Luận án Tỷ lệ mắc và kiểu hình gen bệnh Alpha và Beta Thalassemia ở trẻ em dân tộc Ê Đê và M’nông tỉnh Đắk Lắk

165 trang ngocly 40

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Tỷ lệ mắc và kiểu hình gen bệnh Alpha và Beta Thalassemia ở trẻ em dân tộc Ê Đê và M’nông tỉnh Đắk Lắk", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

luan_an_ty_le_mac_va_kieu_hinh_gen_benh_alpha_va_beta_thalas.pdf

Nội dung text: Luận án Tỷ lệ mắc và kiểu hình gen bệnh Alpha và Beta Thalassemia ở trẻ em dân tộc Ê Đê và M’nông tỉnh Đắk Lắk

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN THỊ THUÝ MINH TỶ LỆ MẮC VÀ KIỂU HÌNH GEN BỆNH ALPHA VÀ BETA THALASSEMIA Ở TRẺ EM DÂN TỘC Ê ĐÊ VÀ M’NÔNG TỈNH ĐẮK LẮK Chuyên ngành: Nhi khoa Mã số: 62720135 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. BÙI QUỐC THẮNG 2. PGS.TS. ĐỖ VĂN DŨNG TP. Hồ Chí Minh - Năm 2015
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả và số liệu trong luận án là trung thực, không sao chép và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Nghiên cứu sinh
ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Mục lục ii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục các bảng vii Danh mục các biểu đồ, sơ đồ x Danh mục các hình xi ĐẶT VẤN ĐỀ 153 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Hemoglobin và phân loại hemoglobin 5 1.2. Bệnh thalassemia 7 1.3. Gen globin 11 1.3.1. Cấu trúc gen globin 12 1.3.2. Phân bố đột biến gen globin 16 1.3.3. Rối loạn do kết hợp với bệnh di truyền khác 19 1.3.4. Tỷ lệ mang gen bệnh thalassemia 20 1.4. Gen  globin 20 1.4.1. Cấu trúc gen  globin 20 1.4.2. Một vài cơ chế đột biến trong tổng hợp chuỗi  globin 22 1.4.3. Một số đột biến thường gặp 23 1.4.4. Tỷ lệ mang gen bệnh  thalassemia trên thế giới 26 1.5. Người Êđê và M’nông 31
iii Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1. Đối tượng nghiên cứu 32 2.2. Phương pháp nghiên cứu 32 2.3. Cách chọn mẫu 33 2.5. Tiêu chuẩn loại trừ 37 2.6. Thời gian nghiên cứu 37 2.7. Các bước thực hiện 37 2.8. Vận chuyển và bảo quản mẫu: 40 2.9. Định nghĩa các biến số: 40 2.10. Công cụ thu thập số liệu 43 2.11. Xử lý số liệu: bằng phương pháp thống kê y học. 51 2.12. Vấn đề y đức trong nghiên cứu: 52 Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53 3.1. Tỷ lệ mắc và kiểu hình gen bệnh thalassemia 53 3.1.1. Đặc điểm dân số nghiên cứu 53 3.1.2. Tỷ lệ mang gen thalassemia 54 3.1.3. Các kiểu hình gen bệnh thalassemia 56 3.1.4. Biểu hiện huyết học 61 3.2. Tỷ lệ mắc và kiểu hình gen bệnh  thalassemia 68 3.2.1. Đặc điểm dân số nghiên cứu 68 3.2.2. Tỷ lệ tăng HbA2 hoặc/và HbF 69 3.2.3. Tỷ lệ mắc Hb E 71 3.2.4. Tỷ lệ mang gen bệnh  thalassemia 73 3.2.6. Biểu hiện huyết học 75
iv Chƣơng 4 BÀN LUẬN 80 4.1. Tỷ lệ mắc và kiểu hình gen bệnh thalassemia 80 4.1.1. Tỷ lệ mang gen bệnh: 80 4.1.2. Tỷ lệ mang gen bệnh thalassemia: 81 4.1.3. Tỷ lệ các kiểu gen 85 4.1.4. Biểu hiện huyết học 89 4.1.5. Trung bình các thành phần Hb 93 4.2. Tỷ lệ mắc và kiểu hình gen bệnh  thalassemia: 93 4.2.1. Tỷ lệ mang gen bệnh  thalassemia 94 4.2.2. Tỷ lệ mắc bệnh HbE 99 4.2.3. Các đột biến β thalassemia thường gặp ở trẻ Êđê và M’nông 102 4.2.4. Biểu hiện huyết học 104 KẾT LUẬN 108 KIẾN NGHỊ 110 HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 111 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Phụ lục 1: Một vài hình ảnh sinh học phân tử trong nghiên cứu Phụ lục 2: Danh sách các xã được chọn nghiên cứu Phụ lục 3: Mẫu phiếu điều tra Phụ lục 4: Danh sách bệnh nhân nghiên cứu Phụ lục 5: Bản đồ các xã được chọn nghiên cứu
v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TIẾNG VIỆT BC : bạch cầu HC : hồng cầu TC : tiểu cầu TIẾNG ANH ARMS : Amplification Refractory Mutation System Khuếch đại có tính chất trơ ATRX : Alpha-thalassemia X-linked intellectual disability Hội chứng khuyết tật trí tuệ liên kết với nhiễm sắc thể giới tính C : Cytosine cd : codon DNA : Deoxyribonucleic acid FISH : Fluorescent in situ hybridization G : Guanin Hb : hemoglobin IVSs : Intervening sequences MCH : Mean corpuscular hemoglobin Hemoglobin trung bình trong một hồng cầu MCHC : Mean corpuscular hemoglobin concentration Nồng độ hemoglobin trung bình hồng cầu MCV : Mean corpuscular volume Thể tích trung bình hồng cầu
vi MLPA : Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification K thuật khuếch đại nhiều đoạn dò phụ thuộc sự kết nối PPS : Probability proportionat to size cluser Sampling Phương pháp chọn mẫu xác suất tỷ lệ theo cỡ dân số PCR : Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp RNA : Ribonucleic acid T : Thymine U : Uraxin
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Cấu trúc hemoglobin và thời kỳ xuất hiện hemoglobin sinh lý 6 Bảng 1.2. Tương xứng giữa kiểu hình và thành phần Hb Bart’s lúc sinh 8 Bảng 1.3. Kiểu hình, kiểu gen bệnh  thalassemia 9 Bảng 1.4. Đột biến thalassemia ở các nhóm chủng tộc 17 Bảng 1.5. Đột biến phổ biến bệnh  thalassemia 24 Bảng 1.6. Đột biến gen  thalassemia ở các dân tộc trên thế giới 25 Bảng 1.7. Dịch tễ học toàn cầu của bệnh  thalassemia 26 Bảng 1.8. Tỷ lệ mang gen bệnh ở các quốc gia Châu Á 27 Bảng 1.9. Tình hình mắc  thalassemia tại Việt Nam 28 Bảng 1.10. Tỷ lệ của các đột biến  thalassemia ở Việt Nam và các nước trong khu vực 29 Bảng 1.11. Tỷ lệ mắc bệnh HbE 29 Bảng 3.12. Tuổi thai 53 Bảng 3.13. Cân nặng lúc sinh 54 Bảng 3.14. Tỷ lệ máu cuống rốn có Hb Bart’s 54 Bảng 3.15. Tỷ lệ mang gen bệnh thalassemia 55 Bảng 3.16. Tỷ lệ các đột biến gen bệnh thalassemia ở cả hai dân tộc 56 Bảng 3.17. Tỷ lệ các kiểu gen bệnh thalassemia ở cả hai dân tộc 57 Bảng 3.18. Tỷ lệ bệnh HbE theo các đột biến thalassemia ở hai dân tộc 58 Bảng 3.19. Tỷ lệ bệnh HbE theo các đột biến thalassemia dân tộc Êđê 59 Bảng 3.20. Tỷ lệ bệnh HbE theo các đột biến thalassemia ở dân tộc M’nông 60
viii Bảng 3.21. Trung bình các chỉ số huyết học theo kiểu gen bệnh thalassemia ở cả hai dân tộc 61 Bảng 3.22. Trung bình các chỉ số huyết học theo kiểu gen bệnh thalassemia ở dân tộc Êđê 62 Bảng 3.23. Trung bình các chỉ số huyết học theo kiểu gen bệnh thalassemia ở dân tộc M’nông 64 Bảng 3.24. Trung bình các thành phần Hb theo kiểu hình gen bệnh thalassemia ở cả hai dân tộc 65 Bảng 3.25. Trung bình các thành phần Hb theo kiểu gen bệnh thalassemia ở dân tộc Êđê 66 Bảng 3.26. Trung bình các thành phần Hb theo kiểu hình gen bệnh thalassemia ở dân tộc M’nông. 67 Bảng 3.27. Tuổi 68 Bảng 3.28. Giới tính 69 Bảng 3.29. Tỷ lệ tăng HbF hoặc/và HbA2 ở cả hai dân tộc 69 Bảng 3.30. Tỷ lệ tăng HbA2 hoặc/và HbF ở dân tộc Êđê 70 Bảng 3.31. Tỷ lệ tăng HbA2 hoặc/và HbF ở dân tộc M’nông 71 Bảng 3.32. Tỷ lệ mắc HbE ở cả hai dân tộc 71 Bảng 3.33. Tỷ lệ mắc HbE ở dân tộc Êđê theo giới 72 Bảng 3.34. Tỷ lệ mắc HbE ở dân tộc M’nông theo giới 73 Bảng 3.35. Tỷ lệ mang gen bệnh  thalassemia 73 Bảng 3.36. Các đột biến gây  thalassemia 74 Bảng 3.37. Trung bình các chỉ số huyết học theo kiểu gen  thalassemia ở cả hai dân tộc 75 Bảng 3.38. Trung bình các chỉ số huyết học theo kiểu gen  thalassemia ở dân tộc Êđê. 76
ix Bảng 3.39. Trung bình các chỉ số huyết học theo kiểu gen  thalassemia ở dân tộc M’nông 77 Bảng 3.40. Trung bình các thành phần Hb theo kiểu gen  thalassemia ở cả hai dân tộc 78 Bảng 3.41. Trung bình các thành phần Hb theo kiểu gen  thalassemia ở dân tộc Êđê 79 Bảng 3.42. Trung bình các thành phần Hb theo kiểu gen  thalassemia ở dân tộc M’nông 79 Bảng 4.43. Tỷ lệ mang gen bệnh ở các dân tộc trên thế giới 81 Bảng 4.44. Tỷ lệ các kiểu đột biến bệnh thalassemia tại một số quốc gia 83 Bảng 4.45. Tỷ lệ các kiểu gen bệnh 85 Bảng 4.46. Tỷ lệ mắc bệnh  thalassemia các dân tộc Việt Nam 94 Bảng 4.47. Tỷ lệ mang gen  thalassemia ở các vùng trên thế giới 98 Bảng 4.48. Tỷ lệ mắc bệnh HbE ở Việt Nam 100
x DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ Trang Biểu đồ 3.1. So sánh tỷ lệ mang gen bệnh thalassemia ở hai dân tộc 55 Biểu đồ 3.2. Tỷ lệ tăng HbF>3,5% hoặc/và HbA2>3,5% ở hai dân tộc theo giới 70 Biểu đồ 3.3. So sánh tỷ lệ mắc HbE ở cả hai dân tộc 72 Biểu đồ 4.4. So sánh tỷ lệ mắc bệnh  thalassemia ở các dân tộc Việt Nam 153 Sơ đồ 2.1: Các bước thực hiện nghiên cứu tỷ lệ thalassemia 38 Sơ đồ 2.2: các bước thực hiện nghiên cứu xác định tỷ lệ mang gen  thalassemia 39 Sơ đồ 2.3: Các bước tiến hành khảo sát gen thalassemia 50 Sơ đồ 2.4: Các bước tiến hành khảo sát gen  thalassemia 51
xi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Gen alpha và beta globin (trên nhiễm sắc thể 16 và 11). 10 Hình 1.2. Cấu trúc của cụm gen α globin trên nhiễm sắc thể 16 12 Hình 1.3. Xóa đoạn một gen gây α+-thalassaemia 14 Hình 1.4. Xóa đoạn gây 0 thalassemia 15 Hình 1.5. Sơ đồ của gen  globin 21 Hình 1.6. Phân bố các đột biến gen bệnh  thalassemia 30 Hình 2.7. Hình ảnh công thức máu ngoại biên trong nghiên cứu 44 Hình 2.8. Hình ảnh phiếu điện di Hb bằng máy mao quản 45 Hình 2.9. Hình ảnh phiếu điện di Hb trong nghiên cứu tỷ lệ mắc  thalassemia 46 Hình 2.10. Hình ảnh kết quả xét nghiệm tìm đột biến thalassemia bằng phương pháp multiplex GAP-PCR. 47 Hình 2.11. Hình ảnh kết quả xét nghiệm tìm đột biến  thalassemia bằng phương pháp multiplex ARMS-PCR và ARMS-PCR 48 Hình 2.12. Hình ảnh giải trình tự gen  thalassemia trong nghiên cứu 49
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Thalassemia là bệnh lý tan máu di truyền phổ biến nhất ở người, biểu hiện bằng giảm hoặc không sản xuất chuỗi globin trong thành phần hemoglobin (Hb). Tùy theo nguyên nhân đột biến ở gen alpha ( ) hay gen beta () mà người ta chia thành hoặc  thalassemia [7],[13],[15],[83]. Các gen globin nằm trên nhiễm sắc thể thứ 16. Người bình thường có bốn gen globin. Thể Bart’s là thể nặng nhất của bệnh này do đột biến bốn gen globin. Bệnh nhi mắc thể bệnh này thường phù nhau thai chết lưu hoặc chết ngay sau sinh. Đột biến ba gen globin gây bệnh hemoglobin H. Người mang đột biến một hoặc hai gen thường không biểu hiện triệu chứng lâm sàng. Các gen  globin nằm trên nhiễm sắc thể 11. Người bình thường có hai gen  globin. Thể đồng hợp tử do hai đột biến  thalassemia thể dị hợp tử kép do một đột biến  và đột biến hemoglobin E, thể này thường có biểu hiện lâm sàng nặng nề, tùy theo kiểu đột biến gen mà biểu hiện lâm sàng khác nhau [1]. Hiện nay, điều trị bệnh thalassemia đang là một bài toán phức tạp và là một thách thức cho ngành y khoa toàn cầu, đặc biệt là các thể nặng. Điều trị bệnh thalassemia hiện nay chủ yếu là truyền máu kéo dài thời gian sống, điều trị ứ sắt, cắt lách khi có cường lách. Năm 1982 dị ghép tế bào gốc tạo máu đầu tiên được thực hiên bởi E Donall Thomas đã tạo một niềm hy vọng rất lớn cho những bệnh nhân mắc căn bệnh di truyền này [35]. Tuy nhiên, tại nhiều nước trên thế giới và nước ta hiện nay, việc điều trị bệnh nhân thalassemia gặp rất nhiều khó khăn, việc điều trị bằng ghép tế bào gốc rất tốn
2 kém, hiệu quả không cao, nhiều biến chứng [76],[80]. Tỷ lệ tử vong do bệnh thalassemia nói chung còn rất cao, chất lượng cuộc sống giảm rất nhiều, chi phí điều trị cao, là gánh nặng cho gia đình và xã hội [65]. Bệnh xảy ra khắp nơi trên thế giới, liên quan chặt chẽ với nguồn gốc dân tộc. Bệnh phân bố khắp toàn cầu song có tính địa dư rõ rệt [79]. Số người mang gen bệnh trên thế giới rất lớn. Theo Suthat Fucharoen tỷ lệ mang gen bệnh thalassemia ở các nước Đông Nam Á thay đổi tùy theo từng khu vực, từng quốc gia. Ở Thái Lan là 10-30% dân số, ở Indonesia là 6-16% [42]. Theo Liên Đoàn Thalassemia Quốc Tế, có tới 70 triệu người mang gen  thalassemia trên thế giới, riêng khu vực Châu Á là 60 triệu người mang gen bệnh [7]. Ở khu vực Đông Nam Á tỷ lệ mang gen  thalassemia ở Nam Á, vùng châu Á Thái Bình Dương là 0,4-6,8%, có 45346 ca mắc mới hàng năm [51]. Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Dương Bá Trực năm 1996 tỷ lệ người mang gen thalassmia ở miền Bắc là 2,3% [17]. Theo Nguyễn Công Khanh, bệnh β thalassemia là nguyên nhân hàng đầu gây thiếu máu, tan máu nặng ở trẻ em. Tỷ lệ người mắc bệnh phân bố trong cả nước và khác nhau tùy từng địa phương, từng nhóm dân tộc. Đặc biệt, tỷ lệ mang gen bệnh rất cao ở các dân tộc ít người như: Mường (20,6%), Thái (11,4%), Tày(11,0%), Nùng (7,1%), Pako(8,33%) [7], [14]. Đắk Lắk là tỉnh có nhiều dân tộc cùng chung sống: người Kinh, người Êđê, M’nông và một số dân tộc di cư ở phía bắc như Tày, Nùng, Dao Người Êđê, M’nông là hai dân tộc sống lâu đời ở Đắk Lắk Dân số của Đắk Lắk khoảng 1,8 triệu người, đông nhất là người Kinh, sau đó là hai dân tộc là Êđê và M’nông. Người Êđê có dân số đông nhất trong các dân tộc thiểu số
3 của tỉnh Đắk Lắk với ước tính năm 2012 là 300.108 người. Cơ sở xã hội truyền thống là buôn. Người Êđê cư trú chủ yếu tại Thành phố Buôn Ma Thuột, huyện CưMgar, Krông Păk, Krông Buk và M’Drak. Tộc người thiểu số với dân số nhiều thứ hai ở tỉnh Đắk Lắk là người M’nông với dân số khoảng 41.814 người. Người M’nông thuộc nhóm Bahnar Nam, phân bố tập trung nhiều ở các huyện Lắk, Krông Bông, Krông Nô, Buôn Đôn. Người M’nông sống trong những ngôi làng mà họ gọi là bon. Năm 1985 nghiên cứu của Dương Bá Trực cho thấy tỷ lệ mắc  thalassemia ở dân tộc Êđê là 1% và tỷ lệ mắc bệnh hemoglobin E là 41%. Tuy nhiên theo nhận định một số tác giả tỷ lệ mắc  thalassemia ở đồng bào các dân tộc thiểu số hiện nay ở Tây Nguyên có thể cao hơn nhiều. Riêng về thalassemia hiện nay chưa có nghiên cứu nào về tỷ lệ mang gen cũng như các đột biến gen globin trên người Êđê và M’nông. Vậy thực trạng mang gen bệnh và  thalassemia trong cộng đồng người Êđê và M’nông hiện nay như thế nào? Ở dân tộc Êđê và M’nông thường gặp các kiểu đột biến gì trên gen và ? Tỷ lệ của các kiểu đột biến thalassemia ở trẻ em dân tộc Êđê và M’nông có gì khác so với các dân tộc khác và các tộc người khác trong vùng Đông Nam Á và trên thế giới? Nhằm nhận định tình trạng bệnh trong cộng đồng người Êđê và M’nông từ đó có những kế hoạch áp dụng các biện pháp phòng bệnh. Vì vậy chúng tôi làm nghiên cứu này nhằm tìm hiểu tỷ lệ mang gen bệnh và các kiểu đột biến bệnh và  thalassemia để tạo cơ sở cho việc áp dụng sàng lọc trước sinh và tư vấn di truyền trước hôn nhân nhằm giảm tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng, hạn chế bớt sinh ra thể nặng.
4 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1. Xác định tỷ lệ mang gen, kiểu hình gen và sự khác biệt về tỷ lệ mang gen bệnh thalassemia ở trẻ em dân tộc Êđê và M’nông tỉnh Đắk Lắk. 2. Xác định tỷ lệ mang gen, kiểu hình gen và sự khác biệt về tỷ lệ mang gen bệnh  thalassemia ở trẻ em dân tộc Êđê và M’nông tỉnh Đắk Lắk.
5 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Hemoglobin và phân loại hemoglobin Hemoglobin bình thường gồm 2 chuỗi và 2 chuỗi . Hemoglobin chiếm đa số ở người trưởng thành là HbA1 ( 22). Gen tổng hợp chuỗi và  globin chứa 141 và 146 amino a-xít. Ngoài HbA1, hồng cầu người còn chứa một lượng nhỏ HbA2 ( 22) và HbF ( 22). Chuỗi  (delta) và  (gamma) polypeptid tương tự như chuỗi  nhưng khác ở a-xít amin trong chuỗi. HbA2 bình thường chiếm khoảng 2-3% tổng Hb. HbF là Hb của thai nhi trong 2 tam cá nguyệt cuối thai kỳ. Bởi vì nó không gắn với 2,3-diphosphoglycerate nên ái lực đối với oxy của nó cao hơn HbA1. Bằng cách này HbF tăng khả năng lấy oxy từ nhau thai. HbF chiếm một tỷ lệ nhỏ trong hồng cầu người trưởng thành. Ở người có 6 loại Hb bình thường được thấy trong hồng cầu trong thời kỳ phôi thai, thai nhi và người lớn. Hb ở thời kỳ phôi thai là Hb Gower 1, Hb Gower 2 và Hb Portland. Hb ở thời kỳ thai nhi đến khi trưởng thành là HbA1, HbA2 và HbF, thời gian xuất hiện và thành phần các Hb thay đổi theo từng thời kỳ.
6 Bảng 1.1. Cấu trúc hemoglobin và thời kỳ xuất hiện hemoglobin sinh lý [7] Cấu trúc Hb sinh lý Thời kỳ xuất hiện globin Hb Gower 1 22 Phôi thai 2-3 tuần tồn tại 1-2 tháng đầu của thai Hb Gower 2 22 Phôi thai 2-3 tuần tồn tại 1-2 tháng đầu của thai Hb Portland 22 Phôi thai 2-3 tuần HbF 22 Thai nhi 5 tuần, là Hb chủ yếu ở thai nhi Thai nhi 6 tuần là Hb chủ yếu ở người bình HbA1 22 thường HbA2 22 Thai nhi lúc gần sinh Hb ở người bình thường HbF: 22: là Hb chủ yếu của thai nhi. Ở trẻ sơ sinh bình thường HbF là 55- 85%. Khi trẻ khoảng 1 năm tuổi, lượng HbF giảm còn khoảng 1% như ở hầu hết người lớn [68]. HbA1 ( 22): là Hb chủ yếu ờ người trưởng thành HbA2 ( 22): là Hb mà chức năng sinh lý không rõ ràng. Ở người bình thường HbA2 chiếm khoảng 2-3%. Gen mã hóa tổng hợp globin polypeptid được đặt trong 2 cụm nhỏ. Gen nằm ở đầu tận của nhánh ngắn nhiễm sắc thể 16 (16p13.3). Gen  nằm ở nhiễm sắc thể 11 tại vị trí 11p15.5 [69]. Cụm gen globin chứa 3 gen chức năng , 2, 1 định thứ tự theo chiều từ 5’ đến 3’ dọc theo chiều nhiễm sắc thể. Chuỗi (zeta) globin được mã hoá bởi gen . Hb bào thai chứa chuỗi  là Hb Gower1 (22) và Hb
7 Portland 22. Gen đôi 1, 2 mã hoá hai chuỗi polypeptides giống nhau. Phân tích chuỗi DNA (Deoxyribonucleic acid) đã bộc lộ 3 giả gen : giả gen (1, giả gen 1 và giả gen 2) gần như giống nhau về mặt chức năng nhưng khác nhau về mã hoá chuỗi và điều hoà vùng dịch mã những gen không hoạt động này cũng khác nhau. Năm gen chức năng , G, , ,  hiện diện trong cụm gen  được sắp xếp theo theo chiều từ 5’ đến 3’ theo thứ tự mà chúng thể hiện trong suốt quá trình phát triển. Sản phẩm của gen  phôi thai được tìm thấy trong Hb phôi thai: Hb Grower1 là 22 và Hb Grower 2 là 22. Gen  bào thai là một gen đôi nhưng mã hóa globin khác nhau chỉ ở vị trí a-xít amin 136. Gen  mã hoá 1 chuỗi polypeptide khác với chuỗi  chỉ 10 trong 146 a- xít amin và nó chỉ chiếm nồng độ thấp trong hồng cầu người trưởng thành (<3% của chuỗi ). Chuỗi  globin chiếm tỷ lệ thấp là do sự khác nhau trong điều hoà và ức chế RNA (Ribonucleic acid) thông tin và sự bất ổn định của - mRNA. Chỉ một gen  globin chức năng có mặt trong cụm.  globin là globin chiếm đa số trong hồng cầu người trưởng thành. 1.2. Bệnh thalassemia 1.2.1. Phân loại bệnh thalassemia: Phân loại hay  thalassemia là do sự thiếu hụt tổng hợp hay  globin. 1.2.1.1. thalassemia Mỗi nhiễm sắc thể 16 có 2 gen chi phối tổng hợp globin. Như vậy cặp nhiễm sắc thể số 16 có 4 alen chi phối tổng hợp globin. Các thể lâm sàng của thalassemia phụ thuộc vào tổn thương 1, 2, 3 hoặc 4 gen globin tương ứng. Đột biến thalassemia gồm xóa đoạn và không xóa đoạn. Có
8 khoảng 35 đột biến xóa đoạn và hơn 40 đột biến không xóa đoạn ảnh hưởng đến 2 gen globin trên nhiễm sắc thể thứ 16 [85]. Bảng 1.2. Tương xứng giữa kiểu hình và thành phần Hb Bart’s lúc sinh [27] Số gen Nồng độ Thể bệnh Biểu hiện lâm sàng đột biến Hb Bart’s thalassemia Không triệu chứng hoặc có 1 1-2% thể ẩn thiếu máu nhẹ Mang gen 2 Thiếu máu nhẹ nhược sắc 5-10% thalassemia Thiếu máu vừa, nhược sắc, Bệnh HbH 3 10-30% hồng cầu nhỏ Phù nhau thai Đa số thiếu máu rất nặng và 97% và 4 Hb Bart’s đa số chết ngay sau sinh 3% HbH 1.2.1.2.  thalassemia Bệnh  thalassemia gồm 4 thể lâm sàng: người mang gen bệnh thể ẩn, mang gen thalassemia (thalassemia trait), thalassemia trung gian và thalassemia nặng. Đột biến gen  gây mất một phần chức năng gen  gây +, còn gây mất hoàn toàn chức năng gen  gây 0 thalassemia. Biểu hiện lâm sàng của  thalassemia khá phức tạp phụ thuộc vào mức độ tổn thương gen , mức độ dư thừa chuỗi và tồn tại huyết sắc tố bào thai.
9 Bảng 1.3. Kiểu hình, kiểu gen bệnh  thalassemia [73] Kiểu hình Kiểu gen Lâm sàng Mang gen /+ (một gen  tổn thương - Không triệu chứng bệnh nhẹ) - Không có bất thường về huyết học Nhẹ 0/ hoặc +/ - Triệu chứng lâm sàng (Trait/ minor) (gen  tổn thương mức độ nhẹ không rõ ràng và trung bình) - Hồng cầu nhỏ nhược sắc Trung gian - 0/+, +/+, với gen  tổn - Biểu hiện lâm sàng muộn (intermedia) thương mức độ nhẹ - Thiếu máu nhẹ, trung bình - 0/+, +/, +/ với gen  - Không phụ thuộc truyền tổn thương mức độ trung máu bình - Độ nặng lâm sàng thay đổi - 0/0, +/+, 0/+ và xóa từ nhẹ đến nặng đoạn hoặc không xóa đoạn thalassemia - 0/0, +/+, 0/+ và có khả năng tăng tổng hợp chuỗi  - Các thể xóa đoạn của  thalassemia và tồn tại huyết sắc tố bào thai - +/ hoặc +/ và đa tổng hợp chuỗi Nặng (major) 00, ++, 0/+ - Biểu hiện lâm sàng sớm - Thiếu máu nặng - Phụ thuộc truyền máu
10 1.2.2. Quy luật di truyền: bệnh thalassemia di truyền theo alen lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường [71]. 1.2.3. Cơ chế di truyền: bệnh có thể do gen bệnh truyền từ bố, mẹ cho con hoặc có thể do đột biến mới phát sinh qua quá trình tạo giao tử ở bố hoặc mẹ đi vào thế hệ con, sự biểu hiện ở thế hệ con còn phụ thuộc vào kiểu gen, tùy theo mức độ đột biến gen mà có những thể bệnh khác nhau. Hình 1.1. Gen và  globin (trên nhiễm sắc thể 16 và 11) “Nguồn: Jain D, 2014” [51]
11 1.2.4. Nguyên nhân 1.2.4.1. Bệnh thalassemia: hai nguyên nhân chính là xóa đoạn và không xóa đoạn Xóa đoạn: có thể do Kết quả trao đổi chéo không cân bằng dẫn đến mất một gen . Khuyết đoạn lớn trên nhiễm sắc thể số 16 có thể dẫn đến mất 2 gen . Không xóa đoạn: những đột biến vô nghĩa, đột biến điểm hoặc đột biến lệch khung có thể dẫn đến mất chức năng gen . 1.2.4.2. Bệnh  thalassemia: một số nguyên nhân chính trong bệnh  thalassemia là do các đột biến sau [1]: Đột biến điểm tại vùng promoter Đột biến vô nghĩa Đột biến điểm nối Đột biến trong các exon Đột biến tại vị trí gắn đuôi poly A Đột biến khung 1.3. Gen globin Các gen chi phối sự hình thành chuỗi zeta (), alpha ( ) nằm trên nhiễm sắc thể số 16 [32]. Tùy theo giai đoạn phát triển cá thể mà các chuỗi globin được tổng hợp khác nhau [93].
12 1.3.1. Cấu trúc gen globin Bình thƣờng 4 gen chức năng Thể ẩn thalassemia 3 gen chức năng Đồng hợp tử + 2 gen chức năng thalassemia trait 0 Dị hợp tử 1 gen chức năng Bệnh Hb H 0 gen chức năng Hb Bart’s và phù nhau thai Hình 1.2. Cấu trúc của cụm gen α globin trên nhiễm sắc thể 16 "Nguồn: Harteveld C, 2010” [46] Cả hai gen 1 và gen 2 có 3 exon. Các mRNA sản xuất bởi gen 1 và gen 2 có vùng mã hóa giống hệt nhau. Cụm gen globin α gồm 3 gen chức năng: Gen  mã hóa cho mạch  là thành phần của Hb Gower 1 (22). Gen đôi α1 và α2 mã hóa cho mạch globin α (gen 1 và gen 2). Phân tích DNA còn phát hiện cấu trúc giống gen globin: giả gen , giả gen α1 và giả gen α2 không họat động [7]. Gen -globin là một gen đôi (gen 1 và gen 2) nằm ở đầu tận của nhiễm sắc thể 16 (16p13.3). Gen 1 và gen 2 nằm giữa 2 vùng khoảng 4
13 kilobyte (kb). Mức độ giải mã của 2 gen khác nhau, gen 2 sản xuất chuỗi globin gấp 2 đến 3 lần so với gen 1. Sự hoạt động 2 gen globin này quyết định số lượng cấu trúc biến thể. Đột biến của gen 1 hoặc gen 2 và sinh lý bệnh của xóa đoạn hay không xóa đoạn cũng thay đổi tùy thuộc vào mất hay hai một gen 1 và 2. Cơ chế phân tử dẫn đến đột biến của cả 2 gen 1 hoặc 2 gồm: Đột biến xóa đoạn Đột biến không xóa đoạn Đột biến liên quan điểm nối RNA Đột biến chấm dứt chuỗi. Đột biến khung. Đột biến vô nghĩa. Đột biến gen globin gây nên sự sản xuất chuỗi globin biến thể không ổn định HbQuong Sze, các chuỗi globin này không thể tự kết hợp với nhau như chuỗi  tạo 4 và chúng nhanh chóng bị thoái hóa gây nên lâm sàng bệnh thalassemia. Hoạt động của gen 1 và gen 2 được điều hòa bởi vùng gọi là HS 40 có kích thước khoảng 40kb nằm ở đầu tận so với cụm gen globin. Xóa đoạn chứa vùng HS 40 dẫn đến các thể bệnh thalassemia vì cấu trúc này điều hòa cả 2 gen globin. 1.3.1.2. + thalassemia: hai đột biến thalassemia thường gặp ở Đông Nam Á là thể xóa đoạn 3.7kb (-α3.7) và xóa đoạn 4.2 kb (-α4.2). Xóa đoạn -α3.7: đột biến có kích thước 3,7kb, chia thành 3 vị trí là I, II, và III, là đột biến xóa đoạn thalassemia thường gặp nhất ở Đông Nam Á.
14 Xóa đoạn -α4.2: xóa đoạn có kích thước 4,2 kb làm nhiễm sắc thể chỉ có một gen globin. Hình 1.3. Xóa đoạn một gen gây α+-thalassaemia “Nguồn: Harteveld C, 2010” [46] 1.3.1.3. 0 thalassemia Xóa đoạn: xóa đoạn cả 2 gen α globin (đôi khi mất cả gen HBZ) gây nên sự vắng mặt hoàn toàn alen sản xuất globin): xóa đoạn có thể có kích thước thay đổi từ và vài kb đến hơn 250 kb và do các cơ chế phân tử bao gồm tái tổ hợp, chuyển đoạn, xóa đoạn của nhiễm sắc thể 16. Hơn 20 xóa đoạn α0-thalassemia đã được báo cáo: Phổ biến nhất ở vùng Đông Nam Á là đột biến SEA ( SEA) và đột biến Filipino ( FIL). 5.2 20.5 0 Mất 2 alen α và -(α) , mất gen 2 và một phần của gen 1 tạo α thalassemia.
15 0 Xóa đoạn chứa gen 1 và gen theta và cụm gen α globin gây nên α thalassemia. 9 loại xóa đoạn chứa HS-40 của gen α-globin gây ra α0-thalassemia. Hình 1.4. Xóa đoạn gây 0 thalassemia “Nguồn: Harteveld C, 2010” [46] a. Đột biến xóa 2 đoạn lớn gồm cả hai gen globin b. Đột biến xóa vùng điều hòa gen globin để lại gen globin còn nguyên vẹn Không xóa đoạn: ít gặp hơn, α thalassemia do đột biến điểm hoặc do đa đột biến chèn đoạn, xóa đoạn vùng quan trọng chứa gen globin. Đột
16 biến không xóa đoạn α thalassemia có ảnh hưởng nặng nề đến gen globin hơn là đơn thuần xóa đoạn globin. Hiện tượng này có thể lý giải do đột biến này ảnh hưởng chính lên gen 2, là gen chiếm ưu thế hơn gen 1. Không có sự bù trừ nào xày ra để duy trì chức năng của gen globin khi gen này bị bất hoạt bởi đột biến điểm. Ngược lại sự bù trừ có thể gia tăng để duy trì chức năng gen khi chỉ xóa đoạn gen . 1.3.2. Phân bố đột biến gen globin Hiện nay, có khoảng 40 đột biến gây không xóa đoạn α-thalassemia đã được biết đến [85]. Đột bíến không xóa đoạn phổ biến nhất, thường gặp ở Nam Á là Hb Constant Spring (HbCS), do đột biến này gây chấm dứt codon của gen 2. Đột biến này dẫn đến sản xuất chuỗi globin chỉ có 31 a-xit amin. HbCS có tính chất không ổn định. Dị hợp tử HbCS và các thay đổi kéo dài chuỗi khác tạo nên các phenotype α0 thalassemia. Vài đột biến gây thay đổi cấu trúc chuỗi chỉ xảy ra ở 1 nhiễm sắc thể, tổn thương chỉ 1 gen globin (như HbQThailand, HbGPhiladelphia).
17 Bảng 1.4. Đột biến thalassemia ở các nhóm chủng tộc [46] Nhóm Loại chủng đột Các đột biến Phổ biến ở vùng tộc biến Địa α0 - - MED I Tương đối phổ biến ở Hy Lạp, Trung Cyprus, Thổ Nhĩ Kỳ Hải - - MED II Tương đối hiếm, miền nam nước Ý, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ. (α)20.5 phổ biến ở Hy Lạp, Cyprus, Thổ Nhĩ Kỳ α+ - α3.7 Phổ biến ở Địa Trung Hải α IVS I(-5 nt) α Tương đối phổ biến αCSα Tương đối hiếm ở Hy Lạp, Đông Nam Á. αα cd119C>T Hb Groene Hart, phổ biến ở Morocco, Tunisi. α+-α0 Đồng hợp tử gây bệnh HbH, dị hợp α PA1(AATAAG) α tử với α0 thalassemia xóa đoạn gây hội chứng giống Hb Bart's α PA2(AATGAA) α Trung α0 MED I Phổ biến ở Iran, Palestine, Ả rập Đông α+ - α3.7 Phổ biến ở Iran, Palestine, Ả rập α+ - α0 Khá phổ biến ở các nước Ả rập α PA1(AATAAG) α Ấn Độ α+ - α3.7 Phổ biến - α4.2 Ít phổ biến α Koya Dora α Tương đối hiếm α IVS I-117 α Tương đối hiếm α+ - α0 Tìm thấy ở người Suri α PA3(AATA- -) α
18 Nhóm Loại chủng đột Các đột biến Phổ biến ở vùng tộc biến Đông α0 SEA Phổ biến nhất ở châu Á Nam Á FIL Chủ yếu ở người Philippin THAI Phổ biến ở cộng đồng người Thái α+ -α3.7 Khá phổ biến -α4.2 Khá hiếm αCSα Phổ biến ở Trung Quốc αSuan Dok α αQuong Sze α Tìm thấy ở Thái Lan, Lào. αPaksé α αinit A-G α Phổ biến ở Việt Nam αinit -TG α Phổ biến ở Đông nam Á Châu -α3.7 init (-2 bp) Gặp ở Châu Phi và bắc M Phi, α+ -α3.7 Phổ biến Châu M -α3.7 Cd14 T>G Hb Evanston, khá hiếm, cũng tìm và vùng thấy như alen αTα ờ người Suri Caribbe αSeal Rock α Tương đối hiếm Bắc Âu, α0 - Dutch I Hiếm, xảy ra ở người Hà Lan, Đức. Cauca - Dutch II Hiếm, tìm thấy ở những gia đình có tổ tiên người Hà Lan. - Brit Hiếm, tìm thấy ở những người có tổ tiên người Anh α+ αIVS1-116α Hiếm, tìm thấy ở những người có tổ tiên người Hà Lan αIVSII-2α Rất hiếm, tìm thấy ở những người có tổ tiên người Hà Lan αcd129α Hb Utrecht tìm thấy ở những người có tổ tiên người Hà Lan.
19 1.3.3. Rối loạn do kết hợp với bệnh di truyền khác 1.3.3.1. Hội chứng chậm phát triển phối hợp thalassemia (Alpha- thalassemia retardation-16 syndrome): là một hội chứng xóa đoạn gen tiếp giáp do mất một đoạn lớn nhánh ngắn nhiễm sắc thể thứ 16 từ vị trí 16p13.3 đến đầu tận, mất cả 2 gen 1 và gen 2: những bệnh nhân này thường có tật đầu nhỏ và chậm phát triển tâm thần [81]. Khuôn mặt đặc trưng và khèo chân phổ biến, dương vật nhỏ. Đột biến xóa đoạn này xóa cả 2 gen 1 và gen 2 tạo thể cis thalassemia ( /αα). Xét nghiệm để chẩn đoán thể này là FISH, MLPA [78]. 1.3.3.2. Hội chứng khuyết tật trí tuệ liên kết với nhiễm sắc thể giới tính: (Alpha-thalassemia X-linked intellectual disability (ATRX) syndrome): Đây là một dạng hiếm của α thalassemia, đặc trưng bởi tính năng đặc biệt sọ và mặt, 80% bất thường bộ phận sinh dục với dương vật nhỏ và tinh hoàn không xuống hạ nang hoặc bộ phận sinh dục không rõ ràng, chậm phát triển tâm thần vận động nặng với giảm trương lực cơ. Cá nhân bị ảnh hưởng thường karyotype có nhiễm sắc thể 46 XY bình thường. ATRX là do đột biến gen. Gen quy định ATRX nằm ở vị trí Xq13.1 [81]. Hơn 125 đột biến trong gen ATRX đã được xác định trong những người có hội chứng X liên kết với thalassemia gây khuyết tật trí tuệ. Đột biến phổ biến nhất là thay đổi tổng hợp protein (amino a-xít) trong protein ATRX. Đột biến khác chèn hoặc xóa đoạn chứa gen ATRX hoặc thay đổi gen tổng hợp protein. Các đột biến có thể gây mất ổn định các protein ATRX hoặc ảnh hưởng đến tương tác của nó với các protein khác. Những thay đổi này ngăn chặn các protein ATRX làm giảm hoạt động của các gen 1 và gen 2 gây ra thalassemia [78].
20 Trong hội chứng ATRX, cụm gen globin và vùng điều hòa gen HS- 40 trên nhiễm sắc thể 16 còn nguyên vẹn [78],[86]. 1.3.4. Tỷ lệ mang gen bệnh thalassemia Khảo sát bằng điện di Hb ở người trưởng thành khó phát hiện tần suất mang gen bệnh thalassemia. Để khảo sát tỷ lệ mang gen thalassemia các tác giả trên thế giới thường sử dụng chỉ số Hb Bart’s trong máu cuống rốn ở trẻ sơ sinh sau đẻ [10],[42], [64]. Chỉ số nồng độ Hb Bart’s có giá trị khảo sát khác nhau tùy theo từng nghiên cứu. Theo nhiên cứu của tác giả Munkongdee và cộng sự thì chỉ số cắt cho chẩn đoán mang gen thalassemia ở trẻ sơ sinh là Hb Bart’s = 0,2% [72]. Tại Việt Nam nghiên cứu của Nguyễn Khắc Hân Hoan tại bệnh viện Từ Dũ cho thấy 98,7% bệnh thalassemia do 4 loại alen đột biến gây ra: SEA, - 3.7, CS và - 4.2 [5]. Đông Nam Á gồm 10 nước và có khoảng 400 triệu dân, tỷ lệ mang gen bệnh thalassemia khác nhau tùy theo quốc gia, dân tộc. Tỷ lệ mang gen bệnh ở Bắc Thái Lan và Lào từ 30-40%, 4,5% ở Malaysia, 5% ở các đảo Philipin [42], tại Trung Quốc là 7,19% [63]. 1.4. Gen  globin 1.4.1. Cấu trúc gen  globin Bệnh  thalassemia di truyền theo quy luật alen lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường. Các gen chi phối hình thành chuỗi epsilon (), gamma (), delta (), beta () gây đột biến  thalassemia nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thế 11 (11p15.5), dài 1600bp, gồm 3 exon và 2 intron. Cho đến nay, có khoảng hơn 1000 đột biến đã được tìm thấy trên gen  globin, xếp vào 2 nhóm: nhóm gây mất hoàn toàn số lượng chuỗi β globin, làm mất chức năng của gen β gây β° globin và nhóm làm giảm số lượng chuỗi
21 β globin gây β+ globin. Các đột biến này mang tính đặc trưng và phân bố với tỷ lệ khác nhau ở từng dân tộc. Hình 1.5. Sơ đồ của gen  globin “Nguồn: Fernandez R, 2013” [37] Trong bệnh  thalassemia, chuỗi  globin bị thiếu hụt, chuỗi globin được sản xuất quá mức và hình thành phức hợp Hb đồng nhất chỉ có một loại chuỗi . Những Hb ở dạng không hòa tan và tủa trong những tế bào dẫn tới bị phá hủy bởi tủy xương và lách. Cũng giống như bệnh thalassemia, những tế bào hồng cầu trong  thalassemia bị giảm kích thước và số lượng [29]. Đột biến gen này dẫn đến không tổng hợp hoặc giảm tổng hợp chuỗi  globin, thay vào đó là sự tăng tổng hợp các chuỗi  và các chuỗi để tạo thành HbF ( 22), tăng tổng hợp các chuỗi  và các chuỗi  để tạo thành HbA2 ( 22). Vì vậy người bệnh có HbF và HbA2 nhiều hơn bình thường [36]. Nếu cả hai gen  globin đều bị đột biến mất chức năng hoàn toàn, không sản xuất được  globin, khi đó gọi là 0 thalassemia, người bệnh không có HbA1. Nếu một trong hai gen  bị đột biến nhưng vẫn sản xuất một lượng nhỏ  globin khi đó gọi là + thalassemia.  thalassemia phối hợp với HbE tạo thành thể phối hợp  thalassemia/HbE. Thể này có hồng cầu F từ 10-80% và HbE [89].
22 1.4.2. Một vài cơ chế đột biến trong tổng hợp chuỗi  globin [80] Khiếm khuyết sao mã: đột biến ảnh hưởng đến trình tự promoter sao mã gây nên giảm tổng hợp chuỗi  globin. Kết quả là tổng hợp một phần chuỗi  gây nên + thalassemia [80]. Khiếm khuyết dịch mã: đột biến gây nên chấm dứt chuỗi gián đoạn  globin RNA. Thể này gây nên không tổng hợp được chuỗi  globin gây nên 0- thalassemia [80]. Đột biến tại vị trí 101 đột biến thay đổi Nucleotid C T gây + đột biến này thường gặp ở người Thổ Nhĩ Kỳ, Bulgari, Ý [69]. Tại vị trí -92 đột biến thay đổi Nu C T gây + đột biến này thường gặp ở người Địa trung Hải. Tại vị trí -88 đột biến thay đổi Nu C T gây +. Cũng tại vị trí này nếu Nu C A. Tại vị trí 86 và 87 C G gây + cũng thường gặp tại dân cư vùng Địa Trung Hải. Tại vị trí 28 A C hoặc G thường gặp ở Trung Quốc [69]. Khiếm khuyết mRNA nối: đột biến dẫn đến khiếm khuyết mRNA biến đổi các Nu. Tùy thuộc vào cho dù một phần của điểm nối vẫn còn nguyên vẹn hoặc là hoàn toàn bị biến đổi, mà có thể dẫn đến β+ thalassemia hay β0 thalassemia. Vị trí đột biến: Đột biến điểm tại vùng promoter Những đột biến vô nghĩa Đột biến tại những dấu hiệu nối Đột biến trong các exon Đột biến tại vị trí gắn đuôi poly A Những đột biến khung
23 1.4.3. Một số đột biến thƣờng gặp [52],[89]: 1.4.3.1. Đột biến tại vùng promotor: thay thế nucleotid tại vị trí hộp TATA hoặc CACCC dẫn đến giảm tổng hợp chuỗi globin β chỉ còn 10% so với bình thường. 1.4.3.2. Đột biến thay thế [69]: Ở codon 15 G A tạo 0 thể này gặp ở người Ấn Độ. Ở codon 7 A T tạo 0 thể này gặp ở người Trung Quốc. Ở codon -35 A T tạo 0 thể này gặp ở người Thái. Ở codon -37 G A tạo 0 thể này gặp ở người Ả rập. Ở codon -39 C T tạo 0 thể này gặp ở vùng Địa Trung Hải. Ở codon -43 G T tạo 0 thể này gặp ở Châu Âu. Ở codon -61 A T tạo 0 thể này gặp ở Trung Quốc và người da đen. 1.4.3.3. Những đột biến vô nghĩa: thay thế một Nu trong exon dẫn đến tạo thành một trong 3 mã kết thúc (UAA, UAG hoặc UGA) làm cho việc dịch mã kết thúc sớm hơn so với bình thường và tạo sản phẩm β globin không bền vững bị phá hủy ngay trong tế bào. Dạng đồng hợp tử những đột biến này tạo β0 thalassemia. 1.4.3.4. Đột biến tại điểm nối: quá trình cắt những intron và nối những exon của gen  globin đòi hỏi các vị trí cho nối GT tại đầu 5’ của intron và vị trí đầu nối AG tại đầu 3’ của intron bình thường. Đây là điều kiện cần thiết cho việc nối exon bình thường. Những đột biến vị trí cho nối GT hoặc vị trí nhận nối AG của intron gây cản trở nối exon do đó không tạo mRNA  globin và hậu quả không tạo ra sản phẩm  globin gọi là 0 thalassemia. Những đột biến tại vị trí 5,6 của intron dẫn đến giảm khả năng nối RNA chính xác nhưng còn tổng hợp được chuỗi  globin gọi là + thalassemia.
24 Bảng 1.5. Đột biến phổ biến bệnh  thalassemia [43] Đột biến gen β Dân tộc Độ nặng -619 del Người Ấn độ β0 -88 C→T Người da đen β++ IVS1-nt1 G→A Địa Trung Hải β0 -87 C→G Địa Trung Hải, người châu Phi β++ IVS1-nt6 T→C Địa Trung Hải β+/++ IVS1-nt110 G→A Địa Trung Hải β+ -101 C→T Địa Trung Hải β++ IVS2-nt745 C→G Địa Trung Hải β+ codon 39 C→T Địa Trung Hải β0 AATAAA AATGAA Địa Trung Hải β++ Codon 27 G→T (Hb Knossos) Địa Trung Hải β++ codon 5 -CT Địa Trung Hải β0 codon 6 -A Địa Trung Hải, châu phi β0 AATAAA AACAAA Người châu phi, châu M β++ -29 A→G Người châu Phi β++ -31 A→G Nhật Bản β++ IVS1-nt5 G→C Đông Á, Ấn độ β0 IVS2-nt654 C→T Trung Quốc β+ -28 A→C Đông Nam Á β++ Codon 41/42 -TTCT Đông Nam Á β0 Codon 79 G>A (HbE) Đông Nam Á β++ Codon 19 G>A (Hb Malay) Malaysia β+
25 Bảng 1.6. Đột biến gen  thalassemia ở các dân tộc trên thế giới [50] Dân tộc Đột biến gen Địa Trung Hải IVS-1, vị trí 110 (G ➙ A) Codon 39, đột biến vô nghĩa (CAG ➙ TAG) IVS-1, vị trí 1 (G ➙ A) IVS-2, vị trí 745 (C ➙ G), IVS-2, vị trí 1 (G ➙ A) IVS-1, vị trí 6 (T ➙ C) Người Da Đen -34, (A ➙ G) -88, (C ➙ T) Poly(A), (AATAAA ➙ AACAAA) Đông Nam Á Codon 41/42, đột biến khung(-CTTT) IVS-2, vị trí 654 (C ➙ T) -28, (A ➙ T) Ấn độ IVS-1, vị trí 5 (G ➙ C) xoá đoạn 619-bp Codons 8/9, đột biến khung (+G) Codon 41/42, đột biến khung (-CTTT) IVS-1, vị trí 1 (G ➙ T) Tại Việt Nam có 8 đột biến gây ra 95% các trường hợp β thalassemia ở người Việt Nam, gồm cd17(AAG-TAG), cd41/42(-TCTT), -28(A>G), cd71/72(+A), IVS1-1(G>T), IVS1-5(G>C), IVS2-654(C>T) và cd26 (GAG>AAG) gây bệnh huyết sắc tố E [2],[3],[4],[67].
26 1.4.4. Tỷ lệ mang gen bệnh  thalassemia trên thế giới Theo Liên Đoàn Thalassemia Quốc Tế, sự phân bố của β thalassemia của β thalassemia trên toàn thế giới được ước tính như sau Bảng 1.7. Dịch tễ học toàn cầu của bệnh  thalassemia Vùng Tỷ lệ mang gen bệnh Số trẻ mắc mới hàng năm Châu Âu 0,1-15% 1636 Vùng Địa Trung Hải 1,5-6% 9102 0,4-6,8% Nam Á 45346 (HbE trên 30%) Vùng châu Á 0,4-6,8% 5945 Thái Bình Dương (HbE trên 30%) Châu M 0,4-1,3% 300 Các quốc gia Đông Địa Trung Hải và Trung Đông thay đổi từ khoảng 2% người mắc lên đến 18% (ở một số địa phương). Trong thế giới Ả Rập, tỷ lệ nói chung là khoảng 3-3,5%, mặc dù trong một số vùng của Ai Cập, người mang gen bệnh lên đến 9% đã được báo cáo. Tại Ấn Độ có một số vùng có tần số thấp 1% nhưng tại một số địa phương và một số bộ lạc số người mang gen bệnh lên đến 40%. Tỷ lệ người mang gen tổng thể ước tính khoảng 4-5%. Tại khu vực Đông Nam Á và Trung Quốc, tỷ lệ khác nhau rất nhiều với tần số thấp 1% trong một số vùng nhưng tần số cao từ 30% ở một số địa phương, đặc biệt là nơi HbE chiếm tỷ lệ cao. Ở châu Âu tỷ lệ mang gen bệnh khoảng từ 0,1% (phía Bắc) đến 19% (một số địa phương ở Hy Lạp).
27 Tại châu M , châu Phi cận Sahara và Tây Thái Bình Dương  thalassemia thay đổi nhiều giữa các vùng miền. Bảng 1.8. Tỷ lệ mang gen bệnh ở các quốc gia Châu Á [88] Quốc gia  HbE Hb CS Trung Quốc 15 5 + - Trung Quốc Hông Kông 2,2 3-6 - - Trung Quốc Đài Loan 4 1-3 + - Ấn Độ 5-97 3-4 + + Indonesia 6-16 3-10 1-25 - Lào + + + Malaysia + 4,5 + + Maldives 28 18 0,69 0,4 Myanmar 10 0,5-1,5 2-28 - Singapo 2,92 0,93 0,64 - Srilanka + 2,2 0,5 - Thái Lan 10-30 3-9 10-53 - Việt Nam 2,5 1,5 + -  thalassemia và HbE là 2 bệnh huyết sắc tố di truyền phổ biến ở Việt Nam [6],[9],[14].  thalassemia phối hợp với HbE là thể phổ biến nhất trong những trường hợp  thalassemia nặng [23]. Trên toàn thế giới HbE phối hợp với  thalassemia chiếm khoảng 50% những trường hợp  thalassemia nặng [70],[77]. Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất được quan sát ở Ấn độ, Bangladesh, Đông Nam Á đặc biệt là Thái Lan, Lào và Cam Pu Chia là nơi có tỷ lệ cao người mang gen HbE và  thalassemia [38],[48],[66].
28 Bảng 1.9. Tình hình mang gen bệnh  thalassemia tại Việt Nam [6], [14], [16], [18], [20]. Số Tỷ lệ Nghiên cứu Địa phƣơng Dân tộc nghiên mang gen bệnh cứu  thalassemia Nguyễn Công Khanh Hà Nội Việt 401 1,49 Nguyễn Công Khanh Miền Bắc Tày 119 11,0 Bùi Văn Viên và CS Mường 266 20,6 Nguyễn Công Khanh Nùng 42 7,1 Đ.T.M Cầm và CS Thái 236 11,4 Nguyễn Đắc Lai Pako 228 8,33 Vân Kiều 78 2,56 Dương Bá Trực Êđê 371 1,0 Vũ Thị Bích Vân Thái Nguyên Nùng và 10,7 Tày Hoàng Văn Ngọc Thái Nguyên Tày 9,6 Dao 9,8
29 Bảng 1.10. Tỷ lệ của các đột biến  thalassemia ở Việt Nam và các nước trong khu vực [39],[40],[45],[67],[95] Nam Nam Bắc Nam Trung Bắc Đột biến Việt Việt Việt Trung Thái Thái Nam Nam Nam Quốc Lan Lan -28A>G 7,3 4,4 0 11,3 9,3 1,7 CD17A>T 25,0 13,0 48,3 10,0 16,5 21,7 IVS1-1G>T 6,0 4,4 0 0 1,3 1,7 CD4142-TCTT 35,3 43,5 34,5 46,5 41,6 31,6 CD71/72+A 7,3 8,7 3,4 6,3 2,1 13,3 IVS-II-654, C T 7,3 13,0 0 18,7 8,0 8,3 CD95,+5; 10,3 0 13,8 0 0,3 Bảng 1.11. Tỷ lệ mang gen bệnh HbE [8],[12],[14],[19],[28] Số nghiên Tỷ lệ mắc Nghiên cứu Dân tộc cứu bệnh HbE% Nguyễn Công Khanh và CS 1985 Kinh 401 1,24 Nguyễn Công Khanh và CS 1987 Tày 199 1,0 Bùi Văn Viên và CS 1999 Mường 266 12,3 Nguyễn Công Khanh và CS 1987 Nùng 42 7,1 Đ,T,M Cầm và CS 2000 Thái 236 20,3 Bạch Quốc Tuyên và CS 1985 Pako 228 6,14 Bowman J.E 1971 Sê- Đăng 272 4,6 Khơ Me 220 36,8 Nguyễn Đắc Lai và CS 1985 Vân kiều 78 23,0
30 ĐỊA TRUNG HẢI CHÂU Á Hình 1.6. Phân bố các đột biến gen bệnh  thalassemia “Nguồn: Antonio Cao, 2010” [24]
31 1.5. Ngƣời Êđê và M’nông Đắk Lắk là tỉnh miền núi có nhiều dân tộc cùng sinh sống, đông nhất là người kinh, sau đó đến người Êđê và M’nông và một số dân tộc di cư từ các tỉnh phía Bắc như: Tày, Nùng, Dao Ngƣời Êđê: có nguồn gốc lâu đời từ vùng biển. Di cư vào miền Trung Việt Nam rồi di dân lên vùng đất cao nguyên Tây Nguyên khoảng cuối thế kỷ 8 đến thế kỷ 15, tên gọi khác: Anăk Ea Ðê, Ra Ðê (hay Rhađê), Êđê-êgar, Ðê. Tiếng nói của người Ê Ðê thuộc nhóm ngôn ngữ Malayô-Pôlinêxia (ngữ hệ Nam Ðảo). Cộng đồng Êđê là một trong những tộc người bản địa lâu đời của miền đất Tây Nguyên. Ngày nay, với nhiều nhóm địa phương khác nhau, người Êđê cư trú chủ yếu tại các tỉnh Đắk Lắk, Đắc Nông, Phú Yên, Gia Lai. Ngƣời M'Nông: là dân tộc sử dụng ngôn ngữ thuộc nhóm ngôn ngữ Môn-Khmer còn gọi là người Budâng, Preh, Ger, Nong, Prâng, Rlăm, Kuyênh, Chil Bu Nor, nhóm M'Nông-Bu dâng. Dân tộc M'nông thuộc nhóm loại hình nhân chủng Anđônêdien. Bao gồm nhiều nhóm địa phương, cư trú chủ yếu tại các tỉnh Đắc Nông, Đắk Lắk và một phần ở Bình Phước, Lâm Đồng. Hiện nay tập trung đông nhất là tại các huyện: Lắk, Krông Pách, Ea Súp và M'Đrăk, tỉnh Đắk Lắk.
32 Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Nghiên cứu tỷ lệ mang gen thalassemia: trẻ sơ sinh vừa mới sinh dân tộc Êđê và M’nông tỉnh Đắk Lắk. Nghiên cứu tỷ lệ mang gen  thalassemia: Trẻ em 1-15 tuổi dân tộc Êđê và M’nông tỉnh Đắk Lắk. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: cắt ngang phân tích tiền cứu. 2.2.2. Cỡ mẫu: 2 Z1 / 2 p 1 p n 2  n: cỡ mẫu nghiên cứu cần có p: tỷ lệ mắc tại cộng đồng : khoảng sai lệch cho phép giữa tỷ lệ thu được từ mẫu và tỷ lệ của quần thể. : mức ý nghiã thống kê, được quy định bởi người nghiên cứu. Cỡ mẫu xác định tỷ lệ mang gen và kiểu hình gen bệnh thalassemia Lấy p=0,5 = 0,05 ứng với độ tin cậy 95%. Z /2 = 1,96 thu được từ bảng Z ứng với =0,05 = 0,1 (do thời gian lấy mẫu và kinh phí) Thay các giá trị vào công thức trên ta tính được n = 96 trẻ mỗi dân tộc
33 Cỡ mẫu xác định tỷ lệ mang gen và kiểu hình gen bệnh  thalassemia Lấy p = 0,5 = 0,05 ứng với độ tin cậy 95%. Z /2 = 1,96 thu được từ bảng Z ứng với = 0,05 = 0,05 Thay các giá trị này vào công thức trên ta tính được n = 384. Lấy hệ số = 1,4 (do kinh phí nghiên cứu hạn chế) suy ra n = 538 trẻ. 2.3. Cách chọn mẫu 2.3.1. Nghiên cứu tỷ lệ mắc và kiểu hình gen bệnh thalassemia Dùng khung mẫu là trẻ Êđê và M’nông được sinh năm 2012 để chọn xã lấy mẫu. 2.3.1.1. Dân tộc Êđê Phương pháp chọn mẫu: chọn mẫu xác suất tỷ lệ theo cỡ dân số - PPS (probability proportionat to size cluser Sampling) 30 cụm, đơn vị cụm là xã. Khung mẫu là danh sách trẻ sơ sinh được sinh trong năm 2012 dân tộc Êđê xếp theo xã. Có khoảng 4816 trẻ sơ sinh dân tộc Êđê được sinh trong năm 2012 Bậc 1: khoảng cách mẫu bằng số trẻ em sinh trong năm 2012 dân tộc Êđê cộng dồn của các xã trong tỉnh chia cho 30 cụm: 4816/30= 160 Chọn một số ngẫu nhiên sao cho nhỏ hơn hoặc bằng khoảng cách mẫu. Trong nghiên cứu này tờ giấy bạc được dùng để chọn ra số ngẫu nhiên. Số được chọn là 10. Chọn cụm điều tra: cụm thứ nhất là xã đầu tiên trong khung mẫu có số trẻ được sinh năm 2012 có số cộng dồn là: 10
34 Chọn các cụm tiếp theo như sau: chọn xã có trẻ sơ sinh theo số cộng dồn là: (10+1×160), (10+2×160), (10+3×160) (phụ lục 2). Mỗi cụm chọn 96/30 = 3,2 trẻ. Lấy chẵn 4 trẻ. Bậc 2: mỗi xã chọn sẽ lấy mẫu máu cuống rốn khi trẻ được sinh tại trạm xá xã, bệnh viện huyện có xã đó, bệnh viện tỉnh từ 1/1/2014-30/6/2014. Lấy mẫu liên tục cho đến khi đủ số mẫu. 2.3.1.2. Dân tộc M’nông Dùng phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên hệ thống. Phương pháp chọn mẫu: sử dụng k thuật PPS 30 cụm, đơn vị cụm là các xã dân tộc M’nông. Bậc 1: Theo điều tra dân số thì có khoảng 773 trẻ em dân tộc M’nông được sinh trong năm 2012 tại tỉnh Đắk Lắk. Lập danh sách xã dân tộc M’nông của tỉnh, khung mẫu là danh sách trẻ em dân tộc M’nông sinh trong năm 2012 cộng dồn xếp theo xã. Khoảng cách mẫu (k) bằng tổng số trẻ được sinh dân tộc M’nông trong tỉnh chia cho 30 cụm: 773 k 26 30 Chọn một số ngẫu nhiên (x) có 3 chữ số sao cho nhỏ hơn hoặc bằng khoảng cách mẫu (k). Trong nghiên cứu này, tờ giấy bạc được dùng để chọn ra số ngẫu nhiên là 10. Chọn xã đầu tiên là xã có trẻ được sinh cộng dồn trong khung mẫu bằng số ngẫu nhiên là 10. Các xã tiếp theo được chọn là xã có trẻ theo số cộng dồn là: (10+ 26), (10 + 2×26), (10 + 3×26) (10 + 29×26). Mỗi cụm chọn 96/30 = 3,2 trẻ. Lấy chẵn 4 trẻ.
35 Bậc 2: mỗi xã chọn sẽ lấy mẫu máu cuống rốn khi trẻ được sinh tại trạm xá xã, bệnh viện huyện có xã đó hoặc bệnh viện tỉnh từ 1/1/2014-30/6/2014. Lấy mẫu liên tục cho đến khi đủ số mẫu. 2.3.2. Nghiên cứu tỷ lệ mắc và kiểu hình gen bệnh  thalassemia 2.3.2.1. Dân tộc Êđê Phương pháp chọn mẫu: chọn mẫu xác suất tỷ lệ theo cỡ dân số PPS 30 cụm, đơn vị cụm là xã. Khung mẫu là danh sách trẻ 1-15 tuổi trong năm 2011 dân tộc Êđê xếp theo xã Có khoảng 111040 trẻ 1-15 tuổi trong năm 2011 Bậc 1: chọn xã nghiên cứu: theo khung mẫu Khoảng cách mẫu bằng số trẻ 1-15 tuổi trong năm 2011 dân tộc Êđê cộng dồn của các xã trong tỉnh chia cho 30 cụm: 111040/ 30=3701. Chọn một số ngẫu nhiên sao cho nhỏ hơn hoặc bằng khoảng cách mẫu. Trong nghiên cứu này tờ giấy bạc được dùng để chọn ra số ngẫu nhiên. Số được chọn là 157. Chọn cụm điều tra: cụm thứ nhất là xã đầu tiên trong khung mẫu có trẻ có số thứ tự là 157. Chọn các cụm tiếp theo như sau: chọn xã có trẻ theo số cộng dồn là: (157+ 1× 3701), (157+2× 3701) (157+29× 3701). Bậc 2: mỗi xã chọn sẽ lấy theo phương pháp ngẫu nhiên đơn 538/30 = 18 trẻ. Lấy chẵn 20 trẻ.
36 2.3.2.2. Dân tộc M’nông Phương pháp chọn mẫu: xác suất tỷ lệ cỡ dân số - PPS chọn mẫu 30 cụm, đơn vị cụm là xã. Khung mẫu là danh sách trẻ 1-15 tuổi trong năm 2011 dân tộc M’nông xếp theo xã. Có khoảng 18694 trẻ 1-15 tuổi trong năm 2011. Bậc 1: chọn xã nghiên cứu: theo khung mẫu Khoảng cách mẫu bằng số trẻ 1-15 tuổi trong năm 2011 dân tộc M’nông cộng dồn của các xã trong tỉnh chia cho 30 cụm: 18694/30=563 Chọn một số ngẫu nhiên sao cho nhỏ hơn hoặc bằng khoảng cách mẫu. Trong nghiên cứu này tờ giấy bạc được dùng để chọn ra số ngẫu nhiên. Số được chọn là 157. Chọn cụm điều tra: cụm thứ nhất là xã đầu tiên trong khung mẫu có trẻ có số thứ tự là 157 Chọn các cụm tiếp theo như sau: chọn xã có trẻ theo số cộng dồn là: (157 + 1 x 563), (157 + 2 x 563) (157 + 29 x 563). Bậc 2: mỗi xã chọn sẽ lấy theo phương pháp ngẫu nhiên 538/30=18 trẻ. Lấy chẵn 20 trẻ. 2.4. Tiêu chuẩn chọn mẫu 2.4.1. Nghiên cứu tỷ lệ mang gen bệnh và kiểu hình gen bệnh thalassemia Tất cả trẻ sơ sinh vừa mới sinh có mẹ là dân tộc Êđê hoặc M’nông sinh sống tại những xã được chọn nghiên cứu (phụ lục 2). Sinh tại trạm xá xã được chọn nghiên cứu, bệnh viện huyện có xã được chọn nghiên cứu, bệnh viện tỉnh Đắk Lắk.
37 2.4.2. Nghiên cứu tỷ lệ mang gen và kiểu hình gen bệnh  thalassemia Trẻ em dân tộc Êđê hoặc M’nông, sống tại các xã được chọn trong phương pháp chọn mẫu (phụ lục 2) Tuổi từ >1 đến 15 Trẻ có số thứ tự được chọn trong danh sách được chọn theo phương pháp chọn mẫu trên. 2.5. Tiêu chuẩn loại ra 2.5.1. Nghiên cứu tỷ lệ mang gen và kiểu hình gen bệnh thalassemia Mẫu bị hư hỏng trong quá trình vận chuyển. 2.5.2. Nghiên cứu tỷ lệ mang gen và kiểu hình gen bệnh  thalassemia Trẻ không có mặt tại thời điểm nghiên cứu Nếu trẻ được chọn khi lấy mẫu có tiêu chuẩn loại trừ sẽ lấy mẫu là trẻ có số thứ tự kế tiếp trong danh sách. Mẫu bị hư hỏng trong quá trình vận chuyển. 2.6. Thời gian nghiên cứu 2.6.1. Nghiên cứu tỷ lệ mang gen và kiểu hình gen bệnh thalassemia Từ ngày 1/1/2014 đến 30/6/2014. 2.6.2. Nghiên cứu tỷ lệ mang gen và kiểu hình gen bệnh  thalassemia Từ ngày 1/1/2013 đến 30/6/2014. 2.7. Các bƣớc thực hiện 2.7.1. Tập huấn điều tra: các cán bộ tham gia nghiên cứu gổm các bác s , điều dưỡng nhi, nữ hộ sinh được tập huấn về các bước và cách lấy mẫu.
38 2.7.2. Xác định mang gen bệnh thalassemia Các sản phụ sinh tại trạm xá xã, bệnh viện huyện, bệnh viện tỉnh có hộ khẩu tại các xã được chọn. Giải thích sản phụ và gia đình và ký vào bảng đồng ý nghiên cứu Khám và hỏi bệnh mẹ Sau khi trẻ được sinh, lấy máu cuống rốn, cân đo trẻ Xét nghiệm công thức máu máu cuống rốn ĐIỆN DI HEMOGLOBIN Không có Hb E Có Hb E Có Hb Bart’s Không có Hb Bart’s Xét nghiệm sinh học Không có đột biến Không mang gen bệnh phân tử thalassemia Có đột biến Ngƣời mang gen bệnh thalassemia Sơ đồ 2.1: Các bước thực hiện nghiên cứu tỷ lệ thalassemia
39 2.7.3. Xác định mang gen bệnh  thalassemia Khám tại xã được chọn. Giải thích gia đình Gia đình ký vào bảng đồng ý nghiên cứu Mẫu đƣợc chọn: hỏi bệnh, tuổi, tiền sử Xét nghiệm công thức máu MCV 3,5 hoặc/ và HbF>3,5 HbA2<3,5% và HbF<3,5% Có Hb E Không HbE Có HbE Không HbE Xét ng hiệm sinh học phân tử Có đột biến  thalassemia Không có đ ột biến Mang gen bệnh Không mang gen bệnh  thalassemia  thalassemia Sơ đồ 2.2: các bước thực hiện nghiên cứu xác định tỷ lệ mang gen  thalassemia
40 2.8. Vận chuyển và bảo quản mẫu: 2.8.1. Xác định mang gen bệnh thalassemia: mẫu từ trạm xá xã được chọn nghiên cứu, bệnh viện huyện có xã được chọn nghiên cứu, bệnh viện tỉnh. Mẫu máu sau khi đươc lấy từ cuống rốn phần xa có chống đông bằng EDTA 2%, được bỏ vào 2 ống nghiệm được gắn cùng 1 mã số từ trước, lưu giữ trong thùng lạnh, chuyển về bệnh viện tỉnh trong ngày. Một ống xét nghiệm công thức máu và chuyển mẫu xuống mẫu đến trung tâm chẩn đoán y khoa Medic trong vòng 24 giờ. Ống nghiệm còn lại được lưu giữ trong tủ lạnh. Khi có kết quả điện di hemoglobin, mẫu có có Hb Bart’s được chuyển xuống bệnh viện Từ Dũ xét nghiệm sinh học phân tử. 2.8.2. Xác định mang gen bệnh  thalassemia: mẫu được lấy từ các xã được chọn, Mẫu máu tĩnh mạch có chống đông bằng EDTA 2%, được bỏ vào 2 ống nghiệm được gắn cùng 1 mã số từ trước, chuyển về bệnh viện tỉnh trong ngày. Một ống xét nghiệm công thức máu và những trường hợp có MCV<80fL được xét nghiệm điện di hemogloin trong vòng 24 giờ tại bệnh viện tỉnh Đắk Lắk. Ống nghiệm còn lại được lưu giữ trong tủ lạnh. Khi có kết quả điện di hemoglobin, những mẫu có có HbA2 hoặc/và Hb F 3,5% được chuyển xuống bệnh viện Từ Dũ xét nghiệm sinh học phân tử. 2.9. Định nghĩa các biến số: Tuổi: là biến số định lượng: đơn vị tính là năm. Theo quy ước của WHO năm 1983, tuổi của trẻ được tính theo năm, cách tính như sau: Từ 12 tháng đến 23 tháng 29 ngày = trẻ được 1 tuổi. Từ 24 tháng đến 35 tháng 29 ngày = trẻ được 2 tuổi.
41 Ví dụ trẻ sinh ngày 10/1/2005, trẻ được tính là 7 tuổi trong khoảng thời gian từ 10/1/2012 đến 29/12/2012. Những trường hợp chỉ nhớ ngày “âm lịch”, chúng tôi quy ra theo ngày “dương lịch”. Trường hợp không nhớ chính xác ngày tháng sinh, việc tính tuổi dựa vào sự kiện nào đó như theo mùa, dịp tết, hội làng Tuổi thai: là biến số định lượng: đơn vị tính: tuần tuổi. Phương pháp tính tuổi: trẻ sơ sinh trong chẩn đoán thalassemia: tuổi thai tính theo kỳ kinh cuối mẹ, nếu mẹ không nhớ thì tính theo siêu âm sớm nhất. Giới: là biến số định tính có 2 giá trị: nam và nữ. Cân nặng: là biến số định lượng, đơn vị tính là kg. Cân SECA điện tử độ chính xác 0,1kg đối với trẻ lớn và người lớn. Kết quả được tính theo kg và lấy một số lẻ (ví dụ 10,5kg) Cân nặng lúc sinh: là biến số định lượng, đơn vị tính là gam. Cân SECA có lòng máng đối với trẻ nhỏ, có độ chính xác 0,1kg. Trẻ dân tộc Êđê: là những trẻ có cha và mẹ là dân tộc Êđê. (là người có dân tộc ghi trong hộ khẩu là Êđê) Trẻ dân tộc M’ nông: là những trẻ có cha và mẹ là dân tộc M’nông. (là người có dân tộc ghi trong hộ khẩu là M’nông). Hồng cầu: là biến số định lượng đơn vị tính M/L. Hb là biến số định lượng đơn vị tính g/dL. MCV là biến số định lượng đơn vị tính fL. MCH là biến số định lượng đơn vị tính pg. MCHC là biến số định lượng đơn vị tính g/dL. RDW: là biến số định lượng đơn vị tính %.
42 Hb Bart’s là biến số định tính: có 4 giá trị 1-9%, >9- G cd17A>T
43 cd26G>A cd4142-TCTT IVS1-1G>T cd7172+A cd95+5 IVS2-654C>T Khác 2.10. Công cụ thu thập số liệu Nghiên cứu được tiến hành bằng phương pháp phỏng vấn trực tiếp trẻ hoặc bố hoặc mẹ của trẻ trong danh sách đã chọn dựa theo bảng câu hỏi lập sẵn Đối với nghiên cứu xác định thalassemia Thu thập số liệu bằng phỏng vấn: đối với các biến số: tuổi thai, dân tộc. Thu thập số liệu trực tiếp: cân nặng lúc sinh Thu thập số liệu thông qua kết quả các xét nghiệm: nồng độ Hb Bart’s máu cuống rốn, có Hb E trong điện di hemoglobin, kiểu đột biến thalassemia. Các chỉ số hồng cầu: HC, Hb, Hct, MCV, MCH, MCHC, RDW. Đối với nghiên cứu xác định  thalassemia Thu thập số liệu bằng phỏng vấn: đối với các biến số: tuổi, dân tộc, giới Thu thập số liệu thông qua các xét nghiệm: nồng độ HbF, HbA2, có Hb E trong điện di hemoglobin, kiểu đột biến  thalassemia. Các chỉ số hồng cầu: HC, Hb, Hct, MCV, MCH, MCHC, RDW. Các xét nghiệm: Công thức máu: xét nghiệm trên máy CD 1800 của hãng Abbott USA
44 Nguyên lý: Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu được đo bằng phương pháp trở kháng. Hb đo bằng hấp thụ ở bước sóng 540. K thuật: lấy 1ml máu chống đông EDTA. Máy đo các thông số. Đơn vị tính: HC: M/L, Hb: g/L, Hct: %, MCV: fL, MCH: pg, MCHC: g/L, RDW: %, TC: K/L Hình 2.7. Hình ảnh công thức máu ngoại biên trong nghiên cứu Điện di Hb: Mẫu máu được lấy từ máu tĩnh mạch có chống đông bằng EDTA 2% (0,05ml EDTA và 1ml máu) để xét nghiệm huyết đồ và điện di Hb. Trong nghiên cứu xác định gen thalassemia: điện di bằng máy điện di mao quản tại trung tâm chẩn đoán y khoa Medic thành phố Hồ Chí Minh.
45 Hình 2.8. Hình ảnh phiếu điện di Hb bằng máy mao quản Nguyên lý: Sử dụng công nghệ điện di vi lượng trong môi trường cao thế 7700 Volts. Trong nghiên cứu xác định gen  thalassemia: điện di bằng máy điện di Hb là máy điện di tự động Spife 3000 tại bệnh viện tỉnh Đắk Lắk, hãng sản xuất Helena Laboratories – M . Nguyên lý: SPIFE 3000- hệ thống điện di tự động, với phương pháp điện di nằm ngang- loại bỏ sai số gây ra do trọng lực của tác nhân mẫu di, được thực hiện trên bề mặt gel.
46 Hình 2.9. Hình ảnh phiếu điện di Hb trong nghiên cứu tỷ lệ mắc  thalassemia Phƣơng pháp phân tích gen Hb: được phân tích tại bệnh viện Từ Dũ Phương pháp di truyền phân tử sau đây được dùng để khảo sát: Trong khảo sát đột biến gây thalassemia (sơ đồ 2.3) Phương pháp multiplex GAP-PCR và GAP-PCR (khảo sát đột biến SEA, - 3.7 và - 4.2). Quy trình Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước - Biến tính: nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra, phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian: 1-2 phút - Gắn mồi: sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50°C (45-60°C). Thời gian: 1-2 phút. - Kéo dài: DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống, bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase.
47 Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. Gap- PCR Được sử dụng để phát hiện những đột biến mất đoạn. Đây là phương pháp PCR sử dụng 2 đoạn mồi bổ sung cho cả chuỗi bình thường và chuỗi đột biến ở vùng DNA gần chỗ đột biến mất đoạn. Với những đột biến mất đoạn nhỏ hơn 1 kilobase, cặp mồi sẽ tạo ra 2 sản phẩm PCR khác nhau, sản phẩm nhỏ hơn là của alen đột biến. Với những mất đoạn lớn, khoảng cách giữa 2 mồi ở alen bình thường là quá xa để khuếch đại và chỉ có sản phẩm PCR của alen đột biến. Trong trường hợp này, alen bình thường được phát hiện bằng cách khuếch đại đoạn DNA qua vùng mất đoạn, sử dụng 1 đoạn mồi bổ sung với trình tự đoạn bị mất và mồi kia thì bổ sung vùng DNA gần chỗ đột biến [54]. Phương pháp này được sử dụng để phát hiện các đột biến mất đoạn: đột biến SEA, - 3.7, - 4.2 Hình 2.10. Hình ảnh kết quả xét nghiệm tìm đột biến thalassemia bằng phương pháp multiplex GAP-PCR.
48 o Phương pháp RFLP (khảo sát đột biến điểm gây Hb Constant Spring) Khảo sát đột biến  thalassaemia: (sơ đồ 2.4) Phƣơng pháp multiplex ARMS-PCR và ARMS-PCR (khảo sát đột biến  thalassaemia sau: -28A>G; cd17A>T; cd26G>A; cd4142-TCTT; IVS1-1G>T; cd7172+A; cd95+5; IVS2-654C>T). Hình 2.11. Hình ảnh kết quả xét nghiệm tìm đột biến  thalassemia bằng phương pháp multiplex ARMS-PCR và ARMS-PCR Mutiplex ARMS-PCR/ARMS-PCR: Khuếch đại có tính chất trơ (Amplification Refractory Mutation System – ARMS) Mutiplex ARMS-PCR và ARMS-PCR là k thuật được sử dụng để sàng lọc các đột biến. Phản ứng này dùng các mồi đặc hiệu có trình tự đầu 3’ bổ sung với alen đột biến và một mồi chung ngược chiều với mồi đặc hiệu alen. Sự có mặt của đột biến được thể hiện bằng sản phẩm DNA khuếch đại với các kích thước khác nhau đã biết trước. 08 đột biến thường gặp ở người Đông Nam Á được chia thành 5 nhóm và được sàng lọc lần lượt như sau:
49 Các mồi đặc hiệu trên sàng lọc gen  globin Loại đột biến Mồi đặc hiệu Bước 1: cd17 AAG-TAG cd17M cd41/42-TTCT cd41/42M -28 A>G -28M IVS1-1 G>T IVS1-1M Bước 2: IVS1-5 IVS1-5M Bước 3 cd71/72+A cd71/72M Bước 4 IVS2-654 IVS2-654M Bước 5 cd26 HbE-M Phương pháp này dựa trên đặc tính đoạn nucleotide có sự bổ sung không tương hỗ ở đầu 3’ sẽ ngăn chặn sự kéo dài của đoạn mồi trong phản ứng PCR. Để xác định sự hiện diện của đột biến điểm, thì đầu tận của một đoạn mồi trong cặp mồi được sử dụng phải mang tính đặc hiệu và được làm ở 2 dạng: bình thường và đột biến. Đoạn mồi bình thường sẽ trơ với đoạn DNA mang đột biến và chỉ bắt cặp với đoạn DNA bình thường để cho ra sản phẩm PCR. Ngược lại, mồi đột biến sẽ trơ với đoạn DNA bình thường và hoạt động với đoạn DNA mang đột biến cho ra sản phẩm PCR. Giải trình tự gen: Giải trình tự trực tiếp bằng máy tự động Hình 2.12. Hình ảnh giải trình tự gen  thalassemia trong nghiên cứu
50 Máu đã điện di Hb có Hb Bart Lấy 2ml máu EDTA Tách DNA Phương pháp multiplex Phương pháp RFLP GAP-PCR và GAP-PCR (Khảo sát đột biến xóa đoạn) (khảo sát đột biến điểm) Có đột biến Không có đột biến PCR kiểm tra MLPA Không phát hiện đột biến GIẢI TRÌNH TỰ gen Sơ đồ 2.3: Các bước tiến hành khảo sát gen thalassemia
51 Điện di Hb: có tăng HbF, HbA2 hoặc Hb E Lấy 2ml máu EDTA Tách DNA Phương pháp multiplex ARMS-PCR và ARMS-PCR Có đột biến Có đột biến Không phát hiện đột biến PCR kiểm tra GIẢI TRÌNH TỰ Sơ đồ 2.4: Các bước tiến hành khảo sát gen  thalassemia 2.11. Các biện pháp hạn chế sai lệch Nhóm lấy mẫu được tập huấn k về phương pháp lấy mẫu, phương pháp phỏng vấn, thu thập thông tin, cách thức bảo quản và vận chuyển mẫu. Nghiên cứu sinh tham gia vào nhóm lấy mẫu, trong nhóm lấy mẫu có cán bộ lấy mẫu là dân tộc Êđê và M’nông có thể nghe nói thành thạo tiếng dân tộc.
52 Người lấy mẫu máu cuống rốn là nữ hộ sinh tham gia đỡ đẻ. Người lấy mẫu máu ở trẻ em là các điều dưỡng nhi khoa. Có phương tiện bảo quản mẫu: thùng lạnh 2.12 Xử lý số liệu: bằng phương pháp thống kê y học. Số liệu trong nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm Epi-info 3.4.3. Dùng phép kiểm chi bình phương để so sánh hai tỷ lệ, được cho là có ý nghĩa khi p<0,05. 2.13. Vấn đề y đức trong nghiên cứu: Nguy cơ: các bước tiến hành nghiên cứu này không làm ảnh hưởng đến bệnh nhân. Đối với nghiên cứu xác định tỷ lệ thalassemia: lấy máu cuống rốn phần đã cắt đi, không ảnh hưởng đến bệnh nhân. Đối với nghiên cứu  thalassemia: lấy 2ml máu, người lấy mẫu là điều dưỡng nhi khoa, không gây ảnh hưởng nhiều đến bệnh nhân. Lợi ích: nghiên cứu này nhằm phát hiện bệnh nhân thalassemia, tư vấn phòng bệnh bằng hôn nhân di truyền để hạn chế sinh ra thể nặng giảm gánh nặng cho gia đình. Mặt khác trong nghiên cứu phát hiện những trẻ thiếu máu, suy sinh dưỡng do những nguyên nhân khác như thiếu máu thiếu sắt từ đó sẽ có những hướng dẫn dinh dưỡng và điều trị làm giảm độ nặng của bệnh. Từ nghiên cứu này sẽ đưa ra được những định hướng hoạch định trong tương lai, cách quản lý bệnh.
53 Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tỷ lệ mắc và kiểu hình gen bệnh thalassemia Nghiên cứu trên 195 trẻ sơ sinh ngay sau sinh trong đó có 98 trẻ sơ sinh dân tộc Êđê và 97 trẻ sơ sinh dân tộc M’nông có mẹ có địa chỉ tại các xã được chọn nghiên cứu, từ ngày 01/1/2014 đến 30/6/2014 chúng tôi thu nhận được kết quả sau: 3.1.1. Đặc điểm dân số nghiên cứu 3.1.1.1. Tuổi thai Bảng 3.12. Tuổi thai Tuổi thai (tuần) 42 Tổng n 0 0 6 52 40 0 98 Êđê % 0,0 0 6,1 53,1 40,8 0,0 100 n 0 1 6 56 34 0 97 M’nông % 0,0 1,0 6,2 57,7 35,1 0,0 100 n 0 1 12 108 74 0 195 Tổng % 0,0 0,5 6,2 55,4 37,9 0,0 100 Nhận xét: Đa số trẻ sơ sinh trong nghiên cứu có tuổi thai từ 34-42 tuần ở cả hai dân tộc Êđê và M’nông chiếm trên 90% các trường hợp khảo sát. Không có trường hợp nào 42 tuần.
54 3.1.1.2. Cân nặng lúc sinh Bảng 3.13. Cân nặng lúc sinh Tuổi thai (tuần) 9-<25% 25% Tổng Barts n 28 4 0 32 66 98 Êđê % 28,6 4,1 0,0 32,7 67,3 100 n 17 1 0 18 79 97 M’nông % 17,5 1,0 0,0 18,6 81,4 100 n 45 5 0 50 145 195 Tổng % 23,1 2,6 0,0 25,6 74,4 100 Nhận xét: Trên điện di Hb bằng máy điện di mao quản. Tỷ lệ có Hb Bart’s trên máu cuống rốn ở trẻ sơ sinh ngay sau sinh dân tộc Êđê là 32,7% và M’nông là 18,6%. Tỷ lệ có Hb Bart’s ở máu cuống rốn ở cả hai dân tộc là 25,6%. Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ máu cuống rốn có Hb Bart’s giữa trẻ Êđê và M’nông ở mức p<0,05.
55 3.1.2.2. Tỷ lệ mang gen bệnh thalassemia: phân tích đột biến gen thalassemia trên 50 trường hợp có Hb Bart’s chúng tôi thu nhận được kết quả có 48 trường hợp có đột biến trên gen và 2 trường hợp không có đột biến. Bảng 3.15. Tỷ lệ mang gen bệnh thalassemia Mang gen bệnh Không mang gen bệnh Dân tộc Tổng n % n % Êđê 31 31,6 67 68,4 98 M’nông 17 17,5 80 82,5 97 Tổng 48 24,6 147 75,4 195 Phép kiểm 2, P<0,05 Nhận xét: Xét nghiệm sinh học phân tử tất cả những trường hợp có Hb Bart’s. 31,6% dân tộc Ê đê và 17,5% dân tộc M’nông mang đột biến gen thalassemia. Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ mang gen bệnh thalassemia ở trẻ Êđê và M’nông ở mức p<0,05. Êđê M’ nông Cả hai dân tộc Tỷ lệ mang gen bệnh 10% 15 20 25 30 35 40 Biểu đồ 3.1. So sánh tỷ lệ mang gen bệnh thalassemia ở hai dân tộc
56 3.1.3. Các kiểu hình gen bệnh thalassemia 3.1.3.1. Tỷ lệ các đột biến Bảng 3.16. Tỷ lệ các đột biến gen bệnh thalassemia ở cả hai dân tộc Có đột biến Bình thƣờng Kiểu đột biến Xóa đoạn Không xóa đoạn SEA - 3.7 CS Êđê n 3 18 21 56 (n=98) % 4,1 18,4 21,4 57,1 M’nông n 1 10 12 74 (n= 97) % 1,0 10,3 12,4 76,3 Tổng n 4 28 33 130 N=195 (%) 2,1 14,4 16,9 (66,7) Nhận xét: Tỷ lệ mang kiểu gen - 3.7 ở trẻ sơ sinh mới đẻ là 14,4%, ở trẻ Êđê là 18,4% và ở trẻ M’nông là 10,3%. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ mang đột biến - 3.7 ở trẻ Êđê và M’nông ở mức p>0,05. Tỷ lệ mang kiểu gen SEA ở trẻ sơ sinh mới đẻ ở cả hai dân tộc là 2,1%. Ở dân tộc Êđê là 4,1% và dân tộc M’nông là 1,0%. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ mang đột biến SEA ở trẻ Êđê và M’nông ở mức p>0,05. Không gặp đột biến - 4.2, đột biến THAL, đột biến FIL trong mẫu nghiên cứu. Tỷ lệ trẻ mang đột biến không xóa đoạn - CS ở cả hai dân tộc là 16,9%. Ở dân tộc Êđê là 21,4% và dân tộc M’nông là 12,4%. Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ mang đột biến CS ở trẻ Êđê và M’nông ở mức p<0,05.
57 3.1.3.2. Tỷ lệ các kiểu gen: Bảng 3.17. Tỷ lệ các kiểu gen bệnh thalassemia ở cả hai dân tộc Mang gen thalassemia Mang gen thalassemia Tổn Tổn thƣơng Tổn thƣơng 2 gen thƣơng Kiểu gen 1 gen Tổng 3 gen không 3.7 3.7 SEA 3.7 SEA cs cs - - - / / / / / / / 3.7 cs 3.7 cs - - n 3 4 1 4 8 9 2 67 98 Êđê % 3,1 4,1 1,0 4,1 8,2 9,2 2,0 68,4 100 M’nôn n 3 1 1 1 5 6 0 80 97 g % 3,1 1,0 1,0 1,0 5,1 6,1 0,0 82,5 100 n 6 5 2 5 13 15 2 147 195 Tổng % 3,1 2,6 1,0 2,6 6,7 7,7 1,0 75,4 100 Nhận xét: Kiểu gen - 3.7/- 3.7 chiếm tỷ lệ 2,6% tổng số trẻ khảo sát và /- 3.7 chiếm tỷ lệ 3,1% tổng số trẻ khảo sát. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ mang kiểu gen - 3.7/- 3.7 ở trẻ Êđê và M’nông ở mức p>0,05. Kiểu gen CS /- 3.7 chiếm tỷ lệ 7,7% ở cả hai dân tộc: 9,2% ở trẻ Êđê, 6,1% ở trẻ M’nông, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ mang kiểu gen CS /- 3.7 ở trẻ Êđê và M’nông ở mức p>0,05.
58 3.1.3.3. Tỷ lệ bệnh HbE theo các đột biến thalassemia Bảng 3.18. Tỷ lệ bệnh HbE theo các đột biến thalassemia ở hai dân tộc Mang gen thalassemia Mang gen thalassemia Không Tổn thƣơng Tổn thƣơng 2 gen Tổn Tổng Mắc HbE 1 gen thƣơng Tổng 3 gen 3.7 3.7 SEA 3.7 SEA cs cs - - - / / / / / / / / 3.7 cs 3.7 cs - - Mắc n 1 2 1 2 3 1 1 11 56 67 HbE % 0,05 1,0 0,05 1,0 1,5 0,05 0,05 5,6 28,7 34,4 Không n 5 3 1 3 10 14 1 37 91 128 mắc % 2,6 1,5 0,05 1,7 5,1 7,2 0,05 19,0 46,7 65,6 HbE Tổng n 6 5 2 5 13 15 2 48 147 195 % 3,1 2,6 1,0 2,6 6,7 7,7 (1,0) 24,6 75,4 100,0 Nhận xét: Tỷ lệ mắc HbE ở trẻ sơ sinh sau đẻ là 34,4%. Có 11 trẻ mắc đột biến phối hợp HbE và thalassemia với tỷ lệ là 5,6%. Tỷ lệ đột biến - 3.7/- 3.7 phối hợp với HbE chiếm 1% tổng số trẻ Tỷ lệ đột biến - 3.7/ SEA phối hợp với HbE chiếm 1% Đồng hợp tử cs / cs phối hợp với HbE chiếm 1,5%.
59 Bảng 3.19. Tỷ lệ bệnh HbE theo các đột biến thalassemia dân tộc Êđê Mang gen thalassemia Mang gen thalassemia Không Tổn thƣơng 1 Tổn thƣơng 2 gen Tổn Tổng Mắc HbE gen thƣơng Tổng 3 gen 3.7 3.7 SEA 3.7 SEA cs cs - - - / / / / / / / / 3.7 cs 3.7 cs - - Mắc HbE n 1 1 1 2 1 1 1 8 27 35 % 1,0 1,0 1,0 2,0 1,0 1,0 1,0 8,2 27,6 34,4 Không n 2 3 0 2 7 8 1 23 40 63 mắc HbE % 2,0 3,1 0,0 2,0 7,2 8,2 1,0 23,5 40,8 64,3 n 3 4 1 4 8 9 2 31 67 98 Tổng % 3,1 4,1 1,0 4,1 8,2 9,2 2,0 31,6 68.4 100.0 Nhận xét: Ở dân tộc Êđê, tỷ lệ mắc HbE ở trẻ sơ sinh sau đẻ là 34,4%. Có 8 trẻ mắc đột biến phối hợp HbE và thalassemia với tỷ lệ là 8,2%. Tỷ lệ đột biến - 3.7/- 3.7 phối hợp với HbE chiếm 2,0% tổng số trẻ khảo sát. Tỷ lệ đột biến - 3.7/ SEA phối hợp với HbE chiếm 1,0%. Đồng hợp tử cs / cs phối hợp với HbE chiếm 1,0%.
60 Bảng 3.20. Tỷ lệ bệnh HbE theo các đột biến thalassemia ở dân tộc M’nông Mang gen thalassemia Mang gen thalassemia Không Tổn thƣơng 1 Tổn thƣơng 2 gen Tổn Tổng Mắc HbE gen thƣơng Tổng 3 gen 3.7 3.7 SEA 3.7 SEA cs cs - - - / / / / / / / / 3.7 cs 3.7 cs - - Mắc n 0 1 0 0 2 0 0 3 29 32 HbE % 0,0 1,0 0,0 0,0 2,1 0,0 0,0 3,1 29,9 33,0 Không n 3 0 1 1 3 6 0 14 51 65 HbE % 3,1 0 1,0 1,0 3,1` 6,2 0 14,4 52,6 67,0 Tổng n 3 1 1 1 5 6 0 17 80 97 % 3,1 1,0 1,0 1,0 5,2 6,2 0,0 17,5 82.5 100,0 Nhận xét: Ở dân tộc M’nông, tỷ lệ mắc HbE ở trẻ sơ sinh sau đẻ là 33,0%. Có 3 trẻ mắc đột biến phối hợp HbE và thalassemia với tỷ lệ là 3,1%. Trong nghiên cứu này chúng tôi không gặp trường hợp nào có HbS, Hb Punjab trên điên di Hb bằng máy điện di mao quản.
61 3.1.4. Biểu hiện huyết học 3.1.4.1. Các chỉ số hồng cầu Bảng 3.21. Trung bình các chỉ số huyết học theo kiểu gen bệnh thalassemia ở cả hai dân tộc Tổn thƣơng Tổn thƣơng 2 gen Tổn Bình 1 gen thƣơng thƣờng Chỉ số 3 gen hồng 3.7 3.7 SEA cầu 3.7 SEA cs cs - - - / / / / / / / 3.7 cs 3.7 cs - - n 6 5 2 5 13 15 2 147 HC 4,7 5,0 4,4 0,9 4,2 4,2 4,6 4,6 4,4 0,6 (M/L) 0,4 0,5 0,4 0,6 0,6 0,3 Hb 14,7 15,5 12,6 3,0 13,1 0,6 12,7 13,1 11,5 0,2 14,7 3,8 (g/dL) 0,7 2,9 1,4 1,6 Hct 47,3 49,7 45,3 9,7 46,1 4,6 44,9 46,3 43,6 4,1 48,3 7,6 (%) 3,8 8,5 7,0 6,9 MCV 100,2 99,0 98,0 8,5 110,2 15,4 107,7 103,6 94,5 14,9 110,0 8,8 (fL) 12,9 8,7 11,3 10,6 MCH 31,1 31,0 27,3 1,8 31,4 2,8 30,6 3,2 29,6 24,9 1,3 32,8 3,6 (pg) 2,2 3,4 2,4 MCHC 31,1 31,2 27,8 0,6 28,6 2,3 28,5 27,8 26,4 3,0 29,7 2,8 (g/dL) 2,7 1,3 3,0 3,2 RDW 17,7 16,5 18,6 2,3 18,4 1,2 18,4 17,8 21,2 17,5 (%) 1,8 1,1 1,4 2,6 1,2 2,3
62 Nhận xét: Tính chung cả hai dân tộc, ở trẻ không mang gen thalassemia, trung bình HC là 4,4 0,6M/L, trung bình Hb là: 14,7 3,8g/dL, MCV là 110,0 8,8fL MCH là 32,8 3,6pg, RDW là 17,5 2,3%. Ở trẻ đồng hợp tử - 3.7/- 3.7 trung bình HC là 4,2 0,4M/L, trung bình Hb là: 13,1 0,6g/dL, trung bình MCV là 110,2 15,4fL, trung bình MCH là 31,4 2,8pg, trung bình RDW là 18,4 1,2%. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa chỉ số HC, Hb, MCV, MCH, RDW ở nhóm không mang gen bệnh thalassemia và nhóm mang kiểu gen - 3.7/- 3.7. Bảng 3.22. Trung bình các chỉ số huyết học theo kiểu gen bệnh thalassemia ở dân tộc Êđê Tổn thƣơng 1 Tổn thƣơng 2 gen Tổn Bình gen thƣơng thƣờng Chỉ số 3 gen hồng 3.7 3.7 SEA 3.7 cs cầu SEA cs - - - / / / / / / / .7 / 3 cs 3.7 cs - - n 3 4 1 4 8 9 2 67 HC 4,6 4,8 5,0 4,2 4,2 4,6 4,6 4,4 (M/L) 0,3 0,3 0,0 0,4 0,6 0,4 0,3 0,5 Hb 15,0 14,4 14,7 12,9 12,9 13,3 11,5 14,3 (g/dL) 0,8 1,9 0,0 0,2 1,3 1,2 0,2 1,7 HCT (%) 48,3 46,8 52,1 44,9 46,5 46,9 43,6 47,8 5,3 6,1 0,0 4,3 8,1 6,0 4,1 5,7
63 Tổn thƣơng 1 Tổn thƣơng 2 gen Tổn Bình gen thƣơng thƣờng Chỉ số 3 gen hồng 3.7 3.7 SEA 3.7 cs cầu SEA cs - - - / / / / / / / .7 / 3 cs 3.7 cs - - n 3 4 1 4 8 9 2 67 MCV 105,3 97,3 92 106 109,6 101,7 94,5 109,9 (fL) 17,9 9,2 0,0 15,0 10,1 11,1 14,8 9,5 MCH 32,7 30,2 26 30,6 30,1 28,9 24,9 32,5 (pg) 2,0 3,4 0,0 2,5 3,5 2,2 1,1 4,3 MCHC 31,3 30,9 28,2 28,9 28,3 27,3 26,4 29,9 (g/dL) 3,9 1,3 0,0 2,6 3,7 4,0 3,0 2,5 RDW 17,5 16,8 17 18,2 18,1 16,8 21,2 17,0 (%) 2,9 1,1 0,0 1,3 1,3 2,8 1,2 1,6 Nhận xét: Ở dân tộc Êđê, trẻ không mang gen thalassemia: trung bình HC là 4,4 0,5 M/L, trung bình Hb là: 14,3 1,7g/dL, MCV là 109,9 9,5fL, MCH là 32,5 4,3pg, RDW là 17,0 1,6%. Ở trẻ đồng hợp tử - 3.7/- 3.7 trung bình HC là 4,2 0,4M/L, trung bình Hb là: 12,9 0,2g/dL, trung bình MCV là 106,5 15,0fL, MCH trung bình là 30,6 2,5pg, trung bình RDW là 18,2 1,3%. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa chỉ số HC, Hb, MCV, MCH, RDW ở nhóm không mang gen bệnh thalassemia và nhóm mang kiểu gen - 3.7/- 3.7.
64 Bảng 3.23. Trung bình các chỉ số huyết học theo kiểu gen bệnh thalassemia ở dân tộc M’nông Tổn thƣơng 1 gen Tổn thƣơng 2 gen Chỉ số Bình 3.7 3.7 3.7 SEA cs cs hồng cầu thƣờng - - - / / / / / / 3.7 cs cs - n 3 1 1 1 5 6 80 HC 4,9 5,8 3,7 4,1 4,1 4,2 4,5 (M/L) 0,2 0,0 0,0 0,0 0,6 0,7 0,6 Hb 14,3 19,8 10,5 14,1 12,2 12,9 14,9 (g/dL) 0,6 0,0 0,0 0,0 1,9 2,1 4,9 HCT (%) 46,2 61,7 38,4 51 42,3 45,4 48,7 2,1 0,0 0,0 0,0 4,1 8,6 8,8 MCV 95 106 104 125 104,6 249,8 104,6 (fL) 3,6 0,0 0,0 0,0 13,7 345,6 13,7 MCH 29,5 34,1 28,6 34,6 30,1 30,5 32,5 (pg) 0,5 0,0 0,0 0,0 3,1 2,7 4,2 MCHC 31,0 32,1 37,3 27,6 28,8 28,5 29,5 (g/dL) 1,6 0,0 0,0 0,0 1,7 1,4 3,0 RDW 17,8 15,4 20,2 19 18,9 1,6 19,3 17,9 (%) 0,6 0,0 0,0 0,0 1,1 2,6 Nhận xét: Ở dân tộc M’ nông, ở trẻ không mang gen thalassemia: trung bình HC là 4,5 0,6M/L, trung bình Hb là: 14,9 4,9g/dL, MCV là 104,6 13,7fL, MCH là 32,5 4,2pg, RDW là 17,9 2,6%.
65 Ở trẻ đồng hợp tử Hb CS cs / cs trung bình HC là 4,1 0,6M/L, trung bình Hb là: 12,2 1,9g/dL, MCV là 104,6 13,7fL, MCH là 31,1 1,3pg, RDW là 18,9 1,6%. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa chỉ số HC, Hb, MCV, MCH, RDW ở nhóm không mang gen bệnh thalassemia và nhóm mang kiểu gen đồng hợp tử Hb CS cs / cs . 3.1.4.2. Trung bình các thành phần Hb Bảng 3.24. Trung bình các thành phần Hb theo kiểu hình gen bệnh thalassemia ở cả hai dân tộc Tổn thƣơng 1 Tổn thƣơng 2 gen Tổn Bình gen thƣơng thƣờng Kiểu 3 gen gen 3.7 3.7 SEA 3.7 SEA cs cs - - - / / / / / / / 3.7 cs 3.7 cs - - n 6 5 2 5 13 15 2 147 HbF 77,9 79,1 79,4 78,6 76,2 73,4 54,6 78,2 % 13,5 8,1 2,1 9,3 8,3 14,1 5,5 16,4 HbA1 20,7 17,7 14,7 15,4 17,3 20,8 23,0 18,3 % 14,0 9,8 1,6 6,7 6,4 14,4 2,3 15,4 HbA2 0,2 0,0 0,0 0,2 0,2 0,3 0,2 0,3 % 0,4 0,0 0,0 0,4 0,4 1,0 0,3 1,0 Nhận xét: Trung bình HbA1 ở trẻ sơ sinh mới đẻ không mang gen bệnh thalassemia là 18,3 15,4%, trung bình HbF là 78,2 16,4%. Trung bình Hb A1 ở trẻ mang kiểu gen cs / cs là 17,3 6,4%, HbF là 76,2 8,3%.
66 3.7 Trung bình HbA1 ở trẻ mang kiểu gen /- là 20,7 14,0% HbF là 77,9 13,5%. 3.7 3.7 Trung bình HbA1 ở trẻ mang kiểu gen - /- là 15,4 6,7%, HbF là 78,6 9,3%. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa trung bình HbA1, HbF giữa nhóm không mang đột biến và nhóm mang đột biến - 3.7/- 3.7 Không gặp HbS, HbD Punjab trong nghiên cứu. Bảng 3.25. Trung bình các thành phần Hb theo kiểu gen bệnh thalassemia ở dân tộc Êđê Tổn thƣơng 1 Tổn thƣơng 2 gen Tổn Bình gen thƣơng thƣờng Kiểu 3 gen gen 3.7 3.7 SEA 3.7 SEA cs cs - - - / / / / / / / 3.7 cs 3.7 cs - - n 3 4 1 4 8 9 2 67 HbF 83,4 78,4 80,8 77,8 78,8 75,4 54,6 78,1 7,8 9,2 0,0 10,5 8,7 9,6 5,5 14,8 HbA1 14,1 18,9 13,6 14,9 15,7 18,5 23,0 19,4 8,0 10,9 0,0 7,6 6,0 9,0 2,3 15,3 HbA2 0,0 0,0 0,0 0,2 0,2 0,5 0,2 0,2 0,0 0,0 0,0 0,5 0,4 1,3 0,3 0,9 Nhận xét: trung bình HbA1 ở trẻ sơ sinh mới đẻ không mang gen bệnh thalassemia là 19,4 15,3%, trung bình HbF là 78,1 14,8%.
67 cs cs Trung bình HbA1 ở trẻ mang kiểu gen đồng hợp tử Hb CS / là 15,7 6,0%, HbF là 78,8 8,7 %, HbA2 là 0,2 0,4%. 3.7 Trung bình HbA1 ở trẻ mang kiểu gen /- là 14,1 8,0 HbF là 3.7 3.7 83,4 7,8% Trung bình HbA1 ở trẻ mang kiểu gen - /- là 14,1 8,0%, HbF là 77,8 10,5%, HbA2 là 0,2 0,5%. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa trung bình HbA1, HbF giữa nhóm không mang đột biến và - 3.7/- 3.7, nhóm không mang đột biến và nhóm cs / cs Bảng 3.26. Trung bình các thành phần Hb theo kiểu hình gen bệnh thalassemia ở dân tộc M’nông. Tổn thƣơng 1 gen Tổn thƣơng 2 gen Bình thƣờng Thành phần 3.7 3.7 3.7 SEA cs Hb % cs - - - / / / / / .7 / 3 cs cs - n 3 1 1 1 5 6 80 HbF 72,4 81,6 77,9 81,8 72,0 70,5 78,4 17,4 0,0 0,0 0,0 6,5 19,8 17,6 HbA1 27,2 13,0 15,9 17,0 20,0 24,3 17,4 17,2 0,0 0,0 0,0 6,6 20,6 15,4 HbA2 0,3 0,0 0,0 0,0 0,2 0,1 0,3 0,5 0,0 0,0 0,0 0,4 0,2 1,1 Nhận xét: Trung bình HbA1 ở trẻ sơ sinh mới đẻ không mang gen bệnh thalassemia là 17,4 15,4%, trung bình HbF là 78,4 17,6%.
68 cs cs Trung bình HbA1 ở trẻ mang kiểu gen đồng hợp tử Hb CS / là 20,0 6,6%, HbF là 72,0 6,5%. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa trung bình HbA1, HbF giữa nhóm không mang đột biến và đồng hợp tử Hb CS cs / cs . 3.2. Tỷ lệ mắc và kiểu hình gen bệnh  thalassemia Qua nghiên cứu 1149 trẻ em dân tộc Êđê và M’nông tại 60 điểm nghiên cứu thuộc tinh Đắk Lắk, trong đó 588 trẻ em dân tộc Êđê và 561 trẻ em dân tộc M’nông chúng tôi thu nhận được kết quả sau: 3.2.1. Đặc điểm dân số nghiên cứu 3.2.1.1. Tuổi Bảng 3.27. Tuổi >1- 5 >5- 10 >10- 15 Tổng Tuổi n % n % n % n % Êđê 353 60,0% 162 27,6% 73 12,4% 588 100 M’nông 345 61,5% 183 32,6% 33 5,9% 561 100 Tổng 698 60,7% 345 30,0% 106 9,3% 1149 100 Nhận xét: Mẫu nghiên cứu ở cả hai dân tộc Êđê và M’nông tuổi từ 1-5 chiếm tỷ lệ cao nhất. Ở dân tộc Êđê trẻ 1-5 tuổi chiếm 60%. Ở dân tộc M’nông lứa tuổi 1-5 chiếm 61,5%.
69 3.2.1.2. Giới tính Bảng 3.28. Giới tính Nam Nữ Giới Tổng n % n % Êđê 264 44,9 324 55,1 588 M’nông 254 45,3 307 54,7 561 Tổng 516 44,9 633 51,1 1149 Nhận xét: Tỷ lệ trẻ nam Êđê trong nghiên cứu là 44,9%, nữ là 55,1% sự khác biệt này không có ý nghĩa thông kê ở mức p>0,05. Tỷ lệ trẻ nam M’nông trong nghiên cứu là 45,3%, nữ là 54,7% sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê ở mức p>0,05. 3.2.2. Tỷ lệ tăng HbA2 hoặc/và HbF Bảng 3.29. Tỷ lệ tăng HbF hoặc/và HbA2 ở cả hai dân tộc MCV<80fL HbA 3,5% MCV 80fL 2 HbA <3,5% và Tổng Dân tộc hoặc/và 2 HbF<3,5% n HbF 3,5% n % n % n % n % Ê đê 528 37 6,3 491 83,5 60 10,2 588 100 M’nông 469 19 3,4 450 80,2 92 16,4 561 100 Tổng 997 56 4,9 941 81,9 152 13,2 1149 100 2=0,04 p=0,8 Nhận xét: tỷ lệ tăng HbF 3,5% hoặc HbA2 3,5% ở hai dân tộc là 4,9%. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ tăng HbA2 3,5% hoặc/và HbF 3,5% giữa dân tộc Êđê và M’ nông.
70 Nam Nữ Tổng 3% 4% 5% 6% 7% 8% Tỷ lệ tăng HbF>3,5% hoặc/và HbA2>3,5% Biểu đồ 3.2. Tỷ lệ tăng HbF>3,5% hoặc/và HbA2>3,5% ở hai dân tộc theo giới Nhận xét: Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ tăng HbA2 3,5% hoặc/và HbF 3,5% giữa nam và nữ. Bảng 3.30. Tỷ lệ tăng HbA2 hoặc/và HbF ở dân tộc Êđê MCV 80fL Tổng HbA 3,5% hoặc/và HbA <3,5% và Giới 2 2 n HbF 3,5% HbF<3,5% n % n % n % n % Nam 233 15 5,7 218 82,6 31 11,7 264 44,9 Nữ 295 22 6,8 273 84,3 29 9,0 324 55,1 Tổng 528 37 6,3 491 83,5 60 10,2 588 100 2=0,3 p=0,58 Nhận xét: Tỷ lệ tăng HbF 3,5% hoặc/và HbA2 3,5% ở dân tộc Êđê là 6,3%.
71 Bảng 3.31. Tỷ lệ tăng HbA2 hoặc/và HbF ở dân tộc M’nông MCV 80fL Tổng Giới hoặc/và n HbF 0,05.
72 Êđê M’nông Tổng 22% 24% 26% 28% 30% 32% Biểu đồ 3.3. So sánh tỷ lệ mắc HbE ở cả hai dân tộc Bảng 3.33. Tỷ lệ mắc HbE ở dân tộc Êđê theo giới Có HbE Không có HbE Giới n n % n % Nam 264 74 28,0 190 72,0 Nữ 324 89 27,5 235 72,5 Tổng 588 163 27,7 425 72,3 2=0,023 p=0,44 Nhận xét: Tỷ lệ mắc HbE theo tiêu chuẩn điện di Hb ở dân tộc Êđê là 27,7%. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ mắc HbE giữa nam và nữ ở mức P>0,05.
73 Bảng 3.34. Tỷ lệ mắc HbE ở dân tộc M’nông theo giới Có HbE Không có HbE Giới n n % n % Nam 254 77 30,3 177 69,7 Nữ 307 71 23,1 236 76,9 Tổng 561 148 26,4 413 73,6 2=3,7 p=0,03 Nhận xét: Tỷ lệ mắc HbE theo tiêu chuẩn điện di Hb ở dân tộc M’nông là 26,4%. Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ mắc HbE giữa nam và nữ ở mức p<0,05. 3.2.4. Tỷ lệ mang gen bệnh  thalassemia: phân tích trên 56 trường hợp có HbA2 3,5 % hoặc/và HbF 3,5% chúng tôi thu nhận được kết quả sau: Bảng 3.35. Tỷ lệ mang gen bệnh  thalassemia MCV<80fL HbA2 3,5 % hoặc/và HbF 3,5% Dân tộc HbA2<3,5% MCV 80fL Tổng Có đột biến Không và n HbF<3,5% n % n % Êđê 37 2 0,3 35 6,0 491 60 588 M’nông 19 1 0,2 18 3,2 450 92 561 Tổng 56 3 0,3 52 4,5 941 152 1149
74 Nhận xét: Xét nghiệm trên các trường hợp tăng HbF hoặc/và HbA2 3,5% ở dân tộc Êđê chỉ có 2 trường hợp có đột biến gây  thalassemia chiếm tỷ lệ 0,3%. Trên dân tộc M’nông chỉ có 1 trường hợp có đột biến gây  thalassemia chiếm tỷ lệ 0,2%. 3.2.5. Các đột biến gây  thalassemia Bảng 3.36. Các đột biến gây  thalassemia Dân tộc Có đột biến cd17 cd41/42 cd71/72 n % n % n % n % Dân tộc Êđê n=588 2 0,34 0 0 1 0,17 1 0,17 Xét nghiệm = 37 Dân tộc M’nông n=588 1 0,18 1 0,18 0 0 0 0 Xét nghiệm đột biến = 19 Cả hai dân tộc N=1149 3 0,26 1 0,09 1 0,09 1 0,09 Xét nghiệm tìm đột biến=56 Nhận xét: Trên trẻ em dân tộc Êđê chúng tôi chỉ tìm thấy 2 trường hợp có đột biến là đột biến cd41/42 và đột biến cd71/72 chiếm tỷ lệ 0,17%. Không gặp các đột biến gây  thalassemia -28(A G) IVS1-1, VS1-5, VS2-654, cd17 trên mẫu khảo sát. Trên trẻ em dân tộc M’nông chúng tôi chỉ tìm thấy 1 trường hợp đột biến cd17 chiếm tỷ lệ 0,18%. Không gặp các đột biến gây  thalassemia- 28(A G) IVS1-1, VS1-5, VS2-654, cd41/42 và đột biến cd71/72 trên mẫu khảo sát.
75 3.2.6. Biểu hiện huyết học 3.2.6.1. Các chỉ số huyết học theo kiểu gen Bảng 3.37. Trung bình các chỉ số huyết học theo kiểu gen  thalassemia ở cả hai dân tộc Chỉ số  /cd17 /cd41/42 /cd71/72 cd26/cd26 /cd26 / huyết học HC (M/L) 4,1 2,1 5,3 5,1±1,1 5,1±0,4 4,9 0,5 Hb (g/dL) 11,0 3,8 10,9 9,6±2,5 10,6±1,1 11,7±1,4 HCT (%) 30,1 13,8 35,7 29,7±6,8 33,3±2,9 35,5 3,9 MCV (fL) 53,9 66,5 67,3 58,9±4,9 64,3±5,1 72,1±8,1 MCH (pg) 17,0 18,3 20,5 18,8±1,6 20,5±2,0 23,6 3,4 MCHC(g/dL) 31,6 27,5 30,5 32,0±2,1 31,9±1,7 32,6 2,4 RDW (%) 28,4 41,1 15,6 21,6±9,4 17,6±2,4 16,0 2,9 Nhận xét: HC trung bình của các trường hợp không mang đột biến trên gen  là 4,9 0,5M/L, của các trường hợp mang đột biến cd26/cd26 gây HbE đồng hợp tử là 5,1±1,1M/L. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về số HC trung bình giữa 2 nhóm này. Hb trung bình của các trường hợp không mang đột biến trên gen  là 11,7±1,4g/dL, của các trường hợp mang đột biến cd26/cd26 gây HbE đồng
76 hợp tử là 9,6±2,5g/dL. Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về số Hb trung bình giữa 2 nhóm này ở mức p<0,05. MCV trung bình của các trường hợp không mang đột biến trên gen  là 72,1±8,1fL, của các trường hợp mang đột biến cd26/cd26 gây HbE đồng hợp tử là 58,9±4,9fL. Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về số MCV trung bình giữa 2 nhóm này ở mức p<0,05. Bảng 3.38. Trung bình các chỉ số huyết học theo kiểu gen  thalassemia ở dân tộc Êđê. Chỉ số cd41/42 cd71/72 cd26/ cd26 /cd26 / huyết học HC (M/L) 2,1 5,3 4,7±1,2 5,3±0,3 5,0 0,5 Hb (g/dL) 3,8 10,9 8,8±2,9 10,7±1,3 11,7 1,4 HCT (%) 13,8 35,7 27,6±7,7 33,3±3,3 35,1 4,1 MCV (fL) 66,5 67,3 58,6±5,6 63,3±6,1 71,5 8,0 MCH (pg) 18,3 20,5 18,3±1,7 20,3±2,7 23,7 3,2 MCHC (g/dL) 27,5 30,5 31,4±2,5 32,1±2,2 33,1 2,6 RDW (%) 41,1 15,6 24,3±11,3 17,1±1,8 15,9 3,1 Nhận xét: HC trung bình của các trường hợp không mang đột biến trên gen  là 5,0 0,5M/L, của các trường hợp mang đột biến cd26/cd26 gây HbE đồng hợp tử là 4,7±1,2 M/L. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về số HC trung bình giữa 2 nhóm này.
77 Hb trung bình của các trường hợp không mang đột biến trên gen  là 11,7±1,4g/dL, của các trường hợp mang đột biến cd26/cd26 gây HbE đồng hợp tử là 8,8±2,9g/dL. Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về số Hb trung bình giữa 2 nhóm này ở mức p<0,05. MCV trung bình của các trường hợp không mang đột biến trên gen  là 71,5 8,0fL, của các trường hợp mang đột biến cd26/cd26 gây HbE đồng hợp tử là 58,6±5,6fL. Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về số MCV trung bình giữa 2 nhóm này ở mức p<0,05. Bảng 3.39. Trung bình các chỉ số huyết học theo kiểu gen  thalassemia ở dân tộc M’nông Chỉ số huyết học cd17 cd26/cd26 /cd26 / HC (M/L) 4,1 5.6±0,6 5,0±0,4 4,9 0,5 Hb (g/dL) 11,0 10,8±1,2 10,6±1,0 11,6 1,4 HCT (%) 30,1 32,9±3,6 33,4±2,7 35,9 3,5 MCV (fL) 53,9 59,4±4,2 65,3±3,9 72,7 8,3 MCH (pg) 17,0 19,5±1,4 20,7±1,2 23,5 3,5 MCHC (g/dL) 31,6 32,9±1,3 31,7±1,1 32,1 2,0 RDW (%) 28,4 17,2±1,4 18,0±2,8 16,1 2,7 Nhận xét: HC trung bình của các trường hợp không mang đột biến trên gen  là 4,9 0,5M/L, của các trường hợp mang đột biến cd26/cd26 gây HbE đồng
78 hợp tử là 5,6±0,6M/L. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về số HC trung bình giữa 2 nhóm này. Hb trung bình của các trường hợp không mang đột biến trên gen  là 11,6 1,4g/dL, của các trường hợp mang đột biến cd26/cd26 gây HbE đồng hợp tử là 10,8±1,2g/dL. Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về số Hb trung bình giữa 2 nhóm này ở mức p<0,05. MCV trung bình của các trường hợp không mang đột biến trên gen  là 72,7 8,3fL, của các trường hợp mang đột biến cd26/cd26 gây HbE đồng hợp tử là 59,4±4,2fL. Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về số MCV trung bình giữa 2 nhóm này ở mức p<0,05. 3.2.6.2. Trung bình các thành phần Hb theo kiểu gen  thalassemia Bảng 3.40. Trung bình các thành phần Hb theo kiểu gen  thalassemia ở cả hai dân tộc Thành phần cd17 cd41/42 cd71/72 c26/cd26 /cd26 / Hb (%) HbA1 86,7 43,0 74,2 9,8±22,9 68,5±28,6 89,2±21,1 HbF 0,0 38,0 0,0 2,9±5,8 1,5±6,5 1,2±3,7 HbA2 7,5 0,0 3,9 2,9±1,9 3,3±2,8 3,8±1,6 Nhận xét: Trung bình HbA1 ở những trường hợp không mang gen  thalassemia là 89,2±21,1 những trường hợp mang kiểu gen cd26/cd26 gây HbE đồng hợp tử là 9,8±22,9% và dị hợp tử /cd26 là 68,5±28,6%.
79 Bảng 3.41. Trung bình các thành phần Hb theo kiểu gen  thalassemia ở dân tộc Êđê Thành phần Hb / cd41/42 cd71/72 cd26/cd26 /cd26 (%) HbA1 88,0 4,7 43,0 74,2 15,2 28,5 74,9 20,3 HbF 0,4 1,3 38,0 0,0 3,2 7,1 1,2 2,8 HbA2 3,9 1,4 0,0 3,9 3,1 1,5 3,2 2,1 Nhận xét: Trung bình HbA1 ở những trường hợp không mang gen  thalassemia là 88,0 4,7% những trường hợp mang kiểu gen cd26/cd26 gây HbE đồng hợp tử là 15,2 28,5% và dị hợp tử /cd26 là 74,9 20,3%. Bảng 3.42. Trung bình các thành phần Hb theo kiểu gen  thalassemia ở dân tộc M’nông Thành phần Hb (%) / /cd17 cd26/cd26 /cd26 HbA1 92,1 7,8 86,7 0,0 1,2 1,9 62,8 33,9 HbF 0,1 0,6 0,0 2,38 3,29 2,4 9,6 HbA2 3,6 2,2 7,2 0,0 2,4 3,3 3,7 3,3 Nhận xét: Trung bình HbA1 ở những trường hợp không mang gen  thalassemia là 92,1 7,8% những trường hợp mang kiểu gen cd26/cd26 gây HbE đồng hợp tử là 1,2 1,9% và dị hợp tử /cd26 là 62,8 33,9%.
80 Chƣơng 4 BÀN LUẬN 4.1. Tỷ lệ mắc và kiểu hình gen bệnh thalassemia 4.1.1. Tỷ lệ mang gen bệnh: Nồng độ Hb Bart’s: Nghiên cứu trên 195 trẻ sơ sinh trong đó 98 trẻ sơ sinh dân tộc Êđê và 97 trẻ sơ sinh dân tộc M’nông có mẹ sinh sống tại các xã trong tỉnh Đắk Lắk. Các trẻ trong nghiên cứu có tuổi thai từ 26-42 tuần được lấy máu cuống rốn ngay sau sinh. Kết quả điện di Hb bằng máy điện di mao quản cho thấy tỷ lệ trẻ sơ sinh có Hb Bart’s trong nghiên cứu là 50 trường hợp chiếm 25,6% trong đó trẻ Êđê là 32 trường hợp chiếm 32,7% và trẻ M’nông là 18 trường hợp chiếm 18,6%. Theo một số tác giả tỷ lệ có Hb Bart’s trong nghiên cứu ở cộng đồng có thể suy ra tỷ lệ mang gen bệnh thalassemia [33],[60]. Như vậy nếu tính theo tiêu chuẩn này thì tỷ lệ bệnh thalassemia là 25% ở cả hai dân tộc, 32,7% ở trẻ Êđê và 18,6% ở trẻ M’nông. Tỷ lệ này cao hơn nghiên cứu về máu cuống rốn ở Thái Lan là tỷ lệ có Hb Bart’s là 4,95% [64], cao hơn tỷ lệ có Hb Bart’s ở máu cuống rốn ở dân tộc Kinh Hà Nội là 2,3%. Các mẫu này sau khi được phân tích bằng sinh học phân tử thấy rằng có 2 trường hợp có Hb Bart’s trong máu cuống rốn nhưng không tìm thấy đột biến. Tỷ lệ tìm thấy có đột biến/máu có Hb Bart’s là 48/50. Trước khi có sinh học phân tử, sự hiện diện của Hb Bart’s trong giai đoạn sơ sinh được dùng để chẩn đoán tỷ lệ mang gen thalassemia. Tuy nhiên vẫn có 0,5-1% trường hợp có Hb Bart’s mà không có khiếm khuyết trên gen . Hai trường hợp không có đột biến trong nghiên cứu đều có nồng độ Hb Bart’s rất thấp,
81 <0,5%. Tỷ lệ 48/50 trường hợp có đột biến chứng tỏ Hb Bart’s trong máu cuống rốn có giá trị cao trong tầm soát người mang gen bệnh thalassemia. Để xác định được gen bệnh thalassemia có thể làm điện di Hb trên máu cuống rốn trẻ sơ sinh hoặc bằng xác định gen bệnh bằng sinh học phân tử . Tuy nhiên việc xét nghiệm Hb Bart’s chỉ xác định được tỷ lệ mang gen bệnh trong cộng đồng, không xác định được các kiểu đột biến trên gen . 4.1.2. Tỷ lệ mang gen bệnh thalassemia: Bảng 4.43. Tỷ lệ mang gen bệnh ở các dân tộc trên thế giới [26], [42], [58], [63] Quốc gia Tỷ lệ mang gen bệnh % Bắc Thái Lan 30-40 Lào 30-40 Malaysia 4,5 Philipin 5 Trung quốc 7,19 Châu Phi 41,2 Châu M 4,8 Địa Trung Hải 19 Châu Âu 2,3 Chúng tôi 24,6
82 Tỷ lệ mang gen bệnh thalassemia ở cả hai dân tộc Êđê và M’nông là 48/195 trường hợp chiếm tỷ lệ 24,6%, trong đó dân tộc Êđê là 31/98 trường hợp 31,6% và dân tộc M’nông là 17/97 trường hợp chiếm 17,5%. Sự khác biệt về tỷ lệ mang gen bệnh của dân tộc Êđê và M’nông có ý nghĩa thống kê ở mức p<0,05. Tỷ lệ mang gen bệnh của trẻ em Êđê trong nghiên cứu của chúng tôi gần tương tự như các nước trong khu vực như Thái Lan, Lào 30-40% và cao hơn nhiều so với các nước trong khu vực khác như Philipin, Trung Quốc. Tỷ lệ mang gen bệnh của chúng tôi cao hơn nhiều so với tỷ lệ mang gen bệnh ở dân tộc Kinh của tác giả Nguyễn Công Khanh là 2,3%. Theo nhận định của một số tác giả, tỷ lệ mang gen bệnh thalassemia của các nước Đông Nam Á khá cao, dao động tùy theo vùng miền, quốc gia, cao nhất là ở một số vùng của Thái Lan, Lào. Đây cũng là nơi có nhiều trẻ mắc bệnh Hb Bart’s đã được báo cáo. Tỷ lệ mang gen bệnh của chúng tôi là 24,6% cũng khá cao. Tuy nhiên tỷ lệ mắc bệnh Hb Bart’s và HbH có cao hay không còn tùy thuộc vào kiểu đột biến phổ biến ở dân tộc đó là gì. Điều khiển tổng hợp chuỗi globin là do 2 gen 1 và 2 nằm trên nhiễm sắc thể 16. Tùy vào tổn thương 1 hay nhiều gen mà biểu biện lâm sàng hoàn toàn khác nhau. Tỷ lệ các kiểu đột biến: Tính chung cả hai dân tộc, trong nghiên cứu của chúng tôi có tất cả 48 trẻ tìm thấy đột biến trên gen thalassemia. Trong đó 4 trẻ mang đột biến xóa đoạn là SEA là đột biến mất cả 2 gen thalassemia chiếm tỷ lệ 4/195 trường hợp khảo sát. Có 28 trường hợp mang đột biến - 3.7 và 33 trường hợp mang đột biến không xóa đoạn CS gây Hb Constant Spring. Như vậy có 2,1% trẻ sơ sinh sau đẻ mang gen SEA, 14,4% trẻ mang gen - 3.7 và 16,9% trẻ mang gen CS.
83 Bảng 4.44. Tỷ lệ các kiểu đột biến bệnh thalassemia tại một số quốc gia [21], [63] Nghiên cứu - 3.7 - 4.2 SEA FIL THAL CS Trung Quốc 1,86 0,7 4,45 - - - Malaysia 13,4% 1,3 9,2 0,14 0,28 4,3 Cả hai dân tộc 14,4 0,0 2,1 0.0 0.0 16,9 Êđê 18,4 4,1 21,4 M’nông 10,3 1,0 12,4 Trong nghiên cứu của chúng tôi không gặp các đột biến THAL, - 4.2 và FIL là các đột biến thường gặp ở Đông Nam Á. Đột biến - 3.7: Tỷ lệ trẻ mang kiểu đột biến - 3.7 trong nghiên cứu của chúng tôi ở cả hai dân tộc là 14,4%, dân tộc Êđê là 18,4% và dân tộc M’nông là 10,3%. Sự khác biệt về tỷ lệ mang gen giữa hai dân tộc không có ý nghĩa thống kê. Tỷ lệ này tương tự như nghiên cứu của Malaysia là 13,4%. Đột biến - 3.7 là đột + biến xóa đoạn gây mất gen 2 gây thalassemia. Trong đột biến này gen 1 còn nguyên vẹn và có thể điều hòa tổng hợp chuỗi globin gấp 1,8 lần so với gen 1 trên nhiễm sắc thể bình thường theo cơ chế bù trừ [69]. Đây cũng là đột biến thường gặp ở Đông Nam Á [42]. Đột biến SEA: Trong nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ đột biến SEA chiếm tỷ lệ thấp, chỉ 2,1% trẻ trong nghiên cứu mang đột biến này (4,1% ở trẻ Êđê và 1% ở trẻ M’nông). Tỷ lệ mang đột biến này ở Đông Nam Á 3-14%, Bắc Thái Lan là
84 4,6%, 4,1% ở Hồng Kông và 4,1% ở Quảng Đông Trung Quốc [31]. Không có sự khác biệt có ý nghĩa về tỷ lệ mang đột biến này giữa hai dân tộc. Tỷ lệ mang đột biến này thấp. Tuy nhiên đây là đột biến xóa đoạn mất cả 2 gen gây 0 thalassemia. Hôn phối giữa hai người mang gen SEA có khả năng 25% sinh ra trẻ mắc Hb Bart’s. Đây là thể bệnh có bệnh cảnh lâm sàng nặng nề, gây phù nhau thai và đa số chết ngay sau sinh. Hiện nay khả năng điều trị thể bệnh Hb Bart’s vô cùng thấp. Nhất là các nước đang phát triển như nước ta hiện nay. Vì vậy việc phát hiện người mang gen bệnh SEA nhằm mục đích tư vấn hôn nhân di truyền hoặc sàng lọc trước sinh là rất cần thiết. Người mang đột biến SEA khi hôn phối với người có mang một đột biến thalassemia khác khả năng sinh con mang 3 gen globin là 25%. Đây là thể bệnh HbH có thể gây thiếu máu, ứ sắt, tổn thương đa cơ quan [85]. Đột biến CS: Trong nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ mang đột biến CS khá cao 16% ở cả hai dân tộc và lên đến 21,4% ở dân tộc Êđê. Tỷ lệ này ở Thái Lan khoảng 5-8%. Đột biến CS tạo Hb Constant Spring là đột biến thalassemia không xóa đoạn phổ biến nhất và là nguyên nhân quan trọng gây bệnh lý tương tự HbH ở Đông Nam Á [84]. Thể bệnh dị hợp tử Hb Constant Spring là bệnh lý không gây bệnh cảnh lâm sàng nặng nề tuy nhiên nếu đồng hợp tử hoặc kết hợp với các đột biến xóa đoạn khác sẽ gây nên bệnh lý như HbH [85]. Tỷ lệ mang đột biến này là 1-6% ở các quốc gia Đông Nam Á và cao nhất Bắc Thái Lan và Lào [61]. Đột biến này gây chấm dứt codon tại vị trí 142 của gen . Bộ 3 Nu TAA bị thay bằng CAA dẫn đến thay vì chấm dứt tổng hợp chuỗi. Đột biến này dẫn đến sản xuất chuỗi globin kéo dài 31 axit amin. Hồng cầu Hb Constant Spring cứng và không ổn định.
85 Dị hợp tử Hb Constant Spring khi phối hợp với đột biến xóa đoạn thalassemia sẽ gây bệnh tương tự như HbH [41],[74]. Có khoảng hơn 40 đột biến không xóa đoạn thalassemia đã được báo cáo. Trong nghiên cứu này trên trẻ Êđê và M’nông chúng tôi chỉ gặp đột biến không xóa đoạn thalassemia là CS không gặp các đột biến gây Hb Chesapeake, Hb Quong Sze là các đột biến không xóa đoạn đã tìm thấy ở Đông Nam Á [55]. 4.1.3. Tỷ lệ các kiểu gen So sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi với nghiên cứu khác trong khu vực, chúng tôi thấy kết quả như sau: Bảng 4.45. Tỷ lệ các kiểu gen bệnh Tổn Bình Tổn thƣơng Tổn thƣơng 2 gen thƣơng 3 thƣờng 1 gen gen Kiểu gen 3.7 3.7 3.7 CS α SEA SEA - CS - - / - /α / / / / / α / / 3.7 3.7 S C CS - - α α Hai dân tộc 75,4 3,1 2,6 1 2,6 6,7 7,7 1 Êđê 68,4 3,1 4,1 1,0 4,1 8,2 9,2 2,0 M’nông 82,5 3,1 1,0 1,0 1,0 5,1 6,1 0,0 Malaysia [21] 50 15,5 5,6 13,5 2,2 0,1 1,3 3,8
86 Tổn thƣơng 1 gen Kiểu gen /- 3.7: Kiểu gen /- 3.7chiếm 3,1%. Những trẻ mang đột biến gen này là người lành mang gen bệnh. Người mang kiểu gen này bị tổn thương một gen 2. Do có sự bù trừ của gen 1 nên chuỗi globin vẫn được tổng hợp khoảng 75% so với bình thường [69]. Tỷ lệ ở trẻ Êđê mang kiểu gen này là 3,1% và người M’nông là 3,1% thấp hơn nhiều so với nghiên cứu ở Thái Lan là 15,5%. Trẻ mang kiểu gen này thường sẽ không biểu hiện lâm sàng, chỉ một vài trường hợp có nhược sắc nhẹ và là người mang gen bệnh thể ẩn. Kiểu gen / αCS : Tỷ lệ mang kiểu gen này trong nghiên cứu là 2,6% (4,1% ở trẻ Êđê và 1% ở trẻ M’nông). Đây là kiểu gen mang một đột biến không xóa đoạn thalassemia. Người mang kiểu đột biến này thường không có biểu hiện lâm sàng. Tổn thƣơng 2 gen thalassemia Kiểu gen - 3.7/- 3.7 Kiểu gen - 3.7/- 3.7 chiếm tỷ lệ 2,6% (dân tộc Êđê 4,1%, dân tộc M’nông 2,6%), tỷ lệ này tương tự như nghiên cứu của tác giả Ahmad (Malaysia) là 2,2% [21],[69]. Đây là thể cả hai nhiễm sắc thể cùng bị xóa đoạn 3.7kb. Hai gen 2 nằm trên hai nhiễm sắc thể đều bị xóa. Đây cũng là thể xóa đoạn đồng hợp tử hay gặp nhất ở Đông Nam Á, còn gọi là thể trans trait thalassemia. Những trẻ mắc kiểu gen này khi lớn lên thường có MCV thấp, thiếu máu nhẹ hồng cầu nhỏ và hiếm khi có chỉ định truyền máu [40].
87 Kiểu gen / αSEA: Đây là kiểu gen mang 1 đột biến xóa đoạn tổn thương 2 gen thalassemia. Còn gọi là thể cis trait thalassemia. Trẻ mang kiểu gen này thường chỉ có hồng cầu nhỏ và nhược sắc nhẹ. Thể này hay gặp ở Đông Nam Á. Phụ nữ mang kiểu gen này có khả năng sinh con mắc bệnh Hb Bart’s. Tỷ lệ mang kiểu gen này chỉ gặp 1% ở cả hai dân tộc Êđê và M’nông thấp hơn rất nhiều so với nghiên cứu ở Malaysia là 13,5%. Vì vậy cho dù tỷ lệ mắc thalassemia của hai dân tộc này khá cao nhưng tỷ lệ mắc kiểu gen mang đột biến 2 gen trên cùng một nhiễm sắc thể thấp nên kiểu gen tổn thương cả 4 gen thấp. Kiểu gen αCS /-α3.7: Trong nghiên cứu của chúng tôi kiểu gen này chiếm tỷ lệ là 7,7% (9,2% ở trẻ Êđê và 6,1% ở trẻ M’nông). Đây là kiểu gen phối hợp 1 đột biến xóa đoạn -α3.7 và một đột biến không xóa đoạn là αCS. Được coi là kiểu gen tổn thương 3 gen globin. Kiểu hình của những trường hợp mang gen này thường không thiếu máu hoặc thiếu máu nhẹ đến vừa ở tuổi dậy thì. Các trường hợp mang kiểu gen này thường có hồng cầu nhược sắc nhiều [85]. Một số nghiên cứu thấy rằng biểu hiện lâm sàng của thể này gần tương tự như bệnh HbH [41],[74],[92]. Kiểu gen αCS /αCS : Đây là kiểu gen đồng hợp tử Hb CS. Trong nghiên cứu của chúng tôi kiểu gen này chiếm tỷ lệ 6,7% (8,2% ở trẻ Êđê và 5,1% ở trẻ M’nông). Tỷ lệ này cao hơn nhiều với nghiên cứu ở Malaysia chỉ chiếm tỷ lệ 0,1%. Theo một số nghiên cứu, những người mang kiểu gen này có lâm sàng gần tương tự như bệnh HbH [69]. Đồng hợp tử Hb Constant Spring thường gây thiếu máu trên
88 lâm sàng ở mức độ vửa hoặc nhẹ, chậm phát triển thể chất, gan lách to ít. Một vài trường hợp có chỉ định truyền máu thường qua tuổi dây thì. Tuy nhiên đã có một vài báo cáo rằng có một số trường hợp trẻ sơ sinh HbH Constant Spring (một đột biến xóa đoạn tổn thương 2 gen thalassemia và một đột biến không xóa đoạn CS) tức là trẻ có kiểu gen 0/ CS ( SEA/ CS , THAL/ CS ) có bệnh cảnh thiếu máu tan máu nặng với biểu hiện phù nhau thai [30],[91]. Chẩn đoán Hb-H-CS trên điện di Hb thường là khó khăn do hồng cầu Hb- H-CS không ổn định, việc chẩn đoán xác định thường phải nhờ sinh học phân tử. Nếu không bị phù nhau thai chết ngay sau sinh, lâm sàng của bệnh lý này khi trẻ lớn lên cũng thường nặng nề với thiếu máu nặng, gan lách to, sỏi mật và có nhu cầu truyền máu thường xuyên [87]. Với tỷ lệ mang gen CS ở trẻ Êđê và M’nông khá cao (16%) và tỷ lệ mang đột biến 0 thalassemia là đột biến SEA (2,1%) khả năng có thể có thể bệnh HbH-CS gây phù nhau thai hoặc bệnh cảnh lâm sàng khi trẻ lớn lên nặng nề. Vì vậy việc áp dụng tư vấn hôn nhân di truyền hoặc chẩn đoán trước sinh ở cộng đồng người Êđê và M’nông đển phòng ngừa thể bệnh này là hoàn toàn cần thiết. Tổn thƣơng 3 gen thalassemia Kiểu gen - 3.7/ SEA Kiểu gen này tính chung cả hai dân tộc chiếm tỷ lệ 1% (2% ở trẻ Êđê và không gặp ở trẻ M’nông). Đứa trẻ mắc kiểu gen này do thừa hưởng một 3.7 SEA đột biến - gây xóa gen 2 và một nhiễm sắc thể mang đột biến xóa cả hai gen 1 và 2. Đây là trường hợp tổn thương xóa đoạn làm mất 3 gen thalassemia. Kiểu gen - 3.7/ SEA sẽ gây nên bệnh HbH. Như vậy tỷ lệ kiểu