt an ninh lƣơng thực mà còn có giá trị về mặt kinh tế cho nông dân trồng lúa và đặc biệt quan trọng đối với những bà con dân tộc miền núi. Nƣớc ta có địa hình phức tạp 3/4 lãnh thổ là đồi núi, địa hình chia cắt và diễn biến khí hậu phức tạp, lƣợng mƣa phân bố không đều giữa các vùng và các miền trong năm [8], nên hạn có thể xảy ra bất cứ mùa nào, vùng nào trong năm. Lúa là loài cây trồng rất mẫn cảm với các điều kiện ngoại cảnh và là cây chịu hạn kém [40]. Những yếu tố sinh thái bất lợi tác động lên quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây lúa nhƣ lƣợng mƣa nhiệt độ, ánh sáng không thuận lợi. Trên thế giới, hàng năm hạn có thể làm giảm tới 70% năng suất cây trồng nói chung [68]. Ở Việt Nam, hàng năm trung bình mất khoảng 30 vạn tấn lƣơng thực do thiên tai, trong đó hạn đƣợc xem là nhân tố chình làm giảm năng xuất lúa [1]. Bên cạnh lúa nƣớc, lúa cạn cũng chiếm một vị trí quan trọng đối với nông dân, đặc biệt là dân miền núi. Lúa cạn phân bố ở vùng núi, địa hình đồi dốc. Việt Nam lúa cạn phân bố chủ yếu ở vùng Tây Bắc, Đông Bắc Bộ và Tây Nguyên, nơi có địa hình đồi núi, mƣa nhiều nhƣng lƣợng mƣa phân bố không đều dẫn đến hạn cục bộ xảy ra thƣờng xuyên. Do đó việc nghiên cứu tính chịu hạn và nâng cao khả năng chịu hạn cho cây lúa cạn là một thực tiễn quan trọng đƣợc nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu [1], [40]. Cây lúa cạn năng xuất thấp nhƣng lại thể hiện tính ƣu việt về khả năng chống chịu hạn tốt, thích nghi cao với điều kiện sinh thái khó khăn, có chất lƣợng gạo tốt, thơm, dẻo, phù hợp với thị hiếu ngƣời tiêu dùng và có tiềm năng phát triển để phục vụ cho xuất khẩu. Hiện nay các giống lúa đƣợc canh tác phân tán, tự phát, chƣa có khoanh vùng và định hƣớng phát triển làm cho nhiều giống lúa cạn có chất lƣợng bị Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
12. 2 mất dần, diện tích trồng lúa bị thu hẹp. Vì vậy sƣu tập và tuyển chọn các giống lúa cạn có chất lƣợng tốt, khả năng chống chịu cao làm cơ sở cho chọn tạo giống trở thành một vấn đề cấp thiết. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Đánh giá chất lƣợng và khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn Hà Giang”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá chất lƣợng và khả năng chịu hạn của 5 giống lúa cạn trồng ở tỉnh Hà Giang. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân loại các giống lúa nghiên cứu. - Đánh giá chất lƣợng hạt các giống lúa nghiên cứu. - Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm. - Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của các giống lúa nghiên cứu ở giai đoạn mạ ba lá - Đánh giá khả năng chịu hạn ở mức độ mô sẹo bằng kỹ thuật thổi khô. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13. 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây lúa 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây lúa Cây lúa (Oryza sativa L) còn đƣợc gọi là lúa châu Á vì nó đƣợc thuần hoá từ lúa dại ở ba trung tâm đầu tiên vùng Đông Nam Á: Assam (Ấn Độ), biên giới Thái Lan – Myanmarr, Trung du Tây Bắc Việt Nam [30]. Theo tài liệu của Trung Quốc thì khoảng năm 2800 – 2700 TCN, ở Trung Quốc đã có nghề trồng lúa [6]. Markey và De Candolle, Roievich cho rằng nguồn gốc cây lúa trồng là ở Miền Nam Việt Nam và Campuchia [30]. Có tài liệu lại cho rằng nguồn gốc cây lúa là ở Miền Nam Việt Nam và Campuchia [22], [30]. Có giả thuyết lại cho rằng tổ tiên của lúa Oryza là một cây hoang dại trên siêu lục địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm và phát tán khắp các châu lục trong quá trình trôi dạt lục địa [60]. Gutschin cho rằng cái nôi của nghề trồng lúa là ở chân dãy Himalaya đổ xuống các vùng đồng bằng Bengale, Assam, Thái Lan vì ở vùng này có nhiều loại lúa hoang dại và các giống lúa trồng phong phú [6]. Tuy có nhiều các tài liệu khác nhau, các khảo cổ đã chứng minh nguồn gốc khác nhau của cây lúa nhƣng đa số các tài liệu đều cho rằng nguồn gốc cây lúa là ở vùng đầm lầy Đông Nam Á, có thể thuộc nhiều quốc gia khác nhau, sau đó do khí hậu nhiệt đới nóng ẩm cây lúa đã lan rộng ra các vùng khác nhau [22], [30]. Lúa thuộc ngành thực vật có hoa (Angios Permes), lớp một lá mầm (Mono Cotyledones), bộ hòa thảo có hoa (Graminales), họ hòa thảo (Graminae), lúa trồng thuộc chi Oryza (có 24 hoặc 48 nhiễm sắc thể), có 23 loài phân bố khắp thế giới trong đó có hai loài lúa trồng. Loài Oryza sativa L. trồng phổ biến trên thế giới và phần lớn tập trung ở Châu Á bao gồm ba loài phụ: Japonica phân bố ở những nơi có vĩ độ cao (Bắc Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên), chịu rét cao, ít chịu sâu bệnh. Indica ( đƣợc trồng ở các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới nhƣ Việt Nam, Thái Lan, Ấn Độ, Mianma), có đặc điểm hạt dài, thân cao, mềm dễ đổ, chịu sâu bệnh, năng xuất thấp, mẫn cảm với ánh sáng. Javanica có đặc điểm trung gian, hạt dài, dày và rộng hơn hạt của Indica, chỉ đƣợc trồng ở vài nơi thuộc Indonesia [22] . Loài Oryza Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
14. 4 gluberrima S. đƣợc trồng với một diện tích nhỏ thuộc Tây Phi. Sự tiến hóa của cây lúa gắn liền với sự tiến hóa của loài ngƣời đặc biệt ở châu Á [61]. Theo điều kiện sinh thái, cây lúa chia làm hai loại, lúa cạn và lúa nƣớc. Lúa cạn, đƣợc trồng vào mùa mƣa trên đất cao, đất thoát nƣớc tự nhiên, trên những chân ruộng không đắp bờ hoặc không có bờ và không có nƣớc dự trữ trên bề mặt. Theo nghiên cứu của nhiều tác giả thì lúa cạn do lúa nƣớc biến đổi thành và những giống lúa này có khả năng trồng đƣợc ở những vùng khô hạn, vẫn có khả năng sinh trƣởng phát triển bình thƣờng trên ruộng có nƣớc. Đây là một đặc tính nông học của lúa cạn, khác với cây trồng khác. Hiện nay có thể chia lúa cạn thành hai nhóm: Nhóm lúa cạn cổ truyền, bao gồm những giống lúa cạn địa phƣơng, thích nghi cao và tồn tại lâu đời, tính chống chịu cao, tuy nhiên giống lúa này có hạn chế là năng xuất thấp. Nhóm lúa không chủ động nƣớc hoặc sống nhờ nƣớc trời. Loại này đƣợc phân bố trên những nƣơng bằng, chân đồi thấp cố độ dốc dƣới 5o. Đây là những giống lúa cạn mới lai tạo, có khả năng chịu hạn trong những giai đoạn sinh trƣởng nhất định, hiệu xuất sử dụng nƣớc và tiềm năng năng xuất cao [16]. Năng xuất của các giống lúa cạn thƣờng thấp do hai nguyên nhân chủ yếu: Giống xấu và đất nghèo dinh dƣỡng, phát triển trên những vùng dân trí thấp và điều kiện canh tác kém [16]. Tuy năng xuất lúa cạn không cao, trung bình đạt 15 tạ/ha, nhƣng cây lúa cạn đã góp phần vào tổng sản lƣợng lúa một cách đáng kể (từ 20% - 40% ở những vùng sản xuất lƣơng thực khó khăn), góp phần giải quyết lƣơng thực tại chỗ cho nhân dân, giảm đƣợc công vận chuyển và chủ động lƣơng thực trong một khoảng thời gian nhất định, phù hợp với điều kiện của nhiều địa phƣơng. 1.1.2. Giá trị kinh tế của cây lúa Trên thế giới cơ cấu sản xuất lƣơng thực, lúa gạo chiếm 26,5%. Sản lƣợng lúa đã vƣợt lên đứng thứ nhất trong các cây lƣơng thực với tổng sản lƣợng là 650 triệu tấn/năm. Mặc dù diện tích trồng lúa gạo đứng sau lúa mì nhƣng sản lƣợng lúa năm 1993 đã đứng vị trí thứ nhất với tổng sản lƣợng là 573 triệu tấn/năm. Đặc biệt trong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15. 5 những năm gần đây với sụ phát triển của khoa học kỹ thuật trong công tác chọn tạo giống và canh tác, phân bón thì năng xuất và chất lƣợng lúa gạo không ngừng tăng lên [6]. Trên thế giới khoảng 40% dân số coi lúa gạo là cây lƣơng thực chính, tới 25% dân số sử dụng lúa gạo trên 1/3 khẩu phần ăn hàng ngày. Ở Việt Nam 100% dân số sử dụng gạo làm lƣơng thực chính. Trong lúa gạo chứa đầy đủ các thành phần dinh dƣỡng nhƣ tinh bột (62,5%), protein (7-10%), lipit (1-3%), xenlulo (10,9%), nƣớc 11% [22]. Ngoài ra gạo còn chứa một số chất khoáng và vitamin nhóm B, các axit amin thiết yếu nhƣ lizin, triptophan, threonin chất lƣợng gạo thay đổi theo thành phần axit amin, điều này phụ thuộc vào từng giống [58]. Do thành phần các chất dinh dƣỡng tƣơng đối ổn định và cân đối nên lúa gạo đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ: - Lúa gạo đƣợc chế biến thành trên 200 món ăn khác nhau [16], [61]. - Lúa gạo đƣợc dùng làm thức ăn cho gia súc với một lƣợng khá lớn. Ở các nƣớc phát triển lƣợng lúa gạo dành cho chăn nuôi chiếm một tỷ lệ cao. - Lúa gạo là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp nhƣ: công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, sản xuất bánh kẹo, sản xuất rƣợu bia Sản phẩm phụ của cây lúa đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Tấm đƣợc dùng để sản xuất rƣợu, cồn axeton, phấn viết mịn Cám đƣợc dùng để sản xuất thức ăn tổng hợp, sản xuất các vitamin nhóm B, chế tạo sơn cao cấp, làm nguyên liệu chế tạo xà phòng Vỏ trấu để sản xuất nấm men làm thức ăn gia súc, vật liệu đóng lót hàng, vật liệu độn phân hữu cơ, làm chất đốt Rơm rạ dùng cho công nhiệp sản xuất giấy, catông xây dựng, đồ gỗ gia dụng. Gạo là mặt hàng xuất khẩu làm tăng thu nhập quốc dân, góp phần ổn định an ninh lƣơng thực nhân loại [21], [61]. 1.1.3. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.3.1. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới Theo thống kê của FAO năm 2006 có 114 nƣớc trồng lúa và phân bố ở tất cả các Châu lục trên Thế giới. Trong đó Châu Phi có 41 nƣớc, Châu Á có 30 nƣớc, Bắc Trung Mỹ có 14 nƣớc, Nam Mỹ 13 nƣớc, Châu Âu 11 nƣớc, Châu Đại Dƣơng có 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
16. 6 nƣớc. Diện tích trồng lúa biến động và đạt khoảng 152.000 triệu ha, năng suất bình quân xấp xỉ 4,0 tấn/ha [61]. Châu Á là khu vực có diện tích trồng lúa lớn nhất Thế giới chiếm 90%, Châu Phi 3,6%, Nam Mỹ 3,1%, Bắc Mỹ và Trung Mỹ 1,3% [59]. Bảng 1.1. Diện tích, năng xuất và sản lƣợng lúa của toàn Thế giới giai đoạn từ 1970 đến 2007 Diện tích Năng suất Sản lƣợng Năm (triệu ha) (tạ/ha) (triệu tấn) 1970 133,10 23,8 316,38 1980 144,76 27,4 396,87 1990 146,98 35,3 518,23 2000 154,11 38,9 598,97 2001 151,97 39,4 598,03 2002 147,96 39,1 577,99 2003 149,20 39,1 583,00 2004 151,02 40,3 608,37 2005 153,78 40.2 618,53 2006 156,30 41,21 644,10 2007 156,59 41,50 651,70 (Nguồn: Số liệu thống kê của FAOSTAT, 2008 [64]) Bảng 1.1 thể hiện, diện tích canh tác lúa có xu hƣớng tăng. Song tăng mạnh nhất vào thập kỷ 60, 70 của thế kỷ XX sau đó tăng chậm dần và có xu hƣớng ổn định vào những năm đầu của thế kỷ XXI. Về năng suất lúa trên đơn vị diện tích cũng có chiều hƣớng tƣơng tự. Trong 4 thập kỷ cuối của thế kỷ XX năng suất lúa tăng gấp 2 lần từ: 23,8 tạ/ha năm 1970 đến 38,9 tạ/ha năm 2000, sau đó năng suất lúa vẫn tăng nhƣng chậm dần. Đến năm 2007 sản lƣợng lúa trên toàn thế giới là 651,70 triệu tấn. Sang những năm đầu của thế kỷ XXI, việc áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật vào trong thâm canh lúa, chú trọng chỉ tiêu chất lƣợng hơn số lƣợng làm cho năng suất lúa có xu hƣớng chững lại hoặc tăng không đáng kể. Tuy nhiên ở những nƣớc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
17. 7 có nền khoa học kỹ thuật phát triển, năng suất vẫn cao hơn hẳn. Điều nàyđƣợc chứng minh qua số liệu thống kê của 10 nƣớc có sản lƣợng lúa đứng đầu thế giới (FAOSTAT, 2008) [64]. Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lƣợng lúa của 10 nƣớc có sản lƣợng lúa hàng đầu thế giới năm 2007 Diện tích Năng suất Sản lƣợng Tên nƣớc (triệu ha) (tạ/ha) (triệu tấn) Trung Quốc 29,49 63,41 187,04 Ấn Độ 44,00 32,07 141,13 Inđônêxia 12,16 46,89 57,04 Băngladesh 11,20 38,84 43,50 Việt Nam 7,30 48,68 35,56 Thái Lan 10,36 26,94 27,87 Myanma 0,82 39,76 32,61 Philippin 4,25 37,64 16,00 Brazin 2,90 38,20 11,09 Nhật Bản 1,67 65,37 10,97 (Nguồn: Số liệu thống kê của FAOSTAT, 2008) Theo số liệu của bảng 1.2, trong 10 nƣớc trồng lúa có sản lƣợng trên 10 triệu tấn/năm có 9 nƣớc nằm ở Châu Á, chỉ có một đại diện Brazin là ở Nam Mỹ. Trung Quốc và Nhật Bản là hai nƣớc có năng suất cao hơn hẳn đạt 63,41 tạ/ha (Trung Quốc) và 65,37 tạ/ha (Nhật Bản). Điều đó có thể lý giải vì Trung Quốc là nƣớc đi tiên phong trong lĩnh vực phát triển lúa lai và ngƣời dân có tính cần cù, trình độ thâm canh cao. Còn Nhật Bản là nƣớc có trình độ khoa học kỹ thuật cao, đầu tƣ lớn [19]. Việt Nam là nƣớc có năng suất lúa cao đứng hàng thứ 3 trong 10 nƣớc trồng lúa, đạt 48,68 tạ/ha. Thái Lan tuy là nƣớc xuất khẩu gạo đứng hàng đầu thế giới trong nhiều năm liên tục, song năng suất chỉ đạt 26,91 tạ/ha, Thái Lan chú trọng nhiều hơn đến canh tác các giống lúa dài ngày, chất lƣợng cao [6]. Xét về diện tích trồng lúa thì Ấn Độ là nƣớc có diện tích lớn nhất (44,00 triệu ha) còn nƣớc đứng thứ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18. 8 10 là Myanma (0,82 triệu ha). Về sản lƣợng Trung Quốc đứng đầu 187,04 triệu tấn và đứng thứ 10 là Nhật Bản 10,97 triệu tấn. Bên cạnh cây lúa nƣớc, cây lúa cạn chiếm tỉ lệ đáng kể chiếm 15% sản lƣợng gạo trên Thế giới. Lúa cạn đƣợc trồng ở khắp Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ La Tinh. Diện tích trồng lúa trên Thế giới khoảng 148 triệu ha (năm 1991), trong đó 19 triệu ha là lúa cạn: Châu Á có 12 triệu ha, Châu Mỹ La Tinh 3,3 triệu ha, Châu Phi 2,5 triệu ha, năng suất bình quân đạt 1 tấn/ha [76]. 1.1.3.2. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam. Việt Nam là một trong 10 nƣớc sản xuất lúa gạo lớn nhất trên thế giới. Năm 1980 diện tích trồng lúa là 5,6 triệu ha, sản lƣợng là 23,5 triệu tấn. Đến năm 2007 diện tích trồng lúa là 7,30 triệu ha, năng suất đạt 36,56 triệu tấn. Việt Nam là nƣớc nông nghiệp , trong đó nghề trồng lúa đóng vai trò chủ đạo trong cơ cấu cây trồng, nên lúa có ý nghĩa quan trọ ng trong nền kinh tế , xã hội nƣớc ta. Nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm, lƣợng bức xạ mặt trời cao và đất đai phù hợp cho trồng lúa nên Việt Nam có thể trồng nhiều vụ lúa trong năm và với nhiều giống khác nhau. Cùng với việc áp dụng các biện pháp chọn , tạo giống mới có năng suất, chất lƣợng cao và khả năng chống chị u tố t nên sản lƣợng lúa gạo nƣớc ta không ngừng tăng lên, đã góp phần quan trọng đƣa bình quân lƣơng thực đầu ngƣời tăng lên. Năm 1994 bình quân lƣơng thực đầu ngƣời nƣớc ta đạt 359 kg/ngƣời/năm nhƣng đến năm 2005 đã tăng lên 476 kg. Mặc dù diện tích trồng lúa ở nƣớc ta giai đoạn 1990 -2007 không tăng nhƣng sản lƣợng và lƣợng gạo xuất khẩu không ngừng tăng đƣợc thể hiện ở bản1.3g [39], [62]. Năm 1990 Việt Nam xuất khẩu gạo đƣợc 1,62 triệu tấn, đến năm 2000 chúng ta đã đạt 3,50 triệu tấn. Năm 2007 Việt Nam có sản lƣợng gạo xuất khẩu lớn nhất đạt 5,23 triệu tấn và giữ vững là nƣớc xuất khẩu gạo lớn thứ hai trên Thế giới. Năm 2008 tuy diện tích trồng lúa giảm xong năng xuất và sản lƣợng đều tăng điều đó đã khẳng định vị thế cây lúa của Việt Nam. Đặc biệt sản lƣợng xuất khẩu gạo vẫn đƣợc duy trì ổn định ở mức trên 5 triệu tấn. Theo dự đoán của các chuyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19. 9 gia thì năm 2009 năng xuất, sản lƣợng và giá trị xuất khẩu gạo của Việt Nam sẽ giữ ở mức ổn định và có thể đạt 5,3 triệu tấn (theo dự báo của FAO). Bảng 1.3. Tình hình sản xuất và xuất khẩu lúa gạo của Việt Nam giai đoạn 1990 - 2007 Diện tích Năng suất Sản lƣợng Xuất khẩu Năm (triệu ha) (tấn/ha) (triệu tấn) (triệu tấn) 1990 6,042 3,18 19,225 1,62 1995 6,765 3,68 24,964 2,04 2000 7,666 4,24 32,530 3,50 2003 7,452 4,63 34,568 3,92 2004 7,444 4,86 36,158 4,00 2005 7,430 4,82 35,800 5,16 2006 7,3248 4,89 36,200 5,18 2007 7,1838 4,95 36,890 5,23 (Nguồn: Niên giám thống kê Việt Nam, 2008 [39],[62]) 1.1.3.3. Tình hình sản xuất lúa cạn trên thế giới và ở Việ t Nam Tổ ng diệ n tí ch lú a cạ n ở trên thế giớ i khoả ng 18,960 triệ u ha , chiế m 13% diệ n tí ch trồ ng lú a thế giớ i , năng suấ t bình quân chỉ đạt 1tấ n/ha [74]. Tuy diệ n tí ch không lớ n, song nó đó ng vai trò rấ t quan trọ ng và không thể thiếu đƣợc đối với nhân dân vù ng nú i cao, vùng sâu, vùng xa. Diệ n tí ch trồ ng lú a cạ n phân bố không đề u , chủ yếu tập trung ở châu Á , châu Mỹ La Tinh , châu Phi. Trong tƣ̀ ng khu vƣ̣ c diệ n tí ch gieo trồ ng lú a cạ n cũ n g khá c nhau. Nhƣ̃ ng nƣớ c trồ ng nhiề u là Ấ n Độ , Bzazil, Indonesia, Banglades Về tỷ lệ diệ n tí ch lú a cạ n so vớ i lú a nƣớ c ở tƣ̀ ng vù ng cũ ng rấ t khá c nhau , có những nƣớc trồ ng 94% diệ n tí ch lú a cạ n nhƣ Liberia , Bzazil (76%) .Ở châu Á tỷ lệ nà y thấ p hơn: Philippin (11,3%), Indonesia (21%), Malaixia (5%) [74] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
20. 10 Ở Việt Nam diện tích lúa cạn chiếm 7,5% diệ n tí ch trồ ng lú a, đƣợ c phân bố ở các tỉnh miền núi phía Bắc (210.000 ha), vùng duyên hải Trung Bộ (77.000 ha), vùng Cao Nguyên (128.000 ha), vùng Đông Nam Bộ (233.000 ha) và một số tỉnh đồ ng bằ ng Sông Cƣ̉ u Long (2.000 ha) [21]. 1.1.4. Thành phần hoá sinh của hạt lúa Trong hạt lúa khô có 1,79 – 3,07 % lipit, 5,5 – 13% protein, 62,40 – 82,51%, tinh bộ t, 5,7% tro và 0,48 – 1,19% đƣờng. Ngoài ra còn chứa một số chất khoáng và vitamin, nhất là vitamin nhóm B nhƣ: B1, B2, B6, PP lƣợng vitamin B1 là 0,45mg/100g hạt, trong đó ở phôi chiếm 47%, vỏ cám 34,5%, ở hạt gạo chỉ có 3,8% nên nếu khi xát kĩ hàm lƣợng B1 trong hạt gạo còn rất thấp [20], [21], [22], [43]. Lipit chủ yếu tập trung ở vỏ gạo. Nếu ở gạo xay có hàm lƣợng lipit là 2,02% khối lƣợng khô thì gạo xát lƣợng lipit chỉ còn 0,52%. Hàm lƣợng lipit liên quan đến chất lƣợng trên hai phƣơng diện là giá trị dinh dƣỡng và giá trị bảo quản. Hàm lƣợng lipit càng cao thì bảo quản càng phức tạp [13], [63]. Tinh bột chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần vật chất khô trong hạt lúa, chiếm 62,4 – 82,51%, nó là nguồn chủ yếu cung cấp calo [20]. Tinh bột đƣợc cấu tạo bởi amylose và amylopectin. Amylose có cấu tạo mạch thẳng có nhiều ở gạo tẻ, độ dẻo thấp. Amylopectin có cấu tạo mạch nhánh có nhiều ở gạo nếp tạo nên độ dẻo đặc trƣng ở cơm [11], [15]. Protein trong hạt lúa chiếm từ 5,5 - 13,0% khối lƣợng khô của hạt. Khoảng 80% protein là glutelin, 18 – 20% là prolalin, 2 – 8% là globulin, abumin chiếm 5%. Glutelin là một loại protein quan trọng, có thành phần axit amin cân đối với gần 3% lizin, khố i lƣợng phân tử lớn (20 - 22KDa và 35 - 37KDa). Prolamin gạo là một trong những protein dễ tan, dạng chính là 13KDa còn lại là những thành phần phụ, thành phần axit amin rất giàu glutamin, prolin, lơxin nhƣng thấp về metionin, cystein, threonin và tyrozin. Globulin là thành phần chính của protein trong phôi hạt thóc, khối lƣợng phân tử 26 KDa [73]. Albumin trong gạo là loại protein không đồng nhất, gồm nhiều thành phần điện di và phân li mạnh [58]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
21. 11 Trong lúa nƣớc hàm lƣợng protein chiếm từ 5,50 – 10,77%, các giống lúa cạn thì hàm lƣợng cao hơn từ 8,00 – 11,62%, lúa nếp cao hơn lúa tẻ và lúa thơm cao hơn lúa thƣờng. Hàm lƣợng protein trong hạt lúa không cao nhƣng là protein dễ tiêu hoá và hấp thu với ngƣời và vật nuôi . Trong hạt lúa protein có 17 loại axit amin trong đó có cá c axit amin không thay thế là : valine, lơxin, isolơxin, metionin, phenylalanin, lizin, threonin [13]. Kỹ thuật điện di cho phép phân tách hỗn hợp phức hệ protein thành những tiểu phần khác nhau dựa trên nguyên tắc tốc độ dịch chuyển khác nhau theo khối lƣợng của tiểu phần đó. Dựa vào các băng điện di có thể so sánh thành phần điện di giữa các mẫu nghiên cứu, xác định tính đa dạng sinh học trên cơ sở phân tích đa hình protein [33], [34]. Khi nghiên cứu đặc điểm sinh hoá của các giống lúa cạn địa phƣơng cho thấy các giống lúa nghiên cứu có số băng điện di khác nhau dao động từ 17- 20 băng, trong đó cao nhất là giống nếp lai tẻ là 20 băng. Điều này chứng tỏ hàm lƣợng của các tiểu phần protein hạt ở giống lúa nếp lai tẻ cao hơn so với các giống lúa khác [58]. Nghiên cứu về thành phần hoá sinh hạt của một số giống lúa cạn trồng phổ biến ở Bắc Kạn và Cao Bằng, kết quả phân tích thành phần điện di protein dự trữ hạt đã xác định đƣợc sự khác nhau về số lƣợng các băng điện di giữa các giống (17- 21 băng), protein dự trữ hạt biểu hiện tính đa hình [37]. 1.1.5. Đặc điểm sinh học của cây lúa cạn. Thời gian sinh trƣởng và phát triển của cây lúa kể từ khi tra hạt đến khi thu hoạch gồm 3 thời kỳ. Thời kỳ sinh trƣởng sinh dƣỡng, thời kỳ sinh trƣởng sinh thực, thời kì hình thành hạt và chín (IRRI 1991)[76]. Thời kỳ sinh trƣởng sinh dƣỡng, cây lúa hình thành nhánh, lá và một phần thân, cần có sự cân đối giữa sinh trƣởng nhánh và sinh trƣởng lá sao cho số nhánh mới sinh ra đều có khả năng tạo ra đƣợc số lá vốn có của giống. Yếu tố này rất quan trọng vì nó tạo ra số nhánh hữu hiệu tạo năng xuất cho cây [76]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
22. 12 Thời kỳ sinh trƣởng sinh thực. Cây lúa hình thành hoa, tập hợp hoa thành bông lúa, thời tiết thuận lợi thì số hoa của bông lúa sẽ hình thành tối đa tạo điều kiện để có nhiều hạt trên bông [76]. Thời kỳ chín, ở các hoa lúa đƣợc thụ tinh xảy ra quá trình tích lũy tinh bột và sự phát triển hoàn thiện của phôi (nếu dinh dƣỡng đủ, thời tiết tốt, không sâu bệnh) – sự hình thành hạt chắc – sản phẩm chủ yếu của cây lúa sẽ cao [76]. Thời gian sinh trƣởng và phát triển của cây lúa cạn giao động từ 3 đến 5 tháng. Đặc điểm hình thái của cây lúa gồm 3 phần chính, rễ, thân, lá. Rễ lúa gồm 3 loại chính (rễ mầm, rễ phụ, rễ bất định), rễ mầm hình thành từ rễ phôi tồn tại 5 - 7 ngày sau đó rụng đi, rễ phụ hình thành từ các đốt trên của thân lúa phát triển nhanh thành bộ rễ chùm và làm nhiệm vụ chính trong hút chất dinh dƣỡng phục vụ cho đời sống của cây lúa, rễ bất định là loại rễ phụ hình thành từ các đốt phía trên cao của thân chúng tham gia một phần vào hút chất dinh dƣỡng. Số lƣợng rễ, số lông rễ, độ lớn của rễ phụ thuộc vào từng giống, những giống lúa cạn có số lƣợng rễ, độ lớn, độ dài và đặc biệt có độ dày của vỏ rễ lớn hơn nhiều so với lúa nƣớc. Điều đó giúp lúa cạn có bộ rễ ăn sâu và phát triển tốt trong điều kiện khô hạn [21]. Trong số các tính trạng của bộ rễ đƣợc nghiên cứu thì tính trạng tổng chiều dài rễ có mối liên quan chặt chẽ đến tính chịu hạn của lúa nƣơng. Khả năng thu thập nƣớc và cung cấp đủ nƣớc thông qua rễ tới các bộ phận của cây trong điều kiện khó khăn về nƣớc đƣợc coi là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá tính chịu hạn [30]. Thân lúa: Có thân giả và thân thật. Thân giả do các bẹ lá kết hợp với nhau tạo thành (thời kỳ lúa con gái). Thân thật chỉ hình thành khi cây lúa vƣơn đốt, phần cuối của thân là bông lúa (IRRI, 1991) [76]. Lá lúa có hai loại, lá không hoàn toàn và lá hoàn toàn (lá thật). Lá lúa có màu sắc khác nhau, tùy giống. Đa số lá có màu xanh và ở các mức độ khác nhau. Trên thân lúa, lá ra kế tục nhau và xếp so le. Số lá trên thân chính phụ thuộc vào số gióng. Giống có thời gian sinh trƣởng càng dài thì số lá càng nhiều. Chỉ số diện tích lá của lúa cạn thƣờng cao nhƣng tổng số lá trên cây lại ít hơn so với lúa nƣớc [40]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
23. 13 Lúa cạn có bộ lá dày hơn, tuy hô hấp nhiều nhƣng giữ nƣớc tốt. Trên bề mặt lá có nhiều lông do vậy có thể hấp thụ sƣơng đêm. Đặc điểm của các giống lúa cạn khi độ ẩm đất giảm thì lá cuộn lại và khí khổng đóng lại để giảm sự mất nƣớc [78]. Việc đóng mở khí khổng đƣợc điều khiển thông qua điều chỉnh áp suất thẩm thấu hoặc hormon ABA (acid Abscisic) [40]. Bông lúa, có nhiều hình dạng khác nhau (bông thẳng, bông cong đầu, bông cong tròn). Bông lúa đƣợc phát triển từ cuối đốt cuối của thân, trải qua các thời kỳ phân hóa, trổ, phơi màu, thụ phấn, chín sữa, chín sáp và chín hoàn toàn [6]. Tóm lại, trong đời sống cây lúa, mỗi yếu tố cấu thành năng xuất đƣợc xác định bởi mỗi giai đoạn sinh trƣởng xác định: - Số bông/m2 đất phụ thuộc vào mật độ cấy (mật độ tra hạt), khả năng đẻ nhánh hữu hiệu, đƣợc quyết định ngay giai đoạn đầu. - Số hạt/bông đƣợc quyết định trong thời kỳ làm đòng. - Tỷ lệ hạt chắc đƣợc quyết định vào trƣớc, trong và sau khi trỗ bông. - Khối lƣợng 1000 hạt do giống quyết định, nhƣng lƣợng bức xạ mặt trời ở kỳ sau trỗ, đặc biệt là nƣớc và dinh dƣỡng có ảnh hƣởng nhất định đến tính trạng này. Các điều kiện thời tiết, chăm sóc, phân bón có ảnh hƣởng đến từng yếutố năng suất. Hiểu biết về mối quan hệ đó là điều mấu chốt và cần thiết để tác động các biện pháp kỹ thuật, nhằm nâng cao năng suất lúa có hiệu quả. 1.2. Hạn và cơ chế chịu hạn của thực vật 1.2.1. Khái niệm về hạn Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nƣớc do môi trƣờng gây nên trong suố t cả quá trì nh hay trong tƣ̀ ng giai đoạ n , làm ảnh hƣởng đến sinh trƣở ng và phá t triể n củ a cây. Mƣ́ c độ khô hạ n do môi trƣờ ng gây nên ả nh hƣở ng trƣ̣ c tiế p đế n sƣ̣ phá t triể n của cây, nhẹ thì làm giảm năng suất, nặ ng thì có thể dẫ n đế n tì nh trạ ng huỷ hoạ i cây cố i và mù a mà ng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
24. 14 Theo Robert và CS (1991) hạn đƣợc xem là nhân tố gây thiệ t hạ i lớ n nhấ t đố i vớ i năng suấ t lú a . Trên thế giớ i , thiệ t hạ i do khô hạ n hà ng năm gây ra đố i vớ i sả n xuấ t lú a khoả ng 1,024 triệ u đôla [88]. 1.2.2. Tính chịu hạn và tác động của hạn đến thực vật 1.2.2.1. Tính chịu hạn của thực vật Mỗi loài cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của môi trƣờng nhƣ: nhiệt độ (nóng, lạnh), nƣớc, phèn, độ mặn Nếu ở ngoài giới hạn đó, thì các nhân tố sinh thái này có thể gây hại, cản trở cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây dẫn đến giảm năng suất sinh học [1]. Trong những nhân tố sinh thái của môi trƣờng thì nƣớc là một nhân tố giới hạn quan trọng của cây trồng, là sản phẩm khởi đầu, trung gian và cuối cùng của các quá trình chuyển hoá sinh hoá diễn ra trong cơ thể thực vật. Nƣớc là môi trƣờng để các phản ứng trao đổi chất diễn ra, nhƣ vậy nƣớc có ý nghĩa sinh thái và sinh lý quyết định đời sống của thực vật. Thiếu nƣớc trƣớc tiên ảnh hƣởng đến sự cân bằng nƣớc của cây, từ đó ảnh hƣởng đến các chức năng sinh lý nhƣ quang hợp, hô hấp, dinh dƣỡng khoáng do đó ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Mức độ tổn thƣơng của cây trồng do thiếu nƣớc gây ra có nhiều mức độ khác nhau nhƣ: chết, chậm phát triển hay phát triển tƣơng đối bình thƣờng. Những cây có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tƣơng đối ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn. Khả năng của thực vật có thể giảm thiểu mức độ tổn thƣơng do thiếu hụt nƣớc gây ra gọi là tính chịu hạn [1]. Hạn là một hiện tƣợng thƣờng xuyên xảy ra trong thiên nhiên và liên quan trực tiếp đến vấn đề nƣớc trong thực vật. Khái niệm “khô hạn” dùng để chỉ tình trạng mất nƣớc của cây. Hiện tƣợng mất nƣớc có thể do tác động sơ cấp, là kết quả của sự thiếu nƣớc trong môi trƣờng hoặc có thể do tác động thứ cấp đƣợc gây ra bởi nhiệt độ thấp, sự đốt nóng, hay do độ mặn của muối Tuy nhiên rất khó có thể xác định đƣợc thế nào là một trạng thái hạn đặc trƣng vì mức độ hạn do môi trƣờng gây nên khác nhau theo từng mùa, từng năm, từng vùng địa lý và không thể dự đoán trƣớc đƣợc [81]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
25. 15 1.2.2.2. Các nguyên nhân gây hạn * Hạn không khí Hạn không khí thƣờng có đặc trƣng là nhiệt độ cao (390- 420) và độ ẩm thấp (<65%). Hiệ n tƣợ ng nà y thƣờ ng gặ p ở nhƣ̃ ng tỉ nh Miề n Trung nƣớ c ta và o nhƣ̃ ng đợ t gió Lào và ở vùng Bắc Bộ vào cuối thu , đầ u đông. Hiệ n tƣợ ng nà y cũ ng xuấ t hiệ n ở mộ t số nƣớ c trên thế giớ i nhƣ gió Chamsin ở Israel , gió Mistral ở miền nam nƣớ c Phá p là m ả nh hƣở ng nghiêm trọ ng đế n mộ t số loạ i cây trồ ng nhƣ phong lan, cam, chanh, đậ u tƣơng [7]. Hạn không khí ảnh hƣởng trực tiếp lên các bộ phận của cây trên mặt đất nhƣ hoa, lá, chồ i non Đố i vớ i thƣ̣ c vậ t nó i chung và cây lú a nó i riêng thì hạ n không khí thƣờng gây ra hiện tƣợng hé o tạ m thờ i, vì nhiệt độ cao, ẩm độ thấp làm cho tốc độ thoá t hơi nƣớ c nhanh vƣợ t quá mƣ́ c bì nh thƣờ ng , lúc đó rễ hút nƣớc không đủ để bù đắp lại lƣợng nƣớc mất , cây lâm và o trạ ng thá i mấ t cân bằ ng về nƣớ c . Mƣ́ c độ phả n ƣ́ ng củ a cây đố i vớ i sƣ̣ mấ t nƣớ c sẽ tuỳ thuộ c và o giai đoạ n phá t triể n củ a chúng. Riêng đố i vớ i cây lú a hạ n gây ả nh hƣở ng nghiêm trọ ng đặ c biệ t và o thờ i kỳ bắ t đầ u hì nh thà nh cá c cơ quan sinh sả n cho đế n lú c kế t thú c quá trình thụ phấn . Hạn không khí gây hại nhất ở giai đoạn lúa phơi màu và thậm chí gây nên mất mùa nế u gặ p phả i đợ t nhiệ t độ cao và độ ẩ m không khí thấ p (mặ c dù nƣớ c trong đấ t không thiế u ) làm cho hạt phấn không có kh ả năng nẩy mầm , quá trình thụ tinh không xẩ y ra và hạ t bị lép [7]. * Hạn đất Mƣ́ c độ khô hạ n củ a đấ t tuỳ thuộ c và o sƣ̣ bố c hơi nƣớ c trên bề mặ t và khả năng giƣ̃ nƣớ c củ a đấ t . Hạn đất sẽ làm cho áp suất thẩm thấu của đấ t tăng cao đế n mƣ́ c cây không cạ nh tranh đƣợ c nƣớ c củ a đấ t là m cho cây không thể lấ y nƣớ c và o tế bà o qua rễ , chính vì vậy hạn đất thƣờng gây nên hiện tƣợng cây héo lâu dài . Hạn đấ t có thể xẩ y ra ở bấ t kỳ vù ng đấ t nà o và thƣờ ng xẩ y ra nhiề u ở nhƣ̃ ng vù ng có điề u kiệ n khí hậ u , đị a hì nh, đị a chấ t, thổ nhƣỡ ng đặ c thù nhƣ sa mạ c ở Châu Phi ; đấ t trố ng đồ i trọ c củ a châu Á ; mùa ít mƣa và nhiệt độ thấp ở châu Âu . Tóm lại hạn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
26. 16 đấ t tá c độ ng trƣ̣ c tiế p lên bộ phậ n rễ củ a cây là m ả nh hƣở ng rấ t lớ n đế n quá trì nh sinh trƣở ng và phá t triể n củ a chú ng [7]. * Hạn toàn diện Hạn toàn diện là hiện tƣợng khi có cả hạn đất và hạn không khí xẩy ra cùng mộ t lú c. Trong trƣờng hợp này cùng với sự mất nƣớc do không khí làm cho hàm lƣợ ng nƣớ c trong lá giả m nhanh dẫ n đế n nồ ng độ dị ch bà o tăng lên , mặ c dù sƣ́ c hú t nƣớ c tƣ̀ rễ củ a cây cũ ng tăng nhƣng lƣợ ng nƣớ c trong đấ t đã cạ n kiệ t không đủ cung cấ p cho cây . Hạn toàn diện thƣờng dẫn đến hiện tƣợng héo vĩnh viễn , cây không có khả năng phụ c hồ i [7]. Ở nƣớc ta , hiệ n tƣợ ng hạ n toà n diệ n thƣờ ng xẩ y ra ở cá c tỉ nh miề n Trung (Nghệ An, Quảng Trị ) gây nên thiệ t hạ i đá ng kể về năng suấ t lú a và o cá c thá ng cuố i hè . 1.2.2.3. Tác động của hạn đến thực vật Ảnh hƣởng của hạn trƣớc hết là sự mất nƣớc của tế bào và mô . Bấ t kỳ sƣ̣ mấ t nƣớ c nà o cũ ng dẫ n đế n sƣ̣ vi phạ m chế độ nƣớ c và gây sƣ̣ thiế u hụ t nƣớ c trong tế bào. Sƣ̣ thiế u hụ t nƣớ c cà ng lớ n thì ả nh hƣở ng cà ng xấ u . Thiế u nƣớ c nhẹ chỉ ả nh hƣở ng đế n quá trì nh sinh trƣở ng . Thiế u nƣớ c nặ ng gây nên biế n đổ i hệ keo nguyên sinh chấ t kéo theo quá trì nh già hoá tế bà o, làm cho cây bị héo . Khi bị khô nguyên sinh chấ t bị đƣ́ t vỡ cơ họ c dẫ n đế n tế bào bị tổn thƣơng và chết [7]. 1.2.3. Cơ sở sinh lý , sinh hoá và di truyề n củ a tí nh chị u hạ n ở cây lú a 1.2.3.1. Cơ sở sinh lý của tính chịu hạn Để chống lại khô hạn thực vật có những biến đổi sinh lý, hoá sinh nhằm không để mất nƣớc. Có hai cơ chế bảo vệ thực vật tồn tại trong môi trƣờng thiếu nƣớc là cơ chế tránh mất nuớc và cơ chế chịu mất nƣớc. Cơ chế tránh mất nƣớc liên quan đến đặc điểm cấu trúc và hình thái của bộ rễ [1]. Khả năng thu nhận nƣớ c chủ yếu phụ thuộc vào chức năng của bộ rễ . Những cây chịu hạn có bộ rễ khỏe, dài, mập, có sức xuyên sâu sẽ hút đƣợc nƣớc ở những nơi sâu, xa trong đất, hoặc lan rộng với số lƣợng lớn để tăng diện tích tìm kiếm nƣớc [7]. Bên cạnh đó cây có hệ mạch phát triển, dẫn nƣớc lên các cơ quan thoát Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
27. 17 nƣớc, có hệ mô bì phát triển sẽ hạn chế sự mất nƣớc của cây do sự thoát hơi nƣớc. Cơ chế tránh mất nƣớc phụ thuộc vào khả năng thích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ, chồi nhằm giảm mất nƣớc một cách tối đa [1], [40]. Trong điều kiện khô hạn, áp suất thẩm thấu của dịch bào đƣợc điều chỉnh tăng lên, giúp cho tế bào thu nhận đƣợc những phân tử nƣớc ít ỏi còn lại trong đất. Bằng cơ chế nhƣ vậy, thực vật có thể vƣợt qua đƣợc tình trạng hạn cục bộ [86]. Cơ chế chịu mất nƣớc liên quan đến những thay đổi sinh hoá diễn ra trong tế bào, nhằm sinh tổng hợp các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nƣớc. Tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào còn thông qua tích luỹ các chất hoà tan, các protein, các axit amin ví dụ nhƣ axit amin prolin, mannitol, fructose, K+, các enzym phân hủy gốc tự do Sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu có hai chức năng: - Giữ và lấy nƣớc vào trong tế bào và ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+. - Thay thế vị trí nƣớc nơi xảy ra các phản ứng sinh hoá, tƣơng tác với lipit hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá huỷ màng và các phức protein [1]. 1.2.3.2. Cơ sở sinh hoá của tính chịu hạn Thành phần hoá sinh của hạt nhƣ: Hàm lƣợng protein, đƣờng tan, enzym, thành phần axit amin, không chỉ là cơ sở để dánh giá chất lƣợng hạt mà còn là các chỉ tiêu liên quan đến khả năng chống chịu của cây trồng [25], [26], [49]. Trong cơ thể thực vật, đƣờng tập chung nhiều ở thành tế bào, mô nâng đỡ, mô dự trữ, là sản phẩm của quá trình quang hợp ở tế bào. Đƣờng có nhiều vai trò quan trọng trong cơ thể sống, đó là cung cấp năng lƣợng cho cơ thể, cấu trúc và tạo hình, góp phần bảo vệ tƣơng tác đặc hiệu cho tế bào Theo nhiều nghiên cứu,hàm lƣợng đƣờng tan có liên quan trực tiếp đến khả năng chống chịu của cây trồng. Đuờng tan là một trong các chất tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào. Những nghiên cứu đã thấy rằng, tăng áp suất thẩm thấu của tế bào thông qua các phân tử đƣờng tan thì làm tăng khả năng chống chịu của cây trồng [29], [41], [65]. Tác giả Đỗ Thị Dƣơng đã nghiên cứu đặc điểm sinh hoá của năm giống lúa cạn đã nhận thấy khả năng chống chịu của các giống lúa có tƣơng quan thuận với hàm lƣợng đƣờng tan và protein [11]. Ngô Thị Liêm và Nguyễn Thị Sâm khi nghiên cứu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
28. 18 hình thái, hoá sinh hạt của một số giống lạc, nhận thấy có mối tƣơng quan thuận giữa hàm lƣợng đƣờng tan, protein, hoạt độ enzym với khả năng chịu hạn [24], [45]. Trên đối tƣợng là cây đậu tƣơng, Hà Tiến Sỹ (2007) đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống đỗ tƣơng địa phƣơng của tỉnh Cao Bằng ở giai đoạn mầm đã nhận thấy khả năng chịu hạn của các giống có tƣơng quan thuận với tỷ lệ tăng của hàm lƣợng đƣờng tan, hoạt độ enzym amylase [46]. Axit amin prolin có vai trò quan trọng trong điều hoà áp suất thẩm thấu của tế bào, đồng thời nó là một axit amin ƣa nƣớc có khả năng giữ và lấy nƣớc cho tế bào, ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+, tƣơng tác với protein và lipit màng, ngăn chặn sự phá huỷ của màng và phức protein khác. Các kết quả nghiên cứu cho thấy khi cây trồng gặp hạn thì cây giảm tổng hợp protein và tăng tổng hợp prolin [50], [66], [85]. Sự gia tăng hàm lƣợng prolin ở thực vật khi gặp phải điều kiện bất lợi nhƣ do hạn, mặn, nóng có liên quan đến các gen tổng hợp prolin và các gen điều khiển quá trình vận chuyển prolin. Khi môi trƣờng đất thiếu nƣớc đến mức áp suất thẩm thấu của tế bào không thể cạnh tranh đƣợc với áp suất thẩm thấu của đất thì gen tham gia vào quá trình tổng hợp prolin sẽ đƣợc hoạt hoá, xúc tiến cho việc tổng hợp prolin và vận chuyển prolin đến các mô, tế bào có nhu cầu. Khi cây ở tình trạng bình thƣờng (không chịu tác động của stress môi trƣờng) thì prolin trong cây sẽ đƣợc chuyển hoá thành glutamat. Còn khi cây rơi vào tình trạng thiếu nƣớc do hạn thì glutamat sẽ đƣợc chuyển hoá thành prolin [87], [90]. Enzym là chất xúc tác sinh học có hiệu quả cao. Mỗi một loại enzym xúc tác cho một quá trình chuyển hoá theo một kiểu phản ứng đặc hiệu nhất định. Trần Thị Phƣơng Liên (1999) khi xử lí nhiệt độ cao thì ảnh hƣởng đến hoạt tính protease của các giống đậu tƣơng chịu hạn, không ảnh hƣởng đến các giống chịu nóng, còn điều kiện áp suất thẩm thấu cao thì đều ảnh hƣởng đến enzym này ở các giống [26]. Các nghiên cứu khi xử lý hạn sinh lý ở giai đoạn nảy mầm đều nhận thấy giống có hàm lƣợng protein cao thì hoạt độ enzym protease cũng cao. Tỷ lệ tăng hoạt độ enzym protease sau hạn so với trƣớc gây hạn tỷ lệ thuận với khả năng chống chịu của các giống [9], [38]. Trong giai đoạn nảy mầm enzym α – amylase là một trong những Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
29. 19 enzym quan trọng trong quá trình thuỷ phân tinh bột thành dextrin và mantose. Sự tăng hoạt độ của α – amylase làm tăng hàm lƣợng đƣờng tan trong cây vì vậy làm tăng áp suất thẩm thấu trong tế bào nên khả năng chịu hạn của cây cũng tăng lên [17]. Ngoài ra đã có nhiều công trình nghiên cứu vai trò của axit abscisic (ABA) [91]. Skiver và Mundy (1990) đã nghiên cứu xác định chức năng của một số gen trong việc giải mã các protein và cơ chế biểu hiện gen ở thực vật khi gặp mất cân bằng thẩm thấu xử lý ABA. Nhƣ vậy cơ chế chịu hạn của thực vật rất phức tạp không chỉ liên quan đến đặc điềm hình thái giải phẫu của cây mà còn liên quan đến những thay đổi thành phần hoá sinh trong tế bào và sự điều chỉnh các gen liên quan đến tính chịu hạn của thực vật. 1.2.3.3. Cơ chế phân tử của tính chịu hạn Để khai thác tối đa tiềm năng của các giống cây trồng cần nắm vững phản ứng của các giống cây trồng đối với các điều kiện ngoại cảnh. Phản ứng của cây trồng rất đa dạng và phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, trong đó có kiểu gen và mức độ khắc nghiệt của điều kiện ngoại cảnh bất lợi. Biểu hiện của quá trình này là việc sinh tổng hợp của một loạt các chất trong tế bào liên quan đến điều hoà áp suất thẩm thấu của tế bào. Đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là các protein. sản phẩm của quá trình biểu hiện gen. Sự biểu hiện của các gen liên quan đến stress phụ thuộc vào khả năng nhận biết stress. Bằng chứng là tăng cƣờng các chất điều khiển phản ứng của cây trồng đối với stress. Ví dụ nhƣ ABA, axit jasmonic, ethylen, Ca++, Mức độ biểu hiện của một số gen tăng lên, một số yếu hẳn đi. Điều hoà biểu hiện của các gen này khi gặp stress đang đƣợc tăng cƣờng nghiên cứu ở các giai đoạn khác nhau: trƣớc phiên mã và sau phiên mã [25]. Nghiên cứu tính chịu hạn của thực vật theo cơ chế chịu mất nƣớc, các nhà khoa học nhận thấy rằng các nhóm chất liên quan đến việc bảo vệ cấu trúc của tế bào và điều chỉnh áp suất thẩm thấu có vai trò đặc biệt quan trọng. Những nhóm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
30. 20 chất đặc biệt quan tâm đến là protein sốc nhiệt (heat shock protein - HSP) trong đó có các chất môi giới phân tử - MGPT (molecular chaperone), Ubiquitin, Protein sốc nhiệt ở hầu hết các loại thực vật nhƣ: lúa mỳ, lúa gạo, đậu nành, hành tỏi, chúng chiếm 1% protein tổng số trong lá của các loài thực vật này. HSP đƣợc tổng hợp khi tế bào gặp điều kiện cực đoan nhƣ hạn, nhiệt độ cao, độ muối cao. Sự suất hiện của HSP có chức năng ngăn cản hoặc sửa chữa sự phá huỷ do stress nóng và mở rộng ngƣỡng với sự chống chịu nhiệt độ cao. Trong các tế bào thực vật, HSP trong tế bào chất tập chung thành các hạt sốc nhiệt (Heat Shock Granules – HSG). Ngƣời ta cho rằng các HSG gắn kết trên các ARN – polymease để ngăn cản sự phiên mã tổng hợp mARN trong quá trình bị stress nóng. Sau sốc nóng các HSG phân tán và liên kết dày đặc với các ribosome hoạt động sinh tổng hợp protein [25]. Dựa vào khối lƣợng phân tử HSP đƣợc chia thành 6 nhóm: HSP110, HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, HSP8,5. Trong đó nhóm HSP70 và HSP60 có đại diện của chất MGPT, HSP8,5 (Ubiquitin) có chức năng bảo vệ cho tế bào nhƣng không phải là MGPT, chúng có hoạt tính protease và thực hiện chức năng phân giải protein không có hoạt tính enzym, ngăn chặn các protein gây độc cho tế bào. Ubiquitin có khối lƣợng phân tử thấp, ít chịu ảnh hƣởng của nhiệt độ nên chúng có vai trò tự sửa chữa khi gặp các yếu tố cực đoan nhất là nhiệt độ cao. MGPT làm một nhóm gồm nhiều loại protein khác nhau nhƣng chúng đều có chức năng tham gia tạ o cấu trúc không gian đúng cho protein trong tế bào . MGPT đƣợc tăng cƣờng tổng hợp trong điều kiện cực đoan do nhu cầu cấp thiết của tế bào nhất là do tác động của nhiệt độ. Các nhóm HSP90, HSP100 đều có tính bảo thủ cao, có hoạt tính ATPase. Một số tìm thấy trong tế bào bình thƣờng, nhƣng phần lớn chúng sinh ra khi gặp các điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhƣ hạn, nóng, lạnh. Chức năng chính của chúng là ngăn chặn sự co cụm của protein và tái hoạt hoá protein biến tính [25], [32]. Protein LEA (Late embryogenesis abundant protein) là protein tổng hợp với số lƣợng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình phát triển phôi và là một trong những Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
31. 21 nhóm protein quan trọng liên quan đến điều kiện mất nƣớc của tế bào. Nhóm gen mã hoá loại protein LEA còn đóng vai trò quan trọng trong tính chịu khô hạn của hạt. Khi điều kiện mất nƣớc xảy ra, LEA tham gia vào bảo vệ màng tế bào, cô lập ion, ổn định pH tế bào [25], [27], [32]. Nghiên cứu tính chịu hạn về mặt sinh lý, hoá sinh, cấu trúc tế bào nhận thấy một loạt những biến đổi sâu sắc ở tất cả các mức độ khác nhau trong các giai đoạn phát triển khác nhau. Điều đó chứng tỏ tính chống chịu là đa gen, tức là do nhiều gen quyết định, biểu hiện trong các giai đoạn phát triển khác nhau của cây. Ngày nay trên thực tế vẫn chƣa tìm đƣợc gen thực sự quyết định tính chịu hạn mà mới chỉ tìm thấy các gen liên quan đến tính chịu hạn. 1.2.4. Nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây lúa Nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây lúa đã thu hút đƣợc nhiều tác giả quan tâm. Silva và Cs (1986) nghiên cứu đặc điểm hình thái của bộ rễ lúa nhận thấy tổng chiều dài bộ rễ có liên quan chặt chẽ đến tính chịu hạn của lúa nƣơng [84]. Sau đó các nghiên cứu về đặc điểm sinh lý, hoá sinh liên quan đến khả năng chịu hạn của lúa đƣợc quan tâm. Đinh Thị Phòng (2001) đã chọn, tạo đƣợc giống lúa DR1 và DR2 cho năng suất cao, ổn định, có khả năng chịu hạn, chịu lạnh hơn hẳn so với giống lúa gốc bằng phƣơng pháp chọn dòng tế bào soma [40]. Bằng xử lý mô sẹo lúa một tuần tuổi bằ ng NaCl, Lê trần Bình và Cs (1998) đã chọn đƣợc hai dòng lúa có khả năng chịu muối là C0 và C8 [1]. Lê Xuân Đắ c (1998) xử lý lạnh hai giống lúa C71 và TK90 ở nhiệt độ 1±0,50C đã thu đƣợc một số dòng lúa có khả năng chịu lạnh [5]. Nguyễn Thu Hoài (2005) nghiên cứu khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn địa phƣơng thu thập ở Bắc Kạn, Cao Bằng, Sơn La đã so sánh đƣợc khả năng chịu hạn của các giống lúa để làm vật liệu khởi đầu cho việc chọn, tạo các giống lúa [17]. Cũng theo hƣớng nghiên cứu này Bùi Thị Thu Thuỷ (2006) đã đánh giá đƣợc khả năng chịu hạn của các giống lúa CR203, U17, KD18, BT [54]. Price và Cs (2002) sử dụng RFLP và AFLP, SSR đã xác định đƣợc 142 chỉ thị phân tử liên quan đến tính trạng số lƣợ ng của cây lúa cạn có khả năng tránh hạn[ 83]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
32. 22 Từ thực trạng đang mất dần nguồn gen lúa cạn, đến nay đã có nhiều công trình sƣu tập đánh giá khả năng chịu hạn, đặc điểm hình thái, hóa sinh của các giống lúa nhằm bảo tồn nguồn gen quý. Đó là công trình nghiên cứu của Nguyễn Thu Hà và Cs (2003) về 47 giống lúa cạn sƣu tập tại các tỉnh phía Bắc [14], Trần Văn Thuỷ (1999) đánh giá nguồn gen cây lúa ở Tây Nguyên [53]. Các công trình nghiên cứu của Đỗ Thị Dƣơng (2001) [11], của Nguyễn Thị Hải Yến (2002) [58], Vì Thị Xuân Thủy (2008) [61], của Nguyễn Đức Hoàng (2008) [18] đã nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa hạt, phân tích đa hình protein hạt và khả năng chịu hạn của các giống lúa. 1.3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thức vật vào việc đánh giá khả năng chống chịu ở cây lúa 1.3.1. Hệ thố ng nuôi cấ y Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể đƣợc sử dụng để đánh giá khả năng chố ng chị u củ a cây trồ ng ở nhiề u mƣ́ c độ khá c nhau nhƣ mƣ́ c gen, mƣ́ c tế bà o riêng rẽ , các loại mô , cơ quan nuôi cấ y phân lậ p và cây hoà n chỉ nh . Sƣ̉ dụ ng kỹ thuậ t nuôi cấ y mô tế bà o thƣ̣ c vậ t có thể nghiên cƣ́ u mộ t cá ch đơn độ c hay tổ hợ p các tác động bất lợi mà ngoài tự nhiên khó thực hiện đƣợc , qua đó cho phé p tì m hiể u và xá c đị nh bả n chấ t sinh họ c củ a tí nh chố ng chị u [1]. Đối với mỗi loại thực vật nhất thiết phải nghiên cứu tối ƣu kỹ thuật nuôi cấy thích hợp cho việc đánh giá . Nhƣ̃ ng hệ thố ng nuôi cấ y thƣờ ng đƣợ c sƣ̉ dụ ng là nuôi cấ y mô sẹ o , nuôi cấ y tế bà o huyề n phù , nuôi cấ y tế bà o trầ n . Đá nh giá khả năng chố ng chị u bằ ng nuôi cấ y mô có thể đƣợ c tiế n hà nh theo hai cá ch : trƣ̣ c tiế p và giá n tiế p. Đa số trƣờng hợp ngƣời ta tiến hành đánh giá trực tiếp . Mô sẹ o đƣợ c gây stress bở i cá c tá c nhân cƣ̣ c đoan . Sau thờ i gian để mô sẹ o phụ c hồ i , đá nh giá khả năng chố ng chị u thông qua cá c tế bà o số ng só t . Các tế bào trên đƣợc cấy chuyể n lên môi trƣờ ng tá i sinh cây để tiế p tụ c đá nh giá [5], [42]. Mô sẹ o là khố i cá c tế bà o mô mề m có mức độ cấu trúc thấp , chƣa phân hoá , phân chia mộ t cá ch hỗ n loạ n và có tí nh biế n độ ng di truyề n cao . Nhiề u tá c giả đã thôn g bá o nhậ n đƣợ c cây tá i sinh tƣ̀ mô sẹo qua nhiều lần cấy chuyển có sự thay đổi về nhiễm sắc thể (dị bội, đa bộ i) và nhƣ̃ ng biế n đổ i di truyề n khá c . Mặ t khá c nhƣ̃ ng cây tá i sinh tƣ̀ mô sẹ o vớ i nhƣ̃ ng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
33. 23 biế n đổ i di truyề n phong phú lại rất có ý nghĩa trong chọn giống và nhƣ vậy vật liệu di truyề n củ a cây đó trở nên phong phú hơn [1]. Hiệ n nay ngƣờ i ta đã tá i sinh đƣợ c cây hoà n chỉ nh tƣ̀ mô sẹ o vớ i hiệ u suấ t rấ t cao ở nhiề u loạ i cây trồ ng có ý nghĩa kinh tế nhƣ : lúa nƣớc, lúa mì, lúa mạch, thuố c lá , củ cải đƣờng, mía, chuố i, đu đủ 1.3.2. Mộ t số thành tựu về đá nh giá khả năng chố ng chị u và chọn dòng tế bào soma bằ ng kỹ thuậ t nuôi cấ y in vitro Nhƣ̃ ng yế u tố bấ t lợ i củ a môi trƣờ ng nhƣ nhiệ t độ cƣ̣ c đoan (nóng, lạnh), lƣợ ng mƣa không phù hợ p (hạn), độ c tố đấ t gây phè n (nhôm, pH thấ p), mặ n (muố i NaCl) là nhƣ̃ ng yế u tố gây hạ n chế tớ i năng suấ t cây trồ ng. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào th ực vật đã đạt đƣợc những thành công nhất đị nh trong việ c nghiên cƣ́ u khả năng chố ng chị u củ a cây trồ ng nhƣ : chịu hạn [40], [41], chịu lạnh [5], chịu nhiệt độ cao [48], chịu muối NaCl [29]. Innis M.A., Gelfand D.H.,Sninsky J.J, White T.J (1990) tiế n hà nh gây mấ t nƣớ c mô sẹ o lú a và đã nhậ n thấ y ABA là chấ t là m tăng khả năng giƣ̃ nƣớ c và chị u mấ t nƣớ c củ a mô sẹ o lú a. Nồ ng độ ABA thí ch hợ p cho việ c tiề n xƣ̉ lý mô sẹ o lú a là 10-5M và thờ i gian xƣ̉ lý là 5 đến 7 ngày [77]. Bằ ng kỹ thuậ t nuôi cấ y mô sẹ o in vitro, Nguyễn Hoàng Lộc và CS (1992) đã thu đƣợ c 4 dòng thuốc lá chịu NaCl 1%, các dòng này vẫn duy trì khả năng chịu NaCl sau 18 tháng nuôi cấy trên môi trƣờng không có NaCl và ở thế hệ thứ nhất (R1) [29]. Lê Xuân Đắc (1998), khi xử lý lạnh 2 giống lúa 71 và TK 90 ở nhiệt độ 10C 0,50C đã thu đƣợc một dòng lúa duy trì khả năng chịu lạnh có triển vọng làm giống [5] Đinh Thị Phò ng (2001), Bằ ng phƣơng phá p thổ i khô mô sẹo lúa của các giống lúa CR203, CH133, Lố c, X11, C70, đã thu đƣợ c 271 dòng mô và 900 dòng cây xanh có khả năng chị u hạ n , tạo thành các quần thể R 0 làm nguyên liệu cho việc chọn lọc [40]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
34. 24 Nguyễ n Hoà ng Lộ c (1992) sƣ̉ dụ ng kỹ thuậ t nuôi cấ y mô sẹ o kế t hợ p vớ i việ c tiề n xƣ̉ lý bằ ng ABA , manitol và saccharose đã thu đƣợ c cá c dò ng mô thuố c lá SC, SC2, SC3 có khả năng chịu mất nƣớc trên 90% trọng lƣợng tƣơi [29]. Nguyễ n Thị Tâm (2004), bằ ng phƣơng phá p x ử lý mô sẹo các giống lúa CR203, CS4, Ml107, 79-1, CN2, ĐH60 ở nhiệt độ cao (400C, 420C) đã tạ o ra đƣợ c 197 dòng mô có khả năng chịu nóng và 520 dòng cây xanh [48]. Nghiên cƣ́ u khả năng chị u hạ n ở cây trồ ng nó i chung và cây lú a nói riêng đã và đang đƣợc nhiều tác giả quan tâm . Tuy nhiên việ c ƣ́ ng dung kỹ thuậ t nuôi cấ y mô tế bà o thƣ̣ c vậ t trong việ c nghiên cƣ́ u khả năng chị u hạ n vẫ n cò n nhiề u hạ n chế . Trong nhƣ̃ ng năm gầ n đây , vớ i sƣ̣ hoà n thiệ n về kỹ thuậ t và điề u kiệ n nuôi cấ y đã mở ra nhiề u triể n vọ ng cho việ c nhiên cƣ́ u khả năng chị u hạ n ở cá c đố i tƣợ ng cây trồ ng khá c nhau, trong đó có cây lú a. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
35. 25 Chƣơng 2. VẬ T LIỆ U VÀ PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U 2.1. Vật liệu và địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu thực vật Sử dụng 5 giống lúa sƣu tầm ở Huyện Bắc Quang, tỉnh Hà Giang (Tên giống lúa theo tên địa phƣơng) bao gồm: Ngái nỏ, Khẩu tán, khẩu mang, Khẩu đen, Shan râu đƣợc trình bày ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Các giống lúa cạn sử dụng làm vật liệu nghiên cứu Stt Kí hiệu mẫu Tên địa phƣơng Địa điểm thu mẫu 1 NN Ngái nỏ Bắc Quang - Hà Giang 2 KT Khẩu tán Bắc Quang - Hà Giang 3 KM Khẩu mang Bắc Quang - Hà Giang 4 KĐ Khẩu đen Bắc Quang - Hà Giang 5 SR Shan râu Bắc Quang - Hà Giang 2.1.2. Hóa chất và thiết bị Hoá chất: Hóa chất sử dụng đƣợc mua ở các nƣớc Anh, Đức, Trung Quố c gồ m: Ethanol, agarose, Na2HPO4.12H2O, axit citric, NaOH, NaCl, CuSO4, Na2CO3, C4H4O6KNa.4 H2O, thuốc thử foling, petroleum ether, SDS, acrylamide, axit sunfosalysilic, các loại đệm phosphat citrat, tinh bột chuẩn, K3[Fe(CN)6], Fe2(SO4)3, H2SO4, gelatin, 2,4D (Axit Dichlorphenoxyacetic), -NAA (Axit Naphthylacetic), kinetin, các chất khoáng đa lƣợng , vi lƣợ ng, vitamin, prolin chuẩ n, tinh bộ t chuẩ n, toluen, và nhiều hóa chất thông dụng khác. Thiết bị: Các thiết bị chính đƣợc sử dụng để phân tích các chỉ tiêu gồm: Máy phân tí ch axit amin tƣ̣ độ ng – HP aminno Quan SeriesII (Hewlett Parkard), máy Quang phổ UVvis Cintra 40 (Australia), bộ điện di protein của hãng Biorad (Mỹ), cân phân tích điện tử (Thụy Sỹ, Anh), máy ly tâm lạnh của hãng Hittich (Đức), máy đo pH (Metter Toledo), tủ lạnh sâu -850C, box cấy, nồi khử trùng Tomy (Nhật Bản), tủ sấy, máy khuấy trộn Voltex và một số thiết bị thông dụng khác. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
36. 26 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu Các chỉ tiêu đƣợc nghiên cứu và phân tích đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Thƣ̣ c vậ t họ c , Di truyền học, Công nghệ tế bào và Công nghệ gen Khoa Sinh- KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm- Đại học Thái Nguyên. 2.2. Phƣơng phá p nghiên cƣ́ u 2.2.1. Phƣơng pháp phân loại các giống lúa cạn Phân loại lú a nế p , lúa tẻ dựa theo phản ứng bắt màu với dung dịch KI 1% theo Lƣu Ngọc Trình, 1997 [56]. Phân loại loài phụ dựa theo tỷ lệ dài /rộng và khả năng bắt màu với thuốc thử phenol 10% của vỏ hạt thóc theo phƣơng phá p củ a Chang (1976) [70]. Đánh giá các tính trạng hình thái hạt thóc, đặc điểm chất lƣợng hạt gạo xay theo tiêu chuẩn của IRRI [76]. 2.2.2. Phƣơng phá p hó a sinh 2.2.2.1. Phương phá p phân tí ch hó a sinh ở giai đoạ n hạ t tiề m sinh (1) Xác định hàm lượng protein : Hàm lƣợng protein tan đƣợc xác định theo phƣơng phá p Lowry đƣợ c mô tả trong tà i liệ u củ a Phạ m Thị Trân Châu và Cs (1997) [3]. Hạt thóc đƣợc bóc vỏ, nghiền mịn, sấy đến khô tuyệt đối ở 1050C. Cân 0,05g mẫu cho vào eppendorf, thêm 1,5 ml đệm chiết phostphat citrat pH=10, lắc đều bằ ng voltex 10 phút, để qua đêm ở nhiệt độ 40C, đem ly tâm 12000 vòng/phút ở 40C trong 30 phút, rồ i thu lấ y dị ch để là m thí nghiệ m. Thí nghiệm lặp lại 3 lầ n. Dịch chiế t đƣợc định mức lên 5ml bằ ng dung dị ch đệ m ph osphat citrat (pH=10) và đo phổ hấp thụ trên máy U Vvis Cintra ở bƣớc sóng 750nm với thuốc thử foling. Hàm lƣợng protein đƣợ c tí nh theo công thƣ́ c : A HSPL X (%) = 100 % (2.1) m Trong đó : X: hàm lƣợng protein (% khố i lƣợ ng khô) A: nồ ng độ thu đƣợ c khi đo trên má y (mg/ml) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
37. 27 HSPL: hệ số pha loã ng m: khố i lƣợ ng mẫ u (mg) (2) Xác đị nh hà m lượ ng đườ ng tan : Hàm lƣợng đƣờng đƣợc xác định theo phƣơng pháp vi phân tích đƣợc mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và Cs (1997) [3]. Mẫ u đƣợ c bó c vỏ , sấ y khô tuyệ t đố i ở 1050C. Cân 0,5g mẫu nghiền trong 4ml nƣớc cất. Ly tâm 12000 vòng/phút ở 40C trong 30 phút, thu dị ch. Hàm lƣợng đƣờng tan đo phổ hấ p thụ ở bƣớc sóng 585 nm. Hàm lƣợng đƣờng tan đƣợc tính dựa trên đồ thị đƣờ ng chuẩ n glucose. Tính kết quả tí nh theo công thƣ́ c: a b HSPL X (%) = (%) (2.2) m Trong đó: X: hàm lƣợng đƣờng tan (% khố i lƣợ ng chấ t khô) a: mật độ quang đo đƣợc trên máy ở bƣớc sóng 585nm b: số ml dịch chiết HSPL: hệ số pha loãng m: khối lƣợng mẫu (mg) (3) Phương phá p xá c đị nh thà nh phầ n axit amin Hàm lƣợng axit amin đƣợc xác định trên máy HP - Amino Quant sƣ̉ dụ ng ortho- phtalandehyt tạ o dẫ n xuấ t đố i vớ i cá c axit amin bậ c 1 và 9 – fluoreryl- metyl- clorofomat đố i vớ i cá c axit amin bậ c 2. Mẫ u đƣợ c xƣ̉ lý theo phƣ ơng phá p thủ y phân pha lỏ ng theo hƣớ ng dẫ n sƣ̉ dụ ng má y phân tí ch axit amin tƣ̣ độ ng. 2.2.2.2. Đá nh giá khả năng chị u hạ n sinh lý thông qua phân tí ch mộ t số chỉ tiêu sinh hó a ở giai đoạ n hạ t nả y mầ m (1) Chuẩ n bị mẫ u: Hạt của các giống lúa nghiên cứu sau khi xử lý nhiệt 350C trong 10 phút, ngâm nƣớ c trong 24h sau đó ủ trong dung dịch MS chứa sorbitol 5 %. Hạt nẩy mầm sau các thời gian ủ 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày đƣợc lấ y để xá c đị nh hoạ t độ củ a enzym protease và hà m lƣợ ng protein tan , hoạt độ của enzym - amylase và hà m lƣợ ng đƣờ ng tan. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
38. 28 (2) Xác định hoạt độ của enzym - amylase Xác định hoạt độ enzym - amylase theo phƣơng pháp của Heilken đƣợc mô tả trong tài liệu của Nguyễ n Lân Dũ ng (1979) [10]. Hoạt độ enzym - amylase đƣợ c xá c đị nh dƣ̣ a trên lƣợ ng tinh bộ t bị enzym thủy phân trong thờ i gian 30phút ở 300C. Giá trị mật độ quang đƣợc đo ở bƣớc sóng 560nm trên má y quang phổ UVvis Cintra 40. Nguyên tắ c : Dựa vào tính chất hòa tan của enzym - amylase trong dung dịch đệm phosphat 0,2 M pH = 6,8. Hạt thó c nẩ y mầ m bó c vỏ , cân khố i lƣợ ng, nghiề n trong đệ m phosphat 0,2M pH = 6,8, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, thu dị ch để xá c đị nh hoạ t độ của enzym. Thí nghiệm phân tích hoạt độ enzym - amylase đƣợc tiến hành với ống thí nghiệm và ống kiểm tra , cơ chất là tinh bột 1% đo trên má y quang phổ ở bƣớ c sóng 560nm. Hoạt độ của enzym - amylase đƣợ c tí nh dƣ̣ a trên đồ thị đƣờ ng chuẩ n xây dƣ̣ ng bằ ng tinh bộ t. Hoạt độ enzym - amylase đƣợc tính theo công thức: (C C ) HSPL A (ĐVHĐ/ mg) = 21 (2.3) h Trong đó: A: hoạt độ enzym - amylase (ĐVHĐ/mg) C2: lƣợ ng tinh bộ t cò n lạ i củ a mẫ u thí nghiệ m (mg/ml) C1: lƣợ ng tinh bộ t cò n lạ i củ a mẫ u kiể m tra (mg/ml) h: khố i lƣợ ng mẫ u (mg) HSPL: hệ số pha loã ng Định tính hoạt độ enzym - amylase : Thành phần hỗn hợp dịch: Thạch agar 2%, tinh bột 1% và nƣớc cất. Cho hỗn dịch vào bình tam giá c đun cách thuỷ cho tan thạch , đổ vào đĩa petri dày 4mm để nguội, đục lỗ đƣờng kính 9mm. Nhỏ 100µl dịch chiết chứa enzym vào mỗi lỗ, để tủ lạnh qua đêm để enzym khuyếch tán, chuyển sang tủ ấm ở 300C trong 24giờ. Nhuộm bằ ng lugol 5phút và tráng lại bằng NaCl 1N. (3) Xác định hàm lượng đường tan Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
39. 29 Hàm lƣợng đƣờng tan đƣợc xác định nhƣ mô tả ở mục 2.2.2.1 (4) Xác định hoạt độ enzym protease Hoạt độ enzym protease xá c đị nh theo phƣơng phá p Anson theo mô tả củ a Nguyễ n Văn Mù i (2001) [36]. Hạt thó c nẩ y mầ m bó c vỏ , cân khố i lƣợ ng , nghiề n trong đệ m phosphat (pH=6,5), ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, dịch thu đƣợc sử dụng làm thí nghiệm. Thí nghiệm phân tích hoạt độ enzym protease đƣợc tiến hành với ống thí nghiệm và ống kiểm tra đo trên má y quang phổ ở bƣớ c só ng 750nm. Hoạt độ của enzym protease đƣợ c tí nh dƣ̣ a trên đồ thị đƣờ ng chuẩ n xây dƣ̣ ng bằ ng tyrozin . Hoạt độ enzym protease tí nh theo công thƣ́ c: (n k) D HSPL ĐVHĐ/ mg (2.4) Tm Trong đó : n: Chỉ số đo đƣợc ở bƣớc song 750nm của ống thí nghiệm (mg/ml) k: Chỉ số đo đƣợc ở bƣớc song 750nm của ống kiể m tra (mg/ml) D: số ml dị ch chiế t HSPL: hệ số pha loã ng m: khố i lƣợ ng mẫ u (mg) T: thờ i gian ủ enzym vớ i cơ chấ t (phút) Định tính hoạt độ enzym protease: Tiế n hà nh tƣơng tƣ̣ nhƣ đị nh tí nh hoạ t độ enzym - amylase, cơ chấ t là gelatin 1%. (5) Xác định hàm lượng protein tan Hàm lƣợng protein tan đƣợc xá c đị nh nhƣ mô tả ở mụ c 2.2.2.1. 2.2.3. Đá nh giá khả năng chị u hạ n ở giai đoạ n mạ bằ ng phƣơng phá p gây hạ n nhân tạ o Phƣơng phá p đá nh giá khả năng chị u hạ n ở giai đoạ n mạ đƣợ c tiế n hà nh theo Lê Trầ n Bì nh và Cs (1998) [1]. Hạt lúa nảy mầm gieo vào các bát nhựa nhỏ có kích thƣớc bằng nhau , mỗ i hộ p 50 hạt. Cát vàng đãi sạch , phơi khô cho và o cá c hộ p vớ i lƣợ ng nhƣ nhau . Thí nghiệ m đƣợ c lặ p lạ i 3 lầ n cho mỗ i chỉ tiêu nghiên cƣ́ u trong điề u kiệ n chăm só c nhƣ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
40. 30 nhau. Thờ i gian đầ u tƣớ i nƣớ c cho đủ ẩ m , khi cây đƣợ c 3 lá thật thì tiến hành gây hạn nhân tạo và đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lúa . Theo dõ i cá c chỉ tiêu liên quan đế n khả năng chị u hạ n trƣớ c và sau khi gây hạ n nhƣ sau: (1) Khố i lƣợ ng tƣơi củ a rễ , thân lá . (2) Khố i lƣợ ng khô củ a rễ , thân lá cá c mẫ u đƣợ c sấ y khô tuyệ t đố i ở 1050C đến khi khối lƣợng không đổi. (3) Xác định khả năng giữ nƣớc qua các giai đoạ n xƣ̉ lý bở i hạ n . Khả năng giƣ̃ nƣớ c đƣợ c tí nh theo công thƣ́ c: W W (%) xl x100 (2.5) Wkxl Trong đó : W: khả năng giữ nƣớc của cây sau khi xử lý hạn (%) Wxl : khố i lƣợ ng tƣơi củ a cây sau khi xƣ̉ lý hạ n (g) Wkxl : khố i lƣợ ng tƣơi của cây không xử lý hạn (g) (4) Xác định chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các giống theo công thức: 1 S sin (an.bn+bn.cn+ cn.dn +dn.en+ + kn.an) (2.6) 2 Trong đó : S : chỉ số chịu hạn tƣơng đối : là góc tạo bởi hai trục mang trị số liền nhau = 3600/9 a,b,c,d .k là cá c chỉ tiêu theo dõ i n : kí hiệu các giống nghiên cứu. (5) Xác định tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra đƣợc theo công thức: nb TH  0 (%) (2.7) nc Trong đó : TH: tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra (%) b: trị số thiệt hại mỗi cấp n0: số cây củ a mỗ i cấ p thiệ t hạ i c: trị số thiệt hại của cấp cao nhất n: tổ ng số cây xƣ̉ lý Các trị số: số cây chế t:trị số 3; số cây hé o: trị số 1; số cây không bị ả nh hƣở ng: trị số 0 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
41. 31 (6) Xác định hàm lƣợng prolin Xác định hàm lƣợng prolin theo phƣơng phá p củ a Bate L.S. và cộng sự (1973) [67]. * Chuẩn bị mẫu: Tiến hành tƣơng tự mục 2.2.3. * Tiến hành tách chiết prolin: Rễ , thân lá củ a cá c giố ng ở cá c thờ i điể m 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày gây hạn, cân khố i lƣợ ng 0,3 gram mẫu. Thêm 10ml dị ch chiế t axit sunfosalisilic 3 %, ly tâm lạ nh 7000 vòng/phút trong 20 phút và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml dịch chiết cho vào bình, bổ sung 2ml axit axetic và 2ml dung dịch ninhidrin, sau đó ủ trong nƣớc nóng 1000C trong 1 giờ, ủ trong tủ đá 5 phút. Bổ sung vào bình 4ml toluene, lắc đều và lấy phần dịch có màu hồng ở trên. Đo phổ hấ p thụ ở bƣớ c só ng 520nm. Hàm lƣợng prolin đƣợc xác định trên máy theo đồ thị chuẩn. Hàm lƣợng prolin đƣợ c tí nh theo công thƣ́ c: AxHSPL Xx(%) 100 (2.8) m Trong đó : X: hàm lƣợng prolin (%) A: nồ ng độ thu đƣợ c khi đo trên má y quang phổ HSPL: hệ số pha loã ng m: khố i lƣợ ng mẫ u (mg) 2.2.4. Phƣơng phá p nuôi cấ y in vitro 2.2.4.1. Tạo mô sẹo từ hạt lúa - Khử trù ng hạ t Hạt lúa đƣợc bóc vỏ trấu và khử trùng 1 phút trong cồn 700, 25 phút trong nƣớ c giaven 60%, lắ c nhẹ , rƣ̉ a sạ ch bằ ng nƣớ c cấ t vô trù ng 3 - 5 lầ n, sau đó chuyể n hạt lên đĩa petri có trải giấy lọc vô trùng. - Tạo mô sẹo Hạt gạo đã khử trùng đƣợc cấy vào môi trƣờng (MS) cơ bả n [42] bổ sung 2mg 2,4D, 3% saccharose, 0,9% agar, pH=5,8. Nuôi 1 tuầ n trong tố i , 2 tuầ n dƣớ i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
42. 32 ánh sáng đèn trong phòng nuôi cấy với cƣờng độ 2000lux, thờ i gian chiế u sá ng 8/24 giờ , nhiệ t độ 250C ± 10C. Đá nh giá tỉ lệ tạ o mô sẹ o sau 3 tuầ n nuôi cấ y của các giống theo công thức: Ncp Ci (%)= X 100 (2.9) Nt Trong đó : Ci: Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Ncp: Số hạt tạo mô sẹo Nt: Tổng số hạt nuôi cấy 2.2.4.2. Phương phá p xử lý thổ i khô mô sẹ o Mô sẹ o sau 3 tuầ n nuôi đƣợ c cắ t thà nh nhƣ̃ ng khố i mô có kí ch thƣớ c khoả ng 3mm x 3mm. Đặt những khối mô này lên đĩa petri có lót giấy vô trùng và thổi khô bằ ng luồ ng khí vô trù ng củ a box cấ y ở cá c ngƣỡ ng thờ i gian khá c nhau . Xác định độ mấ t nƣớ c củ a mô sẹ o sau 2, 4, 6 và 8 giờ xƣ̉ lý thổ i khô liên tụ c. Độ mất nƣớc của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô đƣợc tính theo công thức: Wf - Wd WL (%)= x 100 (2.10) Wf Trong đó : WL: Độ mất nƣớc (%) Wf: Khối lƣợ ng mô tƣơi (mg) Wd: Khối lƣợ ng mô sau thổ i khô (mg) 2.2.4.3. Chọn lọc mô sẹo sống sót sau xử lý và tái sinh cây Cấ y mô sẹo sau khi xử lý mất nƣớc lên môi trƣờng tái sinh cây (MS cơ bả n + 2% saccharose + 0,8% agar + 1 mg/l kinetin + 0,2mg/l NAA, pH=5,8). Mậ t độ cấ y 20 mô/bình. Nuôi dƣớ i á nh sá ng đè n neon trong phò ng nuôi cấ y vớ i cƣờ ng độ 2000lux, thờ i gian chiế u sá ng 8/24 giờ . Nhiệ t độ phò ng nuôi 250C ± 10C. Tỷ lệ mô sẹo sống sót đƣợc đánh giá sau 3 tuầ n nuôi theo công thƣ́ c: Nvs Sv (%)= x 100 (2.11) Nt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
43. 33 Trong đó : Sv: Tỷ lệ mô sống sót (%) NSV: Số mô số ng só t Nt: Tổ ng số mô xƣ̉ lý Tỷ lệ tái sinh cây đƣợc đánh giá sau 6 tuầ n nuôi theo công thƣ́ c: Nr RC (%) = x 100 (2.12) NSV Trong đó : Rc: Tỷ lệ tái sinh Nsv: Số mô số ng só t Nr: Số mô tá i sinh cây 2.2.4.4. Xác định nhanh sức sống của tế bà o và mô bằ ng phƣơng phá p nhuộ m TTC Hạt của 6 giố ng lú a đƣợ c sƣ̉ dụ ng là m nguyên liệ u tạ o mô sẹ o nhƣ mụ c 2.2.2.1. Sau đó tiế n hà nh xƣ̉ lý thổ i khô ở ngƣỡ ng thờ i gian 4 giờ . Xác định sức sống của tế bào mô sẹo bằng p hƣơng phá p nhuộ m TTC theo Towill và CS (1975) [89]. Cân 0,6 gam TTC pha loã ng trong 25ml nƣớ c cấ t. Dung dịch MS pha loãng 10 lầ n. Cân 30 mg mô sẹ o cho và o ố ng nghiệ m , thêm 0,5ml dung dị ch MS pha loã ng 10 lầ n và 0,25ml dung dị ch TTC , để 12 giờ trong tố i ở nhiệ t độ 250C. Sau đó dù ng pipet gạ n bỏ phầ n dung dị ch , rƣ̉ a 2 lầ n bằ ng nƣớ c cấ t rồ i cho thêm 5 ml cồ n 90%, thuỷ phân ở nhiệt độ 600C trong thờ i gian 2 giờ . Dung dịch thu đƣợc đem đo ở bƣớc sóng 485 nm. Đối chứng là mô sẹo của các giống không qua xƣ̉ lý thổ i khô. 2.2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu và tính toán kết quả Mỗi mẫu nghiên cứu đƣợc lặp lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định các trị số thống kê, nhƣ trung bình mẫu ( X ), phƣơng sai ( 2 ), độ lệch chuẩn () và sai số trung bình mẫu ( S x ), hệ số tƣơng quan R Các số liệu thố ng kê đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình Excel vớ i mƣ́ c ý nghĩ a = 0,05 theo Nguyễ n Hả i Tuấ t và Ngô Kim Khôi (1996) [57]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
44. 34 Chƣơng 3. KẾ T QUẢ VÀ THẢ O LUẬ N 3.1. Phân loạ i, đặ c điể m hì nh thá i củ a cá c giố ng lú a 3.1.1. Phân loạ i cá c giố ng lú a Hạt của 5 giống lúa đƣợc tiến hành phân loại theo nếp/tẻ dựa vào phản ứng bắt màu với dung dịch KI 1% theo Lƣu Ngọc Trình [56], phân loại loài phụ dựa vào tỷ lệ dài/rộng của hạt thóc và khả năng bắt màu thuốc thử phenol 10% theo Chang [70], kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Phân loại các giống lúa nghiên cƣ́ u Phân loại theo Phân loại theo bắt màu Ký Kết luận Lúa dài/ rộng phenol hiệu chung về nếp/tẻ D/R Bắt màu mẫu Loài phụ Loài phụ loại phụ ( mm ) phenol NN Tẻ 2,69 Japonica - Japonica Japonica KT Tẻ 2,45 Japonica - Japonica Japonica KM Tẻ 2,40 Japonica - Japonica Japonica KĐ Tẻ 2,57 I/J + Indica Indica SR Tẻ 2,48 I/J + Indica Indica (D: Dài hạt thóc (mm); R: Rộng hạt thóc(mm); (+) Bắt màu phenol (-) Không bắt màu phenol; I/J: Không phân biệt đƣợc loài phụ) Qua bảng 3.1 cho thấ y, cả 5 giố ng lú a đề u là lúa tẻ. Căn cứ vào tỷ lệ chiề u dà i và chiều rộng hạt thóc thì trong 5 giố ng có 3 giố ng thuộ c loà i phụ Japonica và 2 giố ng không thể xá c đị nh đƣợ c . Kết quả này phù hợp với kết luận của nhiề u tá c giả : nếu chỉ căn cứ vào tỷ lệ dài/rộng để phân biệt loài phụ là rất khó và thiếu chính xác, vì khó có thể khẳng định đƣợc loại lúa nào khi tỷ lệ dài/rộng nằm trong khoảng 2,3- 3,0 [56]. Căn cƣ́ và o khả năng bắt màu với thuốc thử phenol 10%, kết quả phân loại xác định đƣợc trong 5 giống lúa cạn có 2 giống thuộc loài phụ Indica và 3 giống thuộc loài phụ Japonica. Phƣơng pháp này cho phép phân loại đƣợc lúa Indica và lúa Japonica tƣơng đối chính xác. Vì vậy, có thể sử dụng phƣơng pháp này để nhận Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
45. 35 biết gần đúng các giống lúa trong quỹ gen lúa cạn còn rất phong phú hiện nay. Tuy nhiên, trong số 3 giống thuộc loài phụ Japonica rất có thể còn có giống thuộ c loà i phụ Javanica, vì theo phƣơng pháp này chỉ có thể phân biệt đƣợc lúa Indica và lúa Japonica. Từ các kết quả trên nhận thấy , cả 5 giống lúa cạn sƣu tập đƣợc cá c giố ng đề u là lúa tẻ . Trong đó có 2 giống thuộc loài phụ Indica và 3 giống thuộc loài phụ Japonica , các giống thu thập đƣợc đều ở huyện Bắc Quang, tỉnh Hà Giang 3.1.2. Đặc điểm hình thái cá c giố ng lú a Hình thái và kích thƣớc hạt thóc là một đặc tính quan trọng trong chọn giố ng lú a. Chúng tôi tiến hành phân tích đặc điểm hình thái và kích thƣớc của các giố ng lú a dƣ̣ a theo phƣơng phá p cho điể m củ a IRRI [76]. Kế t quả đƣợ c trì nh bà y ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái và khối lƣợng 1000 hạt của các giống lúa Chỉ tiêu Màu Tỷ lệ dài/rộng Râu đầu Màu Hình dạng Khối lƣợng vỏ của hạt thóc hạt râu hạt thóc 1000 hạt (g) Giống trấu (mm) NN 0 0 3 2,68 2 34,66 0,44 KT 0 0 1 1,97 5 32,78 0,25 KM 5 5 7 2,91 2 29,33 0,38 KĐ 5 6 10 3,52 1 30,48 0,36 SR 9 3 4 3,29 1 31,34 0,27 Số liệu ở bảng 3.2 và hình 3.1 cho thấy, màu sắc của vỏ trấu ở các giống lúa nghiên cƣ́ u rấ t khá c nhau thể hiệ n sự đa dạng về tổ hợp gen xác định tính trạng này. Giố ng KĐ mà u trắ ng (điể m 10), giố ng KM có chấ m tí m trên nề n và ng rơm (điể m 7), giố ng KT có và nh và rã nh mà u và ng trên nề n và ng rơm (điể m 1), giố ng NN mà u hơi đỏ đế n tí m nhạ t (điể m 3) và giống SR có r ãnh nâu trên nền vàng rơm (điể m 4). Theo Khush G.H và Oka H.I (1996) có tới 13 locus phân bố trên 7 nhiễm sắc thể chi phối tính trạng màu sắc vỏ trấu. Tuỳ theo tổ hợp alen của chúng mà vỏ trấu có màu sắc khác nhau, tính trạng vàng rơm là trội hơn so với tính trạng màu vàng [78]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
46. 36 NN KT KM KĐ SR Hình 3.1. Hình thái hạt của các giống lúa nghiên cứu Về độ phủ lông trên vỏ trấu , các giống lúa thu thập đƣợc có 3 giống nhẵn là giố ng NN,KM, KĐ và 2 giống có lông trên sống vỏ trấu là KT và RS . Vỏ trấu nhẵ n không có lông bao phủ phù hợ p vớ i thị hiế u ngƣờ i tiêu dù ng hơn cá c giố ng có lông bao phủ . Tính trạng có râu, màu sắc râu phụ thuộc vào điều kiện môi trƣờng [6]. Trong 5 giố ng có giố ng NN và KT là không có râu đạ t điể m 0, 2 giố ng KM và KĐ râu dà i 5mm đạ t điể m 5 và giống SR râu dài 9mm đạ t điể m 9. Sƣ̣ đa dạ ng về chiề u dà i râu chƣ́ ng tỏ cá c giố ng nghiên cƣ́ u có kiểu gen khác nhau. Hình dạng hạt thóc là một tính trạng quan trọng trong chọn tạ o giố ng lú a. Hạt của các giống lúa tẻ thon dài càng đƣợc ƣa chuộng . Hình dạng hạt của các giống lúa nghiên cƣ́ u đề u có dạ ng thon dài . Trong đó giố ng KT đạ t điể m 5, giố ng NN và KM đạ t điể m 2, còn 2 giống còn lại đạ t điể m 1. Nhƣ vậ y hì nh dạ ng củ a cá c giố ng lúa đều phù hợp với thị hiếu ngƣời tiêu dùng và xuất khẩu. Khố i lƣợ ng 1000 hạt thóc là tính trạng không chỉ phụ thuộc vào kiểu gen mà còn phụ thuộc vào môi trƣờ ng, mùa vụ. Đồng thời cũng là chỉ tiêu quan trọng cấu thành năng suất [46]. Dẫ n liệ u bả ng 3.2 cho thấ y , khố i lƣợ ng 1000 hạt của các giố ng đề u cao biế n độ ng tƣ̀ 29,33g đế n 34,66g trong đó giố ng NN cao nhấ t và giố ng KM thấ p nhấ t. Khối lƣợng 1000 hạt cao nghĩa là hạt mẩ y, chắc, khi gieo cấy mầm khỏe, sức sống cao. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
47. 37 Kết quả phân tích đặc điểm hình thái, kích thƣớc và khối lƣợng hạt của 5 giống lúa cạn địa phƣơng theo tiêu chuẩn của IRRI đã cho thấy tính đa dạng của các giống lúa cạn thể hiện ở màu sắc vỏ trấu, râu đầu hạt, khối lƣợng 1000 hạt Đây là cơ sở cho việc sàng lọc các giống lúa có đặc tính tốt, đáp ứng đƣợc nhu cầu, thị hiếu của ngƣời tiêu dùng. 3.2. Đá nh giá chấ t lƣợ ng hạ t 3.2.1. Đá nh giá chấ t lƣợ ng hạ t trên phƣơng diệ n cả m quan Mộ t số chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng hạt trên phƣơng diện cảm quan đƣợc nghiên cƣ́ a theo phƣơng phá p cho điể m củ a IRRI [76]. Kế t quả đƣợ c trì nh bà y ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Mộ t số chỉ tiêu chấ t lƣợ ng hạ t củ a cá c giố ng lú a Dạng Độ bạc bụng Chiều dài Hình dạng Màu vỏ Hƣơng Giống nội nhũ nội nhũ gạo xay gạo xay cám thơm NN 2 0 2 2 2 2 KT 2 0 5 5 2 2 KM 1 1 2 2 6 0 KĐ 3 0 1 1 2 1 SR 1 0 1 1 2 0 Nộ i nhũ củ a hạ t gạ o chƣ́ a cá c chấ t di nh dƣỡ ng có giá trị nhƣ tinh bộ t , protein, lipit, vitamin Dẫ n liệ u bảng 3.3 cho thấ y, nộ i nhũ củ a 5 giố ng rất khác nhau , khi nhuộ m nộ i nhũ bằ ng dung dị ch I- KI 1% các giống đề u bắ t mà u xanh giố ng KĐ xanh đậm điểm 3, Hai giống NN, KT bắ t mà u xanh nhạ t điể m 2 và 2 giống bắt màu xanh nhạt nhất điểm 1 là KM, SR. Độ bạc bụng là hiện tƣợng gạo đục ở một phần hạt gạo đƣợc quy định bởi giống và ngoại cảnh. Chất lƣợng hạt gạo tỷ lệ nghịch với độ bạc bụng vì hạt gạo thƣờng bị gãy nát khi xay xát dẫn tới tỷ lệ gạo xay/thóc thấp. Mặt khác, phần bạc bụng ở hạt gạo chủ yếu chỉ có tinh bột và có ít protein . Hạt gạo bạc bụng có ít protein ở nội nhũ hơn là các hạt gạo khác trong cùng một giống . Qua dẫ n liệ u bảng 3.3, trong 5 giố ng chỉ có 1 giố ng KM là có độ bạ c bụ ng (điể m 1) còn 4 giố ng không có độ bạc bụng (điể m 0) đây là đặ c điể m tố t củ a cá c giố ng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
48. 38 Hình dạng hạt gạo xay giống hình dạng hạt thóc vì hình dạng hạt gạo do vỏ trấu khống chế nghiêm ngặt và vỏ trấ u phủ kí n sá t vớ i vỏ cá m . Màu vỏ cám gần giố ng mà u vỏ trấ u. Chiề u dà i hạ t gạ o xay đề u nằ m trong khoả ng 5,2mm đế n 6,1mm tạo nên hình tròn bầu của hạt gạo , đây chí nh là hì nh dạ ng phù hợ p vớ i thị hiế u tiêu dùng của lúa tẻ. Vớ i hì nh dạ ng nà y rấ t có lợ i trong khâu xay sá t, đá nh bó ng hạ t gạ o sẽ ít bị gãy , vụn. Các giống đều có độ thơm từ thơm ít đến rất thơm . Độ thơm là một chỉ tiêu góp phần nâng cao giá trị của các giống lúa . Đặc điểm này rất quý đối với nguồn gen của tập đoà n lúa gạo nƣớc ta. Nhƣ vậ y, nhƣ̃ ng chỉ tiêu đá nh giá chấ t lƣợ ng hạ t trên phƣơng diệ n cả m quan của hạt gạo ảnh hƣởng đến giá trị dinh dƣỡng , tỷ lệ gạo/thóc và sở thích ngƣời tiêu dùng và xuất khẩu. Trong đó xét trên phƣơng diện cảm quan thì giống NN, KT, KĐ có chất lƣợng tốt. 3.2.2. Đá nh giá chấ t lƣợ ng hạ t trên phƣơng diệ n hó a sinh 3.2.2.1 Hàm lƣợng protein, đƣờng tan trong hạt của các giống lú a Hàm lƣợng protein, đƣờng tan trong hạt là cơ sở đánh giá chất lƣợng hạt của các giống lúa. Để đá nh giá chấ t lƣợ ng hạ t củ a cá c giố ng nghiên cƣ́ u , chúng tôi tiến hành phân tích hàm lƣợng protein , đƣờ ng tan trong hạ t . Kế t quả đƣợ c trì nh bà y ở bảng 3.4. Protein là mộ t chỉ tiêu quan trọ ng để đá nh giá chấ t lƣợ ng lú a , hàm lƣợ ng protein tỷ lệ thuậ n vớ i chấ t lƣợ ng gạ o . So vớ i cá c loạ i ngũ cố c khá c thì hà m lƣợ ng protein củ a lú a thấ p hơn nhƣng là cá c protein dễ tiêu hó a và hấ p thụ vớ i cơ thể ngƣờ i và độ ng vậ t . Qua bảng 3.4 cho thấ y hà m lƣợ ng protein củ a cá c giố ng lú a đề u khá cao, dao độ ng tƣ̀ 7,98% đến 9,18%. Trong đó giố ng KT cao nhấ t (9,18%) tiế p đến là giống KĐ , SR, NN và thấ p nhấ t là giố ng KM (7,98%). Hàm lƣợng protein không chỉ là chỉ tiêu quan trọ ng để đá n h giá chấ t lƣợ ng hạ t mà cò n là chỉ tiêu quan trọng đánh giá khả năng chống chịu của cây [1], [11]. Trong quá trình chín của hạt lú a , các chất gluxit đơn giản dần đƣợc chuyển hoá thành các dạng gluxit phức tạp, gluxit dự trữ chủ yếu ở dạng tinh bột tích luỹ trong hạt, do đó hàm lƣợng đƣờng tan trong hạ t thấp . Bảng 3.4 cho thấ y hà m lƣợ ng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
49. 39 đƣờ ng tan củ a cá c giố ng đề u ở mức tƣơng đối thấ p , cao nhấ t là giố ng KT 1,484% tiế p đế n là giố ng KĐ (1,83%), SR (1,46%), NN (1,34%) và thấp nhấ t là giố ng KM (1,33%). Ngoài ra, đƣờng còn có tác dụng bảo vệ, chống lại sự khô hạn của nguyên sinh chất, điều chỉnh áp suất thẩm thấu dịch bào khi gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi. Bảng 3.4. Hàm lƣợng protein, đƣờ ng tan củ a cá c giố ng lú a (% khố i lƣợ ng khô) Giống Protein TS (%) Đƣờng tan (%) NN 8,33 0,12 1,35 0,09 KT 9,18 0,05 1,84 0,10 KM 7,98 0,14 1,34 0,07 KĐ 9,08 0,20 1,83 0,11 SR 8,45 0,13 1,46 0,12 3.2.2.3. Hàm lƣợng axit amin trong hạt của các giố ng lú a Thành phần axit amin là chỉ tiêu quan trọng đánh giá chất lƣợng protein của hạt. Bằ ng cá ch sƣ̉ dụ ng phƣơng phá p phân tí ch hà m lƣợ ng axit amin trong hạ t trên hệ má y HP - Amino Quant và dƣ̣ a và o sắ c ký đồ , chúng tôi xác đị nh đƣợ c hà m lƣợ ng axit amin trong hạ t (g axit amin/100g mẫ u) và đƣợc thể hiện ở bảng 3.5. Chúng tôi xác định đƣợc 17 loại axit amin trong hạt của các giống lúa. Trong đó , không có tryptophan vì loạ i axit amin nà y bị phân hủ y trong quá trình thủy phân bở i HCl 6N, cystein ở dạ ng hỗ n hợ p không phân tá ch đƣợ c , còn glutamin và asparagine chuyể n hó a thà nh a xit glutamic và axit aspactic . Kế t quả thu đƣợ c cho thấ y hà m lƣợ ng cá c axit amin chƣ́ a nhó m SH rấ t thấ p: metionin dao độ ng tƣ̀ 0,03 đến 0,05g/100g mẫ u và cystein từ 0,18 đến 0,24g/100g mẫ u . Giố ng KM có hà m lƣợ ng axit amin chƣ́ a nhó m SH thấ p nhấ t (0,23g/100g mẫ u) và cao nhấ t là giố ng KT (0,36g/100g mẫ u). Chấ t lƣợ ng củ a protein cũ ng đƣợ c tí nh theo tỷ lệ củ a tƣ̀ ng axit amin trong phân tƣ̉ protein ( g axit amin/ 100 protein) bảng 3.6. Protein củ a lú a chƣ́ a cá c axit amin không thay thế : valine, lơxin, isolơxin, metionin, phenylalanin, lizin, threonin, các axit amin này đều có trong thành phần axit amin củ a cá c giố ng lú a nghiên cƣ́ u vớ i hà m lƣợ ng khá c nhau . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
50. 40 Bảng 3.5. Hàm lƣợng axit amin hạt dự trữ của các giống lúa (g axit amin /100g mẫ u) STT Axit amin NN KT KM KĐ SR 1 Axit Aspatic 0,79 0,88 0,72 0,85 0,84 2 Axit Glutamic 1,27 1,56 1,33 1,59 1,33 3 Serin 0,45 0,48 0,42 0,50 0,26 4 Histidin 0,17 0,17 0,14 0,15 0,15 5 Glycin 0,37 0,36 0,37 0,40 0,39 6 Threonin 0,32 0,28 0,30 0,27 0,28 7 Alanin 0,56 0,63 0,53 0,65 0,61 8 Arginin 0,74 0,81 0,69 0,83 0,81 9 Tyrozin 0,37 0,36 0,32 0,40 0,40 10 Cystein + Cystin 0,24 0,31 0,18 0,19 0,24 11 Valin 0,60 0,64 0,55 0,63 0,62 12 Metionin 0,03 0,05 0,05 0,03 0,05 13 Phenylanin 0,49 0,56 0,47 0,55 0,52 14 Izolơxin 0,37 0,44 0,36 0,42 0,42 15 Lơxin 0,79 0,86 0,72 0,84 0,82 16 Lizin 0,23 0,21 0,21 0,19 0,19 17 Prolin 0,50 0,49 0,48 0,48 0,44 Tổng số 8,29 9,09 7,84 8,97 8,37 Khi so sá nh hà m lƣợ ng axit amin không thay thế củ a cá c giố ng lú a nghiên cƣ́ u vớ i tiêu chuẩ n củ a FAO (1976), chúng tôi n hậ n thấ y có threonin, valin, phenylalanin, lơxin đều có tỷ lệ cao hơn tiêu chuẩn . Axit amin isolơxin có giống KM và KĐ là đạ t tiêu chuẩ n cò n cá c giố ng khá c đề u thấ p hơn , trong đó giố ng KT thấ p nhấ t (3,33g/100g protein). Các giống đều có methyonin và lizin thấ p hơn tiêu chuẩ n nhấ t là methyonin, kế t quả nà y thể hiệ n ở bảng 3.7 và hình 3.2. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
51. 41 Bảng 3.6. Thành phần và lƣợng axit amin trong protein hạt của các giống lúa (g axit amin/100g protein) STT Axit amin NN KT KM KĐ SR 1 Axit Aspatic 9,22 9,21 9,67 9,03 9,53 2 Axit Glutamic 21,23 24,11 20,45 25,56 27,19 3 Serin 3,87 3,51 3,55 4,04 4,92 4 Histidin 1,95 1,82 1,54 1,31 1,89 5 Glycin 3,65 3,89 3,86 3,45 3,65 6 Threonin 4,08 4,34 3,76 4,05 4,06 7 Alanin 6,12 5,32 5,98 6,15 6,65 8 Arginin 8,43 8,03 8,72 8,27 8,88 9 Tyrozin 2,98 2,87 3,03 4,11 4,28 10 Cystein + Cystin 2,16 2,34 2,15 2,78 2,93 11 Valin 6,34 6,88 5,94 6,93 6,37 12 Metionin 0,25 0,19 0,22 0,58 0,35 13 Phenylanin 6,13 6,21 6,87 6,91 6,18 14 Izolơxin 3,67 3,33 4,18 4,32 4,65 15 Lơxin 8,65 9,45 8,56 8,04 8,16 16 Lizin 3,12 2,86 2,14 2,38 3,02 17 Prolin 4,99 4,65 4,86 5,67 5,92 Tổng số 86,46 99,01 81,67 94,00 92,94 Bảng 3.7. Thành phần và hàm lƣợng các axit amin không thay thế trong hạ t củ a cá c giố ng lú a (g axit amin/ 100g protein) Axit STT FAO NN KT KM KĐ SR amin 1 Thr 2,80 4,08 4,34 3,76 4,05 4,06 2 Val 4,20 6,34 6,88 5,94 6,93 6,37 3 Met 2,20 0,25 0,19 0,22 0,58 0,35 4 Phe 2,80 6,13 6,21 6,87 6,91 6,18 5 Iso 4,20 3,67 3,33 4,18 4,32 4,65 6 Leu 4,20 8,65 9,45 8,56 8,04 8,16 7 Lys 4,20 3,12 2,86 2,14 2,38 3,02 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
52. 42 10 9 8 FAO 7 NN 6 KT 5 KM thế(%) 4 KĐ 3 SR 2 1 Hàm lƣợng Hàm axit amin không thay 0 Thr Val Met Phe Iso Leu Lys Axit amin Hình 3.2. Hàm lƣợng axit amin không thay thế của các giống lúa nghiên cứu với tiêu chuẩ n củ a FAO Tƣ̀ kế t quả phân tí ch mộ t số chỉ tiêu về chấ t lƣợ ng hạ t trên phƣơng diệ n cả m quan và hó a sinh củ a 5 giố ng lú a nghiên cƣ́ u có thể rú t ra mộ t số nhậ n xé t sau: (1) Các đặc điểm về chiều dài, hình dạng hạt gạo, dạng nội nhũ, độ bạ c bụ ng, độ thơm củ a cá c giố n g lú a í t có sƣ̣ sai khá c và đề u phù hợ p vớ i thị hiế u tiêu dù ng . Kế t hợ p kế t quả phân tí ch hà m lƣợ ng protein , đƣờ ng tan, chúng tôi nhận thấy giống KT có chấ t lƣợ ng gạ o là tố t nhấ t tiế p đế n là giố ng KĐ , SR, NN và ké m nhấ t là giố ng KM. (2) Hàm lƣợng và thành phần axit amin không thay thế trong hạt của các giố ng có threonin, valin, phenylalanin, lơxin đều có tỷ lệ cao hơn tiêu chuẩ n củ a FAO, còn methyonin và lizin các giống đều thấp hơn tiêu chuẩn. 3.3. Đá nh giá khả năng chị u hạ n củ a cá c giố ng lú a 3.3.1. Khả năng chịu hạn của các giống ở giai đoạn nảy mầm 3.3.1.1. Ảnh hưởng của hạn sinh lý đến hoạt độ của - amylase và hà m lượ ng đườ ng củ a cá c giố ng lú a ở giai đoạn nảy mầm Amylase là enzym phân giả i tinh bộ t, gồ m 3 loại là -amylase, -amylase và glucose amylase. Enzym -amylase xú c tá c cho phả n ƣ́ ng thủ y phân liên kế t 1-4 glucozit củ a tinh bộ t và mộ t số polysacarit khá c . Enzym -mylase đƣợ c tổ ng hợ p mạnh trong quá trình nảy mầm của hạt . Sƣ̣ gia tăng hoạ t độ củ a -amylase sẽ là m Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
53. 43 tăng hàm lƣợng đƣờng do tinh bột bị thủy phân cung cấp năng lƣợng cho quá trình nảy mầm của hạt . Khi hoạ t độ -amylase tăng lên, hàm lƣợ ng đƣờ ng tăng theo nên áp suất thẩm thấu của tế bào tăng, nhờ đó mà thƣ̣ c vậ t có khả năng chố ng lạ i sƣ̣ mấ t nƣớ c ở giai đoạ n nả y mầ m. Đây là điề u rấ t có ý nghĩ a vớ i quá trì nh nả y mầ m củ a hạ t, vì nó đảm bảo cho sự phát triển của mầm và cây non trong điều kiện thiếu nƣớc. Trên cơ sở đó chú ng tôi tiế n hà nh, đá nh giá khả năng chị u hạ n củ a cá c giố ng lú a thông qua sƣ̣ thay đổ i hoạ t độ củ a - amylase và biế n độ ng hà m lƣợ ng đƣờ ng tan ở giai đoạ n nảy mầm trong điều kiện gây hạn sinh lý bằng cách bổ sung sorbitol5%. Hoạt độ enzym α-amylase đƣợc xác định thông qua hàm lƣợng tinh bột bị thuỷ phân ở 300 C trong 30 phút, dựa vào đồ thị chuẩn tinh bột với giá trị OD đo ở bƣớc sóng 560nm. Kế t quả phân tí ch đƣợ c trì nh bà y ở bảng 3.8 và hình 3.3. Qua số liệ u bảng 3.8 và hình 3.3, hoạt độ enzym α-amylase có sƣ̣ khá c nhau giƣ̃ a cá c giố ng và thờ i gian gây hạ n . Xu hƣớ ng chung củ a sƣ̣ biế n độ ng nà y là hoạt độ enzym α-amylase tăng dầ n trong 7 ngày gây hạn và cao nhất ở ngày hạn thứ 7, sau đó giả m dầ n ở 9 ngày tuổi . Tại thời điểm 7 ngày tuổi hoạt độ của enzym α- amylase cả 5 giố ng đề u tăng so vớ i thờ i điể m 1 ngày tuổi gây hạ n sinh lý bằ ng sorbitol, sƣ̣ biế n độ ng nà y khá c nhau giƣ̃ a cá c giố ng . Trong đó giố ng NN tăng cao nhấ t 4,02 lầ n tiế p đế n là KM (3,89 lầ n), KT (3,80 lầ n), KĐ (3,78 lầ n) và tăng thấp nhấ t là giố ng SR 3,75 lầ n. Sƣ̣ biế n độ ng cũ ng đƣợ c thể hiệ n ở hình 3.4. Bảng 3.8. Hoạt độ của -amylase trong giai đoạ n hạ t nả y mầ m khi xƣ̉ lý sorbitol 5% (ĐVHĐ/mg hạ t nả y mầ m) Ký hiệu Hoạt độ enzym -amylase (ĐVHĐ/mg hạ t nả y mầ m) mẫ u 1 ngày tuổi 3 ngày tuổi 5 ngày tuổi 7 ngày tuổi 9 ngày tuổi NN 1,80 0,21 2,49 0,61 5,48 0,17 7,24 0,33 5,87 0,62 KT 1,81 0,29 2,57 0,13 5,39 0,23 6,88 0,11 5,11 0,19 KM 1,51 0,16 2,37 0,52 4,71 0,15 5,88 0,29 5,07 0,84 KĐ 1,73 0,35 2,44 0,11 5,56 0,37 6,39 0,42 5,08 0,65 SR 1,45 0,08 2,41 0,82 4,97 0,46 5,44 0,23 4,87 0,51 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
54. 44 8 7 6 NN 5 KT 4 KM KĐ 3 SR đvhđ/mghạt nảy mầm 2 1 0 1 3 5 7 9 Ngày Hình 3.3. Sự biến động hoạt độ enzym α-amylase của các giống lúa Kế t quả nghiên cƣ́ u cho thấ y , sorbitol có ả nh hƣở ng đế n hoạ t độ củ a enzym α-amylase ở giai đoạ n nả y mầ m củ a cá c giố ng lú a . Sƣ̣ ả nh hƣở ng củ a sorbitol đế n hoạt độ enzym α-amylase củ a cá c giố ng lú a có sƣ̣ khá c nhau và phụ thuộ c và o khả năng chị u hạ n củ a tƣ̀ ng giố ng. Kế t quả nà y cũ ng phù hợ p vớ i nhƣ̃ ng nghiên cƣ́ u trên đố i tƣợ ng lạ c [24], [38], [45], đậ u tƣơng [28]. 2 2 1 1 5 5 3 3 4 4 A B 1. NN; 2. KT; 3. KM; 4. KĐ; 5. SR Hình 3.4. Đị nh tí nh hoạ t độ enzym α-amylase củ a cá c giố ng lú a A. hoạt độ enzym α-amylase 1 ngày tuổi B. hoạt độ enzym α-amylase 5 ngày tuổi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
55. 45 Hàm lƣợng đƣờng tan trong tế bào đó ng vai trò quan trọ ng trong việ c điề u chỉnh áp suất thẩm thấu của dịch bào khi cây gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi . Vì vậ y chú ng tôi khả o sá t hà m lƣợ ng đƣờ ng ở giai đoạ n nả y mầ m vớ i mụ c đí ch tì m mố i liên quan đế n kh ả năng chịu hạn của các giống lúa . Kế t quả nghiên cƣ́ u đƣợ c trình bày ở bảng 3.9 và hình 3.5. Bảng 3.9. Hàm lƣợng đƣờng tan của các giống lúa khi xử lý sorbitol 5% ở giai đoạn nảy mầm (%) Ký hiệu Hàm lƣợng đƣờng tan (%) mẫ u 1 ngày tuổi 3 ngày tuổi 5 ngày tuổi 7 ngày tuổi 9 ngày tuổi NN 4,22 0,21 6,28 0,13 7,90 0,24 9,75 0,18 6,19 0,42 KT 4,18 0,34 6,15 0,65 7,38 0,18 8,86 0,53 6,43 0,39 KM 4,21 0,42 6,23 0,23 7,15 0,87 9,57 0,51 6,53 0,18 KĐ 4,15 0,13 6,42 0,14 7,13 0,53 8,47 0,18 6,34 0,42 SR 3,97 0,28 6,31 0,12 7,17 0,36 7,92 0,55 6,13 0,58 Kế t quả bảng 3.9 và hình 3.5 cho thấ y, trong quá trì nh nả y mầ m củ a hạ t ở cá c mẫ u thí nghiệ m hà m lƣợ ng đƣờ ng tan đề u tăng theo quy luậ t chung là tăng tƣ̀ 1ngày tuổ i đế n 7 ngày tuổi và tăng cao nhất ở thời điểm 7 ngày tuổi sau đó bắt đầu giảm vào giai đoạn 9 ngày tuổi. Sƣ̣ biế n độ ng hà m lƣợ ng đƣờ ng tan cá c giố ng khá c nhau thì khác nhau . Tại thời điểm 7 ngày tuổi, hàm lƣợng đƣờng tan của giống NN cao nhấ t (tăng 2,31 lần) tiế p đế n là KM, KT, KĐ và thấ p nhấ t là SR (1,99 lần), sƣ̣ biế n độ ng nà y thể hiệ n ở hình 3.5. 12 10 NN 8 KT 6 KM KĐ nẩymầm) 4 SR 2 0 Hàm lƣợng Hàm đƣờng tan hạtmg(% 1 3 5 7 9 Ngày Hình 3.5 Sự biến động hàm lƣợng đƣờng tan các giống lúa ở giai đoạn nảy mầm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
56. 46 Khi tế bà o mấ t nƣớ c, các chất hòa tan đƣợc tích lũy trong tế bào nhằm chống lại sự mất nƣớc và tăng khả năng giữ nƣớc của chất nguyên sinh . Đây là mộ t phƣơng thƣ́ c thí ch nghi củ a thƣ̣ c vậ t vớ i stress củ a môi trƣờ ng [1], [40]. Kế t quả nghiên cƣ́ u về hà m lƣợ ng đƣờ ng tan trong giai đoạ n nả y mầ m củ a cá c giố ng lú a khi gây hạ n sinh lý bằ ng sorbitol 5% phù hợp với những nhận định trên. Bảng 3.10. Tƣơng quan giƣ̃ a hoạ t đô enzym α-amylase vớ i hà m lƣợng đƣờ ng tan củ a cá c giố ng lú a Kí hiệu mẫu Phƣơng trình hồi quy Hệ số tƣơng quan (R) NN Y = 0,75x+3,42 0,95 KT Y = 0,77x+3,48 0,94 KM Y = 0,86x+3,92 0,93 KĐ Y = 3,27x+1,44 0,94 SR Y = 0,71x+3,59 0,93 Khảo sát mối tƣơng quan giữa hoạt đ ộ enzym α-amyase và hà m lƣợ ng đƣờ ng tan đƣợ c trì nh bà y ở bả ng 3.10 cho thấ y hệ số tƣơng quan (R) của các giống lúa đều nằ m trong khoả ng 0,9 < R < 1. Điề u nà y chƣ́ ng tỏ hà m lƣợ ng đƣờ ng tan và hoạ t đô enzym α-amyase có mố i tƣơng quan thuậ n chặ t chẽ . Hàm lƣợng đƣờng tan phụ thuộ c tuyế n tí nh và o hoạ t độ củ a enzym α-amyase. Hoạt độ của enzym α-amylase càng cao thì hàm lƣợng đƣờng tan càng nhiều cung cấp cho quá trình nảy mầm của hạt, sƣ̣ sinh trƣở ng c ủa mầm và điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào trong điều kiệ n cƣ̣ c đoan. Kế t quả nghiên cƣ́ u củ a chú ng tôi về hoạ t độ enzym α-amylase và hà m lƣợ ng đƣờ ng tan ở giai đoạ n nả y mầ m khi xƣ̉ lý hạ n bằ ng sorbitol 5% cho phé p kế t luậ n, hàm lƣợng đƣờng tan liên quan đến điều chỉnh áp suất thẩm thấu của dịch bào và khả năng giữ nƣớc của mầm. Hoạt độ enzym α-amylase và hà m lƣợ ng đƣờ ng tan có mố i tƣơng quan thuậ n chặ t chẽ và liên quan đế n khả năng nảy mầm của hạt . Giƣ̃ a Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
57. 47 các giống có sự thay đổi về hoạt độ của enzym α-amylase và hà m lƣợ ng đƣờ ng tan khác nhau liên quan đến khả năng chống chịu của từng giống. 3.3.1.2. Ảnh hưởng của hạn sinh lý đến hoạt độ của protease và hàm lượng protein củ a cá c giố ng lú a ở giai đoạ n nả y mầ m Kế t quả nghiên cƣ́ u ả nh hƣở ng củ a hạ n sinh lý đế n hoạ t độ củ a protease ở giai đoạ n nả y mầ m củ a cá c giố ng lú a đƣợ c trì nh bà y ở b ảng 3.11, hình 3.6 và hình 3.7. Bảng 3.11. Hoạt độ của protease của các giống lúa khi xử lý sorbitol 5 % ở giai đoạ n nả y mầ m (ĐVHĐ/mg) Ký hiệu Hoạt độ của enzymne protease (ĐVHĐ/mg) mẫ u 1 ngày tuổi 3 ngày tuổi 5 ngày tuổi 7 ngày tuổi 9 ngày tuổi NN 0,26 0,23 0,39 0,32 0,53 0,14 0,78 0,46 0,45 0,21 KT 0,25 0,31 0,32 0,13 0,43 0,43 0,69 0,06 0,47 0,56 KM 0,24 0,26 0,38 0,34 0,50 0,43 0,72 0,51 0,50 0,12 KĐ 0,25 0,42 0,37 0,36 0,48 0,29 0,66 0,29 0,41 0,81 SR 0,26 0,18 0,35 0,11 0,50 0,39 0,55 0,09 0,41 0,67 0.9 0.8 0.7 NN 0.6 KT 0.5 KM 0.4 KĐ 0.3 SR 0.2 0.1 Hoạtđộ protease (ĐVHĐ) 0 1 3 5 7 9 Ngày tuổi Hình 3.6. Sự biến động hoạt độ của enzym protease củ a cá c giố ng lú a Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
58. 48 Qua số liệ u bảng 3.11 cho thấ y, hoạt độ của enzym protease củ a mỗ i giố ng biể u hiệ n khá c nhau , giố ng NN có sự giao động lớn nhất tƣ̀ 0,26 ĐVHĐ/mg đế n 0,78 ĐVHĐ/mg. Sƣ̣ biế n độ ng hoạ t độ củ a cá c giố ng tuân theo quy luậ t , tăng dầ n tăng dầ n theo ngà y tuổ i (tƣ̀ 1 -7 ngày), nhƣng sau đó giả m khi thờ i gian gây hạ n ké o dài (9 ngày tuổi). Tại thời điểm 7 ngày tuổi hoạt độ của giống NN cao nhất là0,78 ĐVHĐ/mg, thấ p nhấ t là giố ng SR đạ t 0,55 ĐVHĐ/mg. Nhƣng khi xé t về tỷ lệ tăng của các giống so với trƣớc gây hạn sinh lý thì tỷ lệ tăng của các giống xếp thứ tự nhƣ sau NN và KM tăng 3,00 lầ n, tiế p đế n là giố n g KT tăng 2,76 lầ n, KĐ (2,64 lầ n), và tăng thấp nhất là SR 2,11 lầ n. 1 1 4 2 2 4 5 5 3 3 A B 1. NN; 2. KT; 3. KM; 4. KĐ; 5. SR Hình 3.7. Ảnh định tính hoạt độ enzym protease củ a cá c giố ng lú a A. hoạt độ enzym protease 5 ngày tuổi B. hoạt độ enzym protease 9 ngày tuổi Trong giai đoạ n nả y mầ m khi xƣ̉ lý hạ n sinh lý thì sƣ̣ biế n độ ng hoạ t độ củ a protease sẽ là m tăng á p suấ t thẩ m thấ u củ a tế bà o thông qua cá c phân tƣ̉ chấ t tan do protein bị phân giả i qua đó là m tăng tí nh chố ng chị u củ a cây trồ ng. Protein dƣ̃ trƣ̃ trong hạ t là nguyên liệ u cầ n thiế t để cung cấ p cá c chấ t đả m bảo cho hạt nảy mầm và sinh trƣởng của cây . Phân tí ch sƣ̣ biế n độ ng protein củ a Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên