Luận án Nghiên cứu hình thái và đánh giá liên tục phôi 3 và 5 ngày tuổi của bệnh nhân thụ tinh trong ống nghiệm

179 trang ngocly 80

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Nghiên cứu hình thái và đánh giá liên tục phôi 3 và 5 ngày tuổi của bệnh nhân thụ tinh trong ống nghiệm", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

luan_an_nghien_cuu_hinh_thai_va_danh_gia_lien_tuc_phoi_3_va.doc

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu hình thái và đánh giá liên tục phôi 3 và 5 ngày tuổi của bệnh nhân thụ tinh trong ống nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y DƯƠNG ĐÌNH HIẾU NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI VÀ ĐÁNH GIÁ LIÊN TỤC PHÔI 3 VÀ 5 NGÀY TUỔI CỦA BỆNH NHÂN THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2016
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y DƯƠNG ĐÌNH HIẾU NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI VÀ ĐÁNH GIÁ LIÊN TỤC PHÔI 3 VÀ 5 NGÀY TUỔI CỦA BỆNH NHÂN THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Chuyên ngành: Mô Phôi thai học Mã số: 62.72.01.03 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Hướng dẫn Khoa học: 1. GS.TS.NGUYỄN ĐÌNH TẢO 2. PGS.TS. QUẢN HOÀNG LÂM HÀ NỘI - 2016
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác. TÁC GIẢ LUẬN ÁN DƯƠNG ĐÌNH HIẾU
LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Quân y, Phòng sau đại học, Trung tâm đào tạo, nghiên cứu Công nghệ Phôi đã cho phép và tạo điều kiện cho tôi thực hiện thành công luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Nguyễn Đình Tảo, PGS.TS. Quản Hoàng Lâm, những người thầy trực tiếp, tận tâm hết lòng hướng dẫn, tạo điều kiện và cho tôi những kinh nghiệm quí báu trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn các nhà khoa học, các Thầy (Cô) trong Hội đồng chấm luận án cấp cơ sở, cấp trường đã đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thiện luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến: Tập thể cán bộ, nhân viên Trung tâm Đào tạo, nghiên cứu Công nghệ Phôi – Học viện Quân y đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thu thập số liệu và hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, những người thân và bạn bè đã động viên, hỗ trợ tôi về mọi mặt trong cuộc sống, học tập và công tác. Hà Nội, ngày 18 tháng 02 năm 2016 Dương Đình Hiếu
MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các biểu đồ, sơ đồ Danh mục các hình Danh mục các ảnh Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tình hình vô sinh trên thế giới và Việt Nam 3 1.1.1. Khái niệm về vô sinh 3 1.1.2. Tình hình vô sinh trên thế giới 3 1.1.3. Tình hình vô sinh ở Việt Nam 4 1.2. Quá trình thụ tinh và làm tổ của phôi người 4 1.2.1. Sự thụ tinh - giai đoạn hình thành hợp tử 4 1.2.2. Sự phân cắt và làm tổ của phôi 5 1.3. Nuôi cấy phôi trong điều kiện in vitro 5 1.3.1. Những hiểu biết về phát triển phôi trong môi trường in vitro 5 1.3.2. Một số quan điểm về nuôi cấy phôi trong ống nghiệm ở người 7 1.3.3. Nuôi cấy phôi kéo dài và một số giải pháp khắc phục tình trạng 8 không có phôi chuyển ngày 5
1.4. Các nghiên cứu hình thái phôi nuôi cấy giai đoạn phôi phân cắt 12 1.4.1. Mối liên quan giữa các yếu tố hình thái phôi ngày 3 và kết quả thụ tinh trong ống nghiệm 12 1.4.2. Một số phương pháp đánh giá phân loại phôi giai đoạn phân cắt 18 1.5. Hình thái phôi nuôi cấy ngày 5 và mối liên quan đến hình thái 21 phôi nuôi cấy ngày 3 1.5.1. Những nghiên cứu về hình thái phôi nuôi cấy ngày 5 21 1.5.2. Mối liên quan về hình thái của phôi nuôi cấy ngày 3 và ngày 5 27 1.6. Những nghiên cứu đánh giá phân loại phôi liên tục 29 1.7 Đồng thuận đánh giá chất lượng hình thái noãn và phôi nuôi cấy 32 trong ống nghiệm 1.7.1. Đồng thuận đánh giá chất lượng hợp tử của phôi nuôi cấy ngày 1 33 1.7.2. Đồng thuận đánh giá chất lượng phôi nuôi cấy ngày 3 34 1.7.3. Đồng thuận đánh giá chất lượng phôi túi 35 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1. Đối tượng nghiên cứu 37 2.1.1. Đối tượng 37 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu 38 2.1.3. Thời gian nghiên cứu 38 2.2. Phương pháp nghiên cứu 38 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu 38 2.2.2. Cỡ mẫu, chọn mẫu 39 2.2.3. Phương pháp, kỹ thuật 42 2.2.4. Đánh giá hình thái cấu trúc phôi 48 2.2.5. Các tỉ lệ thành công của kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm 52 2.2.6. Thu thập số liệu 53
2.2.7. Phân tích và xử lý số liệu 57 2.2.8. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 58 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 59 3.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 59 3.2. Hình thái phôi nuôi cấy ngày 3 64 3.2.1. Các đặc điểm hình thái phôi nuôi cấy ngày 3 64 3.2.2. Kích thước và chiều dày màng trong suốt của phôi nuôi cấy 70 ngày 3 3.3. Đặc điểm hình thái phôi nuôi cấy ngày 5 75 3.4. Mối tương quan đặc điểm hình thái phôi nuôi cấy ngày 3 và 81 ngày 5 3.4.1. Mối tương quan đặc điểm hình thái phôi ngày 3 đến khả năng 81 hình thành phôi túi 3.4.2. Mối tươngquan về đặc điểm hình thái phôi nuôi cấy ngày 3 và 84 chất lượng phôi túi 3.5. Bước đầu đánh giá phân loại phôi liên tục trong nuôi cấy 88 phôi ngày 3 và ngày 5 3.5.1. Bước đầu đánh giá phân loại phôi liên tục trong nuôi cấy 89 phôi ngày 3 3.5.2. Bước đầu đánh giá phân loại phôi liên tục trong nuôi cấy phôi túi 91 3.6. So sánh kết quả chuyển phôi ngày 3 và ngày 5 có áp dụng phân 95 loại phôi liên tục 3.6.1. Một số yếu tố ảnh hưởng đến kết quả 95 3.6.2. So sánh tỉ lệ phôi làm tổ, tỉ lệ có thai, đa thai ở các nhóm 96 nghiên cứu
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 100 4.1. Bàn luận về đối tượng nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu 100 4.2. Đặc điểm hình thái phôi nuôi cấy ngày 3 107 4.2.1. Về các đặc điểm hình thái phôi nuôi cấy ngày 3 107 4.2.2. Đường kính, chiều dày màng trong suốt và mối liên quan với 111 các đặc điểm hình thái của phôi nuôi cấy ngày 3 4.3. Đặc điểm hình thái phôi nuôi cấy ngày 5 113 4.4. Mối tương quan hình thái phôi nuôi cấy ngày 3 và ngày 5 117 4.4.1. Mối tương quan giữa hình thái phôi ngày 3 và khả năng hình 117 thành phôi túi 4.4.2. Mối tương quan giữa hình thái phôi ngày 3 và chất lượng phôi túi 121 4.5. Bước đầu đánh giá phân loại phôi liên tục trong nuôi cấy phôi 125 ngày 3 và ngày 5 4.6. So sánh kết quả chuyển phôi ngày 3 và ngày 5 có áp dụng 129 phân loại phôi liên tục KẾT LUẬN 137 KIẾN NGHỊ 139 HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 140 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ KẾT QUẢ CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Phần viết tắt Phần tên đầy đủ ESHRE European Society of Human Reproduction and Embryology (Hiệp hội sinh sản và phôi Châu Âu) E2 Estradiol FSH Follicle stimulating hormone (Hormon kích thích nang noãn) hCG Human chorionic gonadotropin ICM Inner Cell Mass (Khối tế bào trong phôi ) ICSI Intracytoplasmic Sperm Injection (Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn) IVF In Vitro Fertilization (Thụ tinh trong ống nghiệm) LH Luteinizing Hormone (Hormon kích thích hoàng thể) MESA Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration (Lấy tinh trùng từ mào tinh bằng vi phẫu thuật) MVBT Mảnh vỡ bào tương NPB Nucleolar Precursor Bodies (Hạt nhân trong tiền nhân) PESA Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration (Chọc hút tinh trùng từ mào tinh qua da) PLPLT Phân loại phôi liên tục PN Pronuclei (Tiền nhân) TE Trophectoderm (Lớp tế bào lá nuôi) TESE Testicular Sperm Extraction (Lấy tinh trùng từ tinh hoàn bằng phẫu thuật mổ tinh hoàn) VINAGOFPA Vietnam Gynaecology and Obstetrics Association (Hội phụ sản khoa và sinh đẻ có kế hoạch Việt nam)
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1. Các đặc tính sinh lý phát triển của phôi người trước và sau nén 6 1.2. Phân loại phôi túi theo tiêu chuẩn Gardner D. K. (1999) 22 1.3. Phân loại hợp tử theo Scott L. (2000) 33 1.4. Đồng thuận phân loại hợp tử ngày 1 của tổ chức Alpha 34 1.5. Đồng thuận đánh giá phân loại phôi ngày 2 và 3 của tổ chức 34 Alpha 1.6. Đồng thuận đánh giá chất lượng phôi túi của tổ chức Alpha 35 2.1. Thời điểm đánh giá thụ tinh và phân loại phôi từng giai đoạn 46 2.2. Phân loại hình thái phôi ngày 3 theo tiêu chuẩn đồng thuận 50 2.3. Phân loại chất lượng phôi túi 52 3.1. Tuổi và thời gian vô sinh trung bình của các nhóm bệnh 59 nhân nghiên cứu 3.2. Phân loại vô sinh nguyên phát và vô sinh thứ phát 60 3.3. Đặc điểm phân bố theo nguyên nhân vô sinh 61 3.4. So sánh kết quả xét nghiệm FSH, LH, E2 ngày 2 chu kỳ kinh 62 3.5. Đặc điểm kích thích buồng trứng 62 3.6. Các kỹ thuật thực hiện trên 3 nhóm nghiên cứu 64 3.7. Phân bố phôi theo số lượng phôi bào của phôi ngày 3 65 3.8. Phân bố theo tỉ lệ mảnh vỡ bào tương 67 3.9. Phân loại chất lượng phôi nuôi cấy ngày 3 70 3.10. Đường kính phôi và chiều dày ZP của phôi ngày 3 70 3.11. So sánh đường kính phôi và chiều dày màng trong suốt giữa 71 các nhóm nghiên cứu 3.12. So sánh kích thước phôi ở những phôi có phôi bào đồng đều 73 và không đồng đều
Bảng Tên bảng Trang 3.13. So sánh kích thước phôi ở những phôi có chất lượng khác 74 nhau theo tiêu chuẩn phân loại đồng thuận của tổ chức Alpha 3.14. Mối liên quan hình thái lá nuôi và nụ phôi 76 3.15. Phân loại chất lượng 184 phôi túi nuôi cấy ngày 5 77 3.16. Đường kính và chiều dày màng trong suốt phôi túi 77 3.17. So sánh kích thước phôi túi theo chất lượng phôi 80 3.18. Khả năng hình thành phôi túi của phôi nuôi cấy ngày 3 81 có số phôi bào khác nhau 3.19. Mối tương quan giữa tỉ lệ mảnh vỡ bào tương và khả năng 83 hình thành phôi túi 3.20. Mối tương quan giữa phân loại chất lượng phôi nuôi cấy 84 ngày 3 và khả năng hình thành phôi túi 3.21. Mối tương quan giữa số lượng phôi bào đến tốc độ phát 85 triển, chất lượng lá nuôi và nụ phôi của phôi nuôi cấy ngày 5 3.22. Khảo sát mối tương quan giữa tỉ lệ mành vỡ bào tương của 86 phôi nuôi cấy ngày 3 và các đặc điểm hình thái phôi túi 3.23. Mối tương quan giữa đặc điểm đồng đều phôi bào của phôi 87 nuôi cấy ngày 3 với đặc điểm hình thái phôi túi 3.24. Mối tương quan giữa chất lượng phôi nuôi cấy ngày 3 và 88 chất lượng phôi túi phân theo 3 loại tốt, trung bình và xấu 3.25. Phân bố 452 phôi nuôi cấy ngày 3 có đánh giá phân loại 89 phôi ngày 1 và ngày 3 3.26. Mối tương quan giữa đánh giá phân loại liên tục ngày 1, 92 ngày 3 đến chất lượng phôi túi 3.27. Đánh giá tỉ lệ thành công khi chuyển phôi túi chất lượng tốt 94 của các phôi có tiêu chuẩn phân loại phôi liên tục khác nhau
Bảng Tên bảng Trang 3.28. So sánh tỉ lệ thụ tinh, số lượng phôi chuyển và chiều dày 95 niêm mạc tử cung của 3 nhóm nghiên cứu 3.29. Tỉ lệ làm tổ của 3 nhóm nghiên cứu 96 3.30. Kết quả thai sinh hóa và thai lâm sàng giữa các nhóm 97 nghiên cứu 3.31. So sánh tỷ lệ thai sinh sống ở các nhóm nghiên cứu 97 3.32. Số túi ối, số thai sinh sống của các bệnh nhân ở 3 nhóm 98 nghiên cứu 4.1. Tổng hợp kết quả thụ tinh ống nghiệm của 3 nhóm nghiên cứu 135
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.1. Tỉ lệ phác đồ kích thích buồng trứng ở 3 nhóm nghiên cứu 63 3.2. Sự đồng đều giữa các phôi bào của 1323 phôi ngày 3 66 3.3. Sự đồng đều phôi bào của phôi ngày 3 theo từng nhóm 66 3.4. Mối tương quan giữa số lượng phôi bào của phôi nuôi cấy 72 ngày 3 với đường kính phôi và chiều dày màng trong suốt 3.5. Mối tương quan giữa tỉ lệ mành vỡ bào tương của phôi 73 ngày 3 với đường kính phôi và chiều dày màng trong suốt 3.6. Phân bố 184 phôi túi theo mức độ giãn rộng xoang túi phôi 75 3.7. Khả năng hình thành phôi túi ở phôi có phôi bào đồng đều 82 và không đồng đều 3.8. Mối liên quan phân loại phôi liên tục và khả năng hình 91 thành phôi túi DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ Tên sơ đồ Trang 1.1. Ước lượng tỉ lệ phát triển của phôi túi khi nuôi cấy kéo dài 11 2.1. Các bước tiến hành nghiên cứu 41 2.2. Thời điểm đánh giá chất lượng phôi nuôi cấy 47
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1. Mô tả tỉ lệ giữa các phôi bào đồng đều 15 1.2. Phân loại phôi phân chia bình thường theo số lượng phôi bào 16 1.3. Phân độ đối xứng và đồng đều giữa các phôi bào theo Holte J. 19 2.1. Phân loại hợp tử theo Scott L. (2000) 48 2.2. Tiêu chuẩn đánh giá độ đồng đều của phôi bào 49 2.3. Phân loại phôi theo tỉ lệ mảnh vỡ bào tương 50 DANH MỤC CÁC ẢNH Ảnh Tên ảnh Trang 2.1. Phần mềm đo đạc hình thái phôi RI-Research Instruments 54 3.1. Phôi nuôi cấy ngày 3 chất lượng tốt (Phôi có 9 phôi bào, không 68 có mảnh vỡ bào tương) 3.2. Phôi nuôi cấy ngày 3 chất lượng tốt (Phôi có 10 phôi bào, 5% 68 mảnh vỡ bào tương ) 3.3. Phôi nuôi cấy ngày 3 chất lượng trung bình (Phôi có 6 phôi bào 69 không đều, 25% mảnh vỡ bào tương) 3.4. Phôi nuôi cấy ngày 3 chất lượng xấu (Phôi có 5 phôi bào không 69 đều, 50% mảnh vỡ bào tương) 3.5. Phôi nuôi cấy ngày 5 chất lượng tốt (Phôi túi phân loại 3AA) 78 3.6. Phôi nuôi cấy ngày 5 chất lượng tốt (Phôi túi đã thoát màng phân 78 loại 4AA) 3.7. Phôi nuôi cấy ngày 5 chất trung bình (Phôi túi phân loại 3BB) 79 3.8. Phôi nuôi cấy ngày 5 chất lượng xấu (Phôi túi phân loại độ 2) 79 3.9. Phôi phân loại liên tục ngày 1 và ngày 3 90 3.10. Phôi nuôi cấy ngày 5 phân loại liên tục 93
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, tỷ lệ các cặp vợ chồng không có khả năng sinh sản trên thế giới và tại Việt nam đang có xu hướng tăng lên, rất nhiều gia đình hiếm muộn luôn khắc khoải mong chờ có một đứa con. Cùng với sự phát triển tiến bộ của khoa học, các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản ra đời góp phần giải quyết vấn đề này. Năm 1978, bé gái Louis Brown đã ra đời từ kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm tại nước Anh đánh dấu thành công quan trọng trong việc áp dụng kỹ thuật hỗ trợ sinh sản trên người. Từ đó đến nay, các kỹ thuật ngày càng được cải tiến, chuẩn hóa nhằm nâng cao hiệu quả của các phương pháp hỗ trợ sinh sản. Tuy rằng cơ sở khoa học, phương pháp kỹ thuật và trang thiết bị như nhau nhưng tỉ lệ thành công trong điều trị vô sinh còn khác nhau giữa các trung tâm, giữa các quốc gia trên thế giới. Vì vậy, tất cả các trung tâm đều tập trung đi tìm lời giải đáp cho câu hỏi: “Làm thế nào để nâng cao tỉ lệ thành công trong kỹ thuật hỗ trợ sinh sản, và giảm thiểu các tai biến?”. Để làm được điều này các trung tâm đều tiến hành song song đồng bộ nhiều giải pháp, trong đó có vấn đề là sử dụng nhiều phôi chuyển vào tử cung người mẹ để nâng cao tỉ lệ thành công. Từ đây sẽ làm nảy sinh mâu thuẫn là nguy cơ về tỉ lệ đa thai cũng tăng theo. Đa thai sẽ gây ra rất nhiều vấn đề rắc rối trong gia đình, cho người mẹ cũng như toàn xã hội. Đối với những em bé được sinh ra ở những bà mẹ có trên 1 thai có thể gặp phải các tình trạng như sinh thiếu cân, suy dinh dưỡng, bất thường về não bộ, sinh non, chậm nói, rối loạn về nhận thức, và tỉ lệ tử vong sơ sinh cũng tăng cao hơn so với nhóm các bà mẹ sinh chỉ 1 con. Đã có rất nhiều những nghiên cứu cũng như những tranh cãi trong thời gian gần đây về lựa chọn số lượng phôi chuyển, tiêu chuẩn chất lượng phôi và thời điểm chuyển phôi hợp lý, để tránh nguy cơ đa thai.
2 Tại một số quốc gia trên thế giới đã có quy định bắt buộc chỉ sử dụng không quá 2 phôi và hướng đến chỉ chuyển 1 phôi vào tử cung người mẹ. Để làm được điều này đòi hỏi mỗi trung tâm nhận thức rõ vai trò và sự cần thiết phải xây dựng một quy trình nuôi cấy và lựa chọn phôi mang tính liên tục từ giai đoạn hợp tử đến khi phôi được chuyển vào tử cung người mẹ dựa trên các thông số hình thái quan trọng đặc trưng cho từng giai đoạn phát triển của phôi. Trên thế giới cũng đã có những công trình nghiên cứu xây dựng quy trình tiêu chuẩn chặt chẽ mục đích lựa chọn từ 1 đến 2 phôi có tiềm năng nhất sử dụng cho chuyển phôi. Tại Việt nam cũng đã có những nghiên cứu công bố về các đặc điểm hình thái phôi người nuôi cấy trong ống nghiệm ngày 1, 2 và 3, nhưng chưa có công trình nghiên cứu hình thái phôi ngày 5 (giai đoạn blastocyst) một cách đầy đủ và hệ thống. Hơn nữa, chưa có nghiên cứu nào xác định mối liên quan về mặt hình thái giữa phôi nuôi cấy ngày 3 và phôi ngày 5, để làm cơ sở xây dựng hệ thống đánh giá lựa chọn phôi có tính liên tục cho phép lựa chọn được những phôi tiềm năng nhất nhằm nâng cao tỉ lệ thành công và giảm nguy cơ đa thai. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hình thái và đánh giá liên tục phôi 3 và 5 ngày tuổi của bệnh nhân thụ tinh trong ống nghiệm” Với mục tiêu của đề tài: - Xác định đặc điểm hình thái phôi nuôi cấy ngày 3 và phôi nuôi cấy ngày 5 trong ống nghiệm. - Đánh giá mối liên quan về đặc điểm hình thái của phôi nuôi cấy ngày 3 với ngày 5 và bước đầu đánh giá kết quả áp dụng phân loại phôi liên tục trong nuôi cấy phôi ngày 3 và ngày 5.
3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình vô sinh trên thế giới và Việt nam 1.1.1. Khái niệm về vô sinh Theo định nghĩa của Tổ chức y tế thế giới năm 2000, vô sinh được hiểu là tình trạng một cặp vợ chồng không có thai sau một năm chung sống, giao hợp bình thường, không sử dụng các biện pháp tránh thai nào. Trong trường hợp tuổi của người vợ trên 35 thì khoảng thời gian này chỉ 6 tháng đã được đánh giá là vô sinh [4], [109]. Vô sinh nguyên phát, còn được gọi là vô sinh loại I: là tình trạng vô sinh ở những cặp vợ chồng mà người vợ chưa có thai lần nào. Vô sinh thứ phát, còn được gọi là vô sinh loại II: là tình trạng vô sinh ở những cặp vợ chồng mà người vợ đã từng có thai trước đó (ít nhất 1 lần). Vô sinh nữ là các trường hợp vô sinh nguyên nhân do người vợ. Vô sinh nam là các trường hợp vô sinh nguyên nhândo người chồng. Những trường hợp vô sinh không rõ căn nguyên là khi không tìm thấy các nguyên nhân gây vô sinh ở cả 2 vợ chồng. Ngoài ra còn có nguyên nhân vô sinh do cả 2 vợ chồng [4]. 1.1.2. Tình hình vô sinh trên thế giới Theo số liệu mới công bố năm 2012, đánh giá khảo sát trên 277 nghiên cứu được thực hiện rất quy mô để điều tra về tình hình vô sinh của các vùng quốc gia và lãnh thổ trên thế giới, cho thấy kết quả chung về tỉ lệ vô sinh dao động trong phạm vi từ 9,1% đến 13,1% [67]. Năm 2010, tỉ lệ vô sinh nguyên phát ở nữ giới độ tuổi từ 20- 44 là khoảng 1,9%. Tỉ lệ này dao động trong phạm vi từ 1,7% đến 2,2% tùy thuộc từng quốc gia lãnh thổ. Tỉ lệ 10,5% cũng là tỉ lệ vô sinh trung bình đối với nhóm vô sinh thứ phát ở độ tuổi này. Trong đó phạm vi dao động đối với tỉ lệ vô sinh thứ phát từ 9,5% đến 11,7%. Đặc biệt, không nhận thấy sự khác biệt về tỉ lệ vô sinh trung bình cả vô sinh nguyên phát và vô sinh thứ phát khi so sánh số liệu giữa kết quả tổng
4 hợp điều tra của năm 2010 và năm 1990. Như vậy có thể nói đây là kết quả phản ánh khá trung thực về thực trạng tình hình vô sinh trên thế giới. Khi so sánh tỉ lệ vô sinh theo nhóm tuổi cho thấy, tỉ lệ vô sinh nguyên phát ở nhóm dưới 25 tuổi, nhóm từ 25 đến 29 tuổi, và nhóm từ 30 đến 44 tuổi lần lượt là: 2,7%; 2,0% và 1,6%. Và tỉ lệ vô sinh thứ phát là 2,6% ở nhóm từ 20 đến 24 tuổi và 27,1% ở nhóm từ 40 - 44 tuổi [67]. 1.1.3. Tình hình vô sinh ở Việt nam Mặc dù ngành hỗ trợ sinh sản tại Việt nam ra đời sau so với thế giới, nhưng tính đến nay trên cả nước đã có trên 20 cơ sở hỗ trợ sinh sản thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm. Theo số liệu khảo sát mới đây của tác giả Nguyễn Viết Tiến công bố năm 2010, tỉ lệ vô sinh trung bình trên toàn quốc là khoảng 7,7% [6]. Trong đó tỉ lệ vô sinh nguyên phát là 3,9%, và vô sinh thứ phát là 3,8%. Như vậy, tỉ lệ vô sinh ở Việt nam theo như nghiên cứu dịch tễ mới đây là thấp hơn so với tỉ lệ vô sinh chung của thế giới. Tuy nhiên tỉ lệ vô sinh nguyên phát tại Việt nam lại cao hơn, điều này có thể giải thích là do xu thế và tỉ lệ phụ nữ Việt nam mong muốn có con sớm hơn so với mặt bằng chung của thế giới, đặc biệt là những nước phát triển. Xét về đặc điểm phân bố của nguyên nhân dẫn đến vô sinh cũng có nhiều nghiên cứu được các tác giả đưa ra những kết quả khác nhau. Theo nghiên cứu của Trần Thị Trung Chiến và cs, thì nguyên nhân gây vô sinh nam chiếm khoảng 40,8% trong số các trường hợp vô sinh. Trong nghiên cứu được thực hiện tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương tiến hành trên 1000 trường hợp vô sinh có đầy đủ các xét nghiệm thăm dò chẩn đoán cho kết quả tỉ lệ vô sinh nữ chiếm khoảng 54%, vô sinh nam chiếm 36%, vô sinh do cả nam và nữ chiếm 10%, còn lại 10% là vô sinh không rõ nguyên nhân [3], [4]. 1.2. Quá trình thụ tinh và làm tổ của phôi người 1.2.1. Sự thụ tinh - giai đoạn hình thành hợp tử Khái niệm: Sự thụ tinh là sự kết hợp giữa tinh trùng với noãn tạo thành hợp tử có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội đặc trưng của loài.
5 Kết quả của quá trình thụ tinh làm phục hồi lại bộ nhiễm sắc thể đặc trưng của loài, duy trì sự ổn định về nhiễm sắc thể của quần thể loài, quyết định giới tính cho cá thể phôi và khởi động quá trình phân cắt và phát triển phôi. Ở người quá trình này diễn ra ở vị trí 1/3 ngoài của vòi trứng [1], [2]. Xét về khía cạnh sinh học, sự thụ tinh liên quan đến 4 bước tuần tự: - Sự lựa chọn tinh trùng sẽ tham gia quá trình thụ tinh. - Sự xâm nhập của tế bào tinh trùng qua các lớp vỏ của noãn. - Sự gắn kết giữa tế bào tinh trùng và màng bào tương của noãn, đây là quá trình hòa hợp bào tương xảy ra giữa 2 giao tử. - Sự hòa hợp nhân dẫn đến việc hình thành bộ gen của phôi. 1.2.2. Sự phân cắt và làm tổ của phôi Ở loài người, vào khoảng giờ thứ 30 sau khi hình thành hợp tử, phôi bước vào phân cắt lần đầu để sinh ra 2 phôi bào, tiếp theo là 4 rồi 8 phôi bào, dần dần hình thành phôi dâu. Phôi lúc này còn được màng trong suốt bao bọc, các phôi bào nhỏ dần sau mỗi lần phân cắt. Giữa các phôi bào trong phôi dâu bắt đầu xảy ra quá trình tiết dịch và hấp thụ dịch vào trong lòng nó. Khi trong phôi dâu xuất hiện 1 khoang duy nhất chứa dịch thì phôi dâu biến thành phôi nang, hay phôi túi (blastocyst). Quá trình phân cắt phôi để hình thành phôi dâu, rồi phôi túi xảy ra ở vòi trứng trong vòng từ 5-7 ngày sau khi thụ tinh. Khi phôi túi được tạo thành, khối tế bào bên trong gọi là nụ phôi, sẽ phát triển thành thai sau này. Khối tế bào bên ngoài được gọi là lá nuôi, sẽ phát triển thành các phần phụ của thai. Cực có mầm phôi được gọi là cực phôi, cực kia gọi là cực đối phôi. Lá nuôi hợp bào ở phía cực phôi bám vào niêm mạc tử cung mẹ, từ đó lõm sâu vào bên trong và tự vùi mình vào trong lớp niêm mạc tử cung người mẹ [1], [2], [5]. 1.3. Nuôi cấy phôi trong điều kiện in vitro 1.3.1. Những hiểu biết về phát triển của phôi trong môi trường in vitro Từ chỗ chỉ có một tế bào sau khi thụ tinh chỉ trong vòng vài chục giờ phôi đã biến đổi thành phôi có 2, rồi đến 4 và 8 tế bào, rồi hình thành phôi dâu, sau đó các phôi bào nén chặt (còn gọi là giai đoạn phôi nén), và giai đoạn
6 phôi túi. Quá trình này gồm 2 giai đoạn: giai đoạn phôi trước và sau nén (pre- compaction và post-compaction). Ở giai đoạn hợp tử phôi chủ yếu sử dụng pyruvate, lactate và các loại acid amin cần thiết. Mặc dù, ở giai đoạn này phôi tiêu thụ glucose chỉ với một lượng rất nhỏ nhưng lại có vai trò rất quan trọng cho quá trình phát triển của phôi ở giai đoạn sau. Do vậy, trong các hệ thống môi trường nuôi cấy phôi, ở giai đoạn trước nén, vẫn cần phải có glucose với nồng độ thấp. Về sau, khi phôi bắt đầu nén và tạo hang, hoạt động sinh tổng hợp sẽ gia tăng đòi hỏi nhu cầu glucose cao hơn, khi đó glucose sẽ trở thành chất dinh dưỡng chủ yếu cho phôi ở giai đoạn sau, giai đoạn hình thành phôi túi [59]. Bảng 1.1. Các đặc tính sinh lý phát triển của phôi người trước và sau nén Trước giai đoạn nén Sau giai đoạn nén (Pre-compaction) (Post - compaction) Hoạt động sinh tổng hợp của phôi rất Hoạt động sinh tổng hợp diễn ra thấp mạnh Cần nuôi cấy trong điều kiện O2 Cần nuôi cấy trong điều kiện O2 nồng độ thấp nồng độ bình thường Chất dinh dưỡng chủ yếu là đường Chất dinh dưỡng chủ yếu là đường pyruvate glucose Chất kích thích là acid amin cần thiết Chất kích thích là cả 2 loại acid amin Chỉ cần hoạt hóa các gen thực hiện chức năng sống của phôi, kiểu gen Cần hoạt hóa các gen cần cho sự biệt quy định của mẹ hóa của phôi. Kiểu gen của phôi. Phát triển thành các tế bào đơn lẻ Hình thành các tế bào chuyên biệt, Chỉ có 1 dạng tế bào khác nhau Có 2 dạng tế bào: tế bào lá nuôi và tế không nhiều về kích thước bào nụ phôi *Nguồn: Theo Lane M. và Gardner D. K. (2007) [59] Ở giai đoạn phôi túi, phôi sẽ chuyển hóa glucose bằng cả 2 con đường ái khí và yếm khí. Trong đó con đường chuyển hóa yếm khí chiếm từ 30-50%
7 với sản phẩm tạo ra chủ yếu là lactate. Ở loài người, noãn sau khi thụ tinh tại vị trí 1/3 phía ngoài của vòi trứng, sẽ tiếp tục phân chia và phát triển từ giai đoạn trước nén sang giai đoạn sau nén, đồng thời phôi di chuyển vào trong lòng tử cung để làm tổ trong niêm mạc tử cung. Trong giai đoạn này phôi chịu ảnh hưởng của chất dịch tiết ra tại vòi trứng với nồng độ glucose thấp và nồng độ pyruvate và lactate cao. Ngược lại, khi phôi phát triển đến giai đoạn phôi túi (sau nén), phôi đã lọt vào trong buồng tử cung. Môi trường dịch tiết trong buồng tử cung lại có nồng độ glucose cao và pyruvate thấp hơn [9], [36]. 1.3.2. Một số quan điểm về nuôi cấy phôi trong ống nghiệm ở người 1.3.2.1. Phác đồ nuôi cấy phôi Theo Biggers J. D. và Summers M. C. (2008) tại các trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm trên thế giới phổ biến sử dụng 3 loại phác đồ nuôi cấy phôi, mỗi loại có ưu nhược điểm riêng: - Phác đồ 1: chỉ sử dụng 1 loại môi trường và không thay đổi môi trường trong suốt giai đoạn nuôi cấy. - Phác đồ 2: sử dụng cùng một loại môi trường nhưng được thay mới hàng ngày hoặc sau 48 giờ. - Phác đồ 3: sử dụng 2 loại môi trường khác nhau, dành riêng cho nuôi cấy phôi giai đoạn trước và sau nén, môi trường được thay mới hàng ngày. Trong đó, đa phần sử dụng phác đồ thứ 3 vì nó hợp với sinh lý phát triển của phôi. Mặt khác, việc thay môi trường hàng ngày cho phép đánh giá chất lượng của từng phôi riêng biệt một cách có hệ thống [18]. 1.3.2.2. Lựa chọn cấy hở hay nuôi cấy có phủ dầu Những nghiên cứu thực chứng gần đây ủng hộ quan điểm nuôi cấy phôi trong những thể tích nhỏ hợp với sinh lý phát triển của phôi hơn. Vì trong điều kiện in vivo, phôi phát triển trong lòng vòi trứng và tử cung, tiếp xúc trực tiếp với môi trường dịch tiết với thể tích rất nhỏ. Năm 2010, Van Voorhis B. và cs đã nhận thấy khi nuôi cấy phôi với thể tích nhỏ xuất hiện một vấn đề là khả
8 năng ổn định của giọt môi trường nuôi cấy thấp hơn, do vậy phải xem xét việc phủ dầu cho hệ thống nuôi cấy. Một lý do nữa ủng hộ cho việc nuôi cấy phôi trong giọt môi trường có thể tích nhỏ sẽ có lợi vì sử dụng những yếu tố tự tiết của phôi. Trong điều kiện nuôi cấy phôi trong ống nghiệm, nhất là trước đây thực hiện nuôi cấy hở, phôi được nuôi cấy trong những giếng môi trường với thể tích từ 0,8 đến 1ml. Điều này làm pha loãng các yếu tố tự tiết của phôi, làm giảm sự điều hòa tăng trưởng và giảm khả năng sống sót của phôi [104]. Năm 2007, Lane M. và Gardner D. K. đã nhận thấy khi nuôi phôi đến giai đoạn phôi túi trong những giọt môi trường có thể tích 20μl có phủ dầu thì tốc độ phân chia và sự hình thành phôi túi tăng lên đáng kể. Ngoài ra, việc giảm thể tích nuôi cấy còn cho phép phôi gia tăng khả năng sống sót nhờ gia tăng số lượng tế bào nụ phôi [59]. 1.3.2.3. Nuôi cấy từng phôi và nuôi cấy theo nhóm Việc nuôi cấy theo nhóm hay nuôi cấy đơn từng phôi riêng lẻ vẫn còn chưa được thống nhất, việc lựa chọn nuôi cấy theo nhóm hay đơn lẻ tùy thuộc vào điều kiện thực tế, mục đích nghiên cứu, cũng như kinh nghiệm của từng labô. Lợi điểm chính của việc nuôi cấy phôi đơn là khả năng có thể đánh giá được chất lượng của từng phôi cả quá trình từ khi còn là noãn đến khi hình thành phôi và chuyển phôi. Điều này thích hợp cho nghiên cứu với mục đích lựa chọn phôi liên tục để lựa chọn được những phôi tiềm năng nhất. Tuy nhiên một số tác giả cho rằng việc nghiên cứu phôi theo nhóm mang lại kết quả tốt hơn [31], [99]. 1.3.3. Nuôi cấy phôi kéo dài và một số giải pháp khắc phục tình trạng không có phôi chuyển ngày 5 Trong thực tế không phải tất cả noãn và tinh trùng sau khi “gặp nhau” và thụ tinh đều hình thành các phôi có khả năng sống sót và phát triển như nhau. Khi nuôi cấy phôi kéo dài vượt qua giai đoạn phôi phân cắt đến giai đoạn phôi túi cũng là một cách chọn lọc tự nhiên đối với phôi nuôi cấy trong
9 ống nghiệm, vì lúc đó phôi chỉ tiếp tục phát triển sau khi đã hoạt hóa kiểu gen của riêng mình. Bên cạnh đó,có nhiều nghiên cứu quan tâm đến vấn đề sự “đồng bộ” của niêm mạc tử cung người mẹ với phôi diễn ra vào thời điểm ngày thứ 5 sau khi chọc hút noãn [9]. Một lý do nữa ủng hộ cho việc nuôi cấy phôi kéo dài là do sử dụng thuốc kích thích buồng trứng trong thụ tinh ống nghiệm. Khi sử dụng các thuốc có nguồn gốc là các hormon gonadotropin để kích thích buồng trứng sẽ làm cho lớp niêm mạc tử cung không sẵn sàng cho quá trình làm tổ của phôi. Vậy phải làm giảm thời gian "chờ đợi" của phôi kể từ sau khi chuyển phôi đến khi phôi làm tổ. Giải pháp ở đây là lựa chọn tiếp tục kéo dài nuôi phôi và chuyển phôi giai đoạn phôi túi. Ngoài ra, chuyển phôi giai đoạn phôi túi có thể giảm hiện tượng phôi bị trục xuất do các cơn co tử cung. Khoảng thời gian nuôi cấy kéo dài sẽ làm giảm số lượng cơn co tử cung kể từ thời điểm tiêm hCG, điều này giúp cho phôi tránh khỏi bị trục xuất ra ngoài và làm tăng khả năng làm tổ. Tuy nhiên, khi nuôi cấy phôi kéo dài có nguy cơ sẽ không có phôi phát triển đến giai đoạn phôi túi và bệnh nhân sẽ không có phôi để chuyển. Một trong những nguyên nhân là sự thay đổi về vai trò hoạt hóa kiểu gen của phôi người ở giai đoạn sau nén. Sự phát triển của phôi nuôi cấy giai đoạn trước nén chủ yếu do các vật liệu đã được noãn chuẩn bị từ trước và hoàn toàn phụ thuộc vào chất lượng của noãn. Trong khi sự phát triển của phôi đến giai đoạn phôi túi lại cần có "động lực" từ sự hoạt hóa kiểu gen của phôi, phụ thuộc vào chất lượng của hợp tử. Hay nói theo một cách khác thì sự phát triển của phôi nuôi cấy ngày 5 phụ thuộc cả chất lượng của noãn và tinh trùng (của cả cha và mẹ). Năm 2000, Racowsky C. và cs khi nghiên cứu 221 chu kỳ chuyển phôi nuôi cấy ngày 3 và 141 chu kỳ chuyển phôi nuôi cấy ngày 5 đã nhận thấy có mối tương quan giữa số lượng phôi bào và khả năng phát triển đến
10 giai đoạn phôi túi. Trong đó những trường hợp có trên 2 phôi có 7 đến 8 phôi bào của phôi nuôi cấy ngày 3 thì nên tiếp tục nuôi cấy kéo dài và chuyển phôi ngày 5. Nếu không có phôi nào đạt tới 7 phôi bào khi nuôi cấy ngày 3 thì nên chuyển phôi ngày 3, không nên nuôi cấy kéo dài đến ngày 5 vì khả năng không có phôi chuyển là rất cao. Đối với trường hợp chỉ có 1 đến 2 phôi có 7 hoặc 8 phôi bào thì nên cân nhắc thêm các yếu tố khác về mặt hình thái như sự đồng đều phôi bào và tỉ lệ mảnh vỡ bào tương để kết luận có tiếp tục nuôi cấy kéo dài hay không [80]. Năm 2004, Levitas E. và cs đã tiến hành đánh giá trên 54 bệnh nhân nuôi cấy phôi đến giai đoạn phôi túi và nhận thấy ở nhóm không có hoặc chỉ có 1 phôi có 8 phôi bào khi nuôi cấy ngày 3 thìxác suất có phôi túi là 50% và 77% trên tổng số chu kỳ nuôi cấy. Trong khi với những bệnh nhân có ít nhất 2 phôi 8 phôi bào thì 100% sẽ có phôi túi để chuyển phôi khi tiếp tục nuôi cấy đến ngày 5. Vì vậy, khuyến cáo các trường hợp chuyển phôi có tối thiểu 2 phôi 7-8 phôi bào khi nuôi cấy ngày 3 nên tiếp tục nuôi phôi kéo dài và chuyển phôi nuôi cấy ngày 5 [63]. Năm 2007, Nomura M. và cs đã một lần nữa khẳng định vai trò quan trọng về số lượng phôi bào của phôi nuôi cấy ngày 3 ảnh hưởng đến khả năng tiên lượng tỉ lệ phát triển của phôi đến giai đoạn phôi túi. Khả năng của phôi có 7-8 phôi bào (khi nuôi cấy ngày 3) tiếp tục phát triển đến giai đoạn phôi túi là trên 70%. Trong khi khả năng này ở nhóm phôi nuôi cấy ngày 3 có dưới 7 phôi bào chỉ đạt dưới 40% [75]. Năm 2010, tác giả Dessole L. và cs đã cụ thể hóa việc tiên lượng khả năng có phôi nuôi cấy ngày 5 đối với từng chu kỳ, trên từng bệnh nhân cụ thể bằng cách lượng hóa cho điểm dựa trên các yếu tố: số lượng phôi nuôi cấy ngày 3; tỉ lệ giữa số lượng phôi tốt trên tổng số phôi nuôi cấy; kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm; và tuổi người mẹ. Tác giả đã lượng hóa cho điểm theo 4 yếu tố sau đó tính tổng điểm và đối chiếu để tiên lượng tỉ lệ phát triển của phôi đến giai đoạn phôi túi theo tỉ
11 lệ phần trăm. Ví dụ, ở sơ đồ 1.1, mô tả cách tính điểm của một bệnh nhân 34 tuổi tiến hành kỹ thuật ICSI kết quả có 8 phôi ngày 3 trong đó có 4 phôi có 7- 8 phôi bào (chiếm tỉ lệ 50%) . Sơ đồ 1.1. Ước lượng tỉ lệ phát triển phôi túi khi nuôi cấy kéo dài *Nguồn: Theo Dessolle L. và cs (2010) [29] Đối chiếu 4 chỉ tiêu trên sơ đồ 1.1 (theo 4 mũi tên xanh) ta có: - Có 8 phôi ngày 3 tương đương: 40 điểm - Tỉ lệ phôi tốt/Tổng số phôi là: 4/8 = 0,5 tương đương: 25 điểm - Kỹ thuật ICSI tương đương: 0 điểm - Bệnh nhân 34 tuổi tương đương: 14 điểm Tổng điểm: 40đ + 25đ + 0đ + 14đ = 79 điểm Khi đối chiếu số điểm 79 từ thang "Tổng điểm theo 4 yếu tố" sang thang điểm "Tỉ lệ hình thành phôi túi" trên sơ đồ 1.1 (mũi tên đỏ), sẽ cho ta kết quả là tỉ lệ hình thành phôi túi. Với ví dụ này, nếu 8 phôi ngày 3 của bệnh nhân tiếp tục nuôi cấy sang ngày 5, sẽ có khoảng 60% số phôi đạt đến giai đoạn phôi túi [29].
12 1.4. Các nghiên cứu hình thái phôi nuôi cấy giai đoạn phôi phân cắt 1.4.1. Mối liên quan giữa các yếu tố hình thái phôi ngày 3 và kết quả thụ tinh trong ống nghiệm Ở hầu hết các cơ sở thực hiện kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm trên thế giới, phổ biến hiện nay vẫn áp dụng việc đánh giá lựa chọn phôi dựa trên các tiêu chuẩn hình thái của phôi. Có rất nhiều tiêu chuẩn đánh giá phân loại hoặc cho điểm phôi nuôi cấy ngày 2 và ngày 3 theo các đặc điểm hình thái đặc trưng của phôi ở giai đoạn này. Tiêu biểu có các công trình của các tác giả như Alikani M. và cs (2000); Ebner T. và cs (2003), Baczkowski T. và cs (2004); Rienzi L. và cs (2005); Holte J. và cs (2007). Nhìn chung việc phân loại chất lượng phôi dựa hoàn toàn trên các đặc điểm: (1) Số lượng phôi bào của phôi nuôi cấy (2) Mức độ hay tỉ lệ mảnh vỡ bào tương so với thể tích phôi (3) Sự đồng đều về mặt kích thước và cân đối của các phôi bào (4) Có hay không phôi bào đa nhân Từ đây, tùy theo các tác giả khác nhau sẽ đưa ra các thang điểm hay hệ thống phân loại phôi khác nhau [13], [15], [30], [49], [85]. Phôi ở giai đoạn phân cắt bắt đầu được tính từ khi phôi phân chia lần đầu tiên, phôi có 2 phôi bào, đến hết giai đoạn phôi dâu. Khoảng thời gian này kéo dài từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 4 khi tiếp tục nuôi cấy phôi trong ống nghiệm. Cùng với sự phát triển của những thiết bị nuôi cấy hiện đại, khi nuôi cấy phôi với hệ thống time-lapse cho thấy không chỉ thời điểm phôi bắt đầu phân chia là quan trọng mà còn cả khoảng thời gian giữa những lần phân cắt tiếp theo cũng giữ vai trò vô cùng quan trọng. Nếu những phôi bào được phân chia đồng thời thì chỉ có thể có phôi với 2, 4 hoặc 8 phôi bào. Trên thực tế, ta có thể gặp những phôi có 3, 5, 6, 7 hoặc là 9 phôi bào. Điều này chứng minh cho quy luật về sự phân chia không đồng thời của các phôi bào [62], [89], [105].
13 Bên cạnh đó, khi phôi bào phân chia sẽ xuất hiện những phần bào tương có màng bao bọc và không có nhân (gọi là mảnh vỡ bào tương). Các tác giả, Ebner T. và cs (2001); Munne S. (2006) nhận thấy kích thước và sự phân bố của những mảnh vỡ bào tương có thể rất khác nhau và cho phép gián tiếp đánh giá tiên lượng khả năng làm tổ của phôi cũng như đánh giá sự bất thường về nhiễm sắc thể [32], [71]. Nếu số lượng các mảnh vỡ bào tương không vượt quá 10% thể tích của toàn bộ phôi sẽ không ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi. Đây cũng chính là căn cứ để đánh giá phôi có chất lượng tốt theo tiêu chí mảnh vỡ bào tương (Van Royen E. và cs, 2001; Holte J. và cs, 2007) [49], [102]. Ngoài ra cũng có những nghiên cứu quan tâm đến nhân của phôi bào quan sát trên kính hiển vi soi nổi, được coi như một yếu tố quan trọng đánh giá chất lượng phôi. Bình thường, mỗi phôi bào chỉ có duy nhất một nhân. Những nhận định của Hardarson T. và cs (2001); Van Royen E. và cs (2003); Moriwaki T. và cs (2004); hay của Meriano J. và cs (2004), đều thống nhất kết luận về tình trạng đa nhân trong phôi bào là biểu hiện sai lệch trong quá trình phân bào và hậu quả là tạo ra những phôi bào bị lệch bội. Thời điểm tốt nhất để đánh giá tình trạng phôi bào đa nhân là thời điểm phôi nuôi cấy ngày 2 vì ở giai đoạn này kích thước phôi bào lớn hơn và nên khả năng quan sát cũng dễ hơn [43], [68], [70],[103]. 1.4.1.1. Đánh giá về số lượng phôi bào của phôi giai đoạn phân chia Số lượng phôi bào là một tiêu chí dự báo vô cùng cần thiết cho phép đánh giá kết quả phôi làm tổ và tỉ lệ có thai của một chu kỳ thụ tinh trong ống nghiệm. Thậm chí có thể nói đây là chỉ tiêu về mặt hình thái quan trọng nhất trong việc xem xét đánh giá phân loại chất lượng phôi giai đoạn phân chia. Một số nghiên cứu đánh giá có mối liên hệ chặt chẽ giữa kết quả phôi làm tổ, tỉ lệ thai sinh sống với số lượng phôi bào của phôi chuyển ngày 3. Năm 2006, Hourvitz A. và cs, nhận thấy số lượng phôi bào của phôi chuyển ở
14 giai đoạn phôi phân cắt có liên quan đến việc tiên lượng tỉ lệ sảy thai. Khi so sánh 2 nhóm: nhóm 1 chuyển phôi nuôi cấy ngày 3 có số lượng phôi bào ≤ 5 so với nhóm 2 chuyển phôi nuôi cấy ngày 3 có số lượng phôi bào ≥ 6. Kết quả tỉ lệ sảy thai ở nhóm 1 là 44,9 % so với 30,7% ở nhóm 2 [51]. Năm 2010, Finn A. và cs tiến hành nghiên cứu trên 298 bệnh nhân chuyển phôi ngày 3. Kết quả cho thấy có sự khác biệt rõ rệt về tỉ lệ có thai ở nhóm sử dụng phôi có ít nhất 6 phôi bào so với nhóm sử dụng phôi có ít hơn 6 phôi bào để chuyển phôi ngày 3 [33]. Năm 2011, Racowsky C. và cs kết luận có mối tương quan thuận giữa tỉ lệ thai sinh sống và số lượng phôi bào của phôi ngày 3 sử dụng để chuyển phôi. Cụ thể, tỉ lệ thai sinh sống lần lượt ở các nhóm khi chuyển phôi có: 25% thể tích phôi
15 Người ta cũng thường dựa vào mốc tỉ lệ này để đánh giá chất lượng phôi theo 3 loại: phôi tốt (MVBT 25%) [14]. Năm 2003, Hardy K. và cs nhận thấy sự gia tăng tỉ lệ MVBT khi nuôi cấy phôi kéo dài làm ảnh hưởng xấu đến tỉ lệ hình thành phôi túi ở phôi nuôi cấy ngày 5 [45]. Thêm vào đó, cách thức phân bố của các MVBT cũng được xem xét và thường được chia thành 2 kiểu: (1) các mảnh vỡ phân tán khắp khối phôi (2) các mảnh vỡ nằm tập trung Trong nghiên cứu của Magli M. C. và cs (2007), nhận thấy đối với phôi có kiểu MVBT phân tán thường liên quan đến tỉ lệ bất thường nhiễm sắc thể rất cao [65]. 1.4.1.3. Sự đồng đều của phôi bào Các tác giả như Hardarson T. và cs (2001); Holte J. và cs (2007), đánh giá sự “đồng đều” về mặt kích thước phôi bào của phôi giai đoạn phân chia có vai trò quan trọng làm tăng tỉ lệ thành công của một chu kỳ thụ tinh trong ống nghiệm [43], [49]. Hình 1.1. Mô tả tỉ lệ giữa các phôi bào đồng đều * Nguồn: Theo Prados F. J. và cs (2012) [76]
16 Năm 2012, Prados F.J. và cs đã đưa ra tiêu chí để đánh giá về sự đồng đều của các phôi bào. Theo đó nếu các phôi bào có mức độ chênh lệch nhau về mặt đường kính không vượt quá 20% đường kính của phôi bào lớn hơn được coi là đồng đều về kích thước (Hình 1.1). Khi phôi phân chia không đồng đều dẫn đến hậu quả là một phôi bào hình thành không có đầy đủ phần bào tương cần thiết cho nên sẽ thiếu hụt một số thành phần như các protein và ARN thông tin có trong bào tương của phôi bào. Điều này đồng nghĩa với việc các phôi có các phôi bào chênh lệch nhau về mặt kích thước quá lớn sẽ dẫn đến hậu quả làm tăng tỉ lệ phôi bào đa nhân hoặc có bất thường về nhiễm sắc thể. 3 phôi bào 4 phôi bào 5 phôi bào 6 phôi bào 7 phôi bào 8 phôi bào Hình 1.2. Phân loại phôi phân chia bình thường theo số lượng phôi bào Hình thái phôi bình thường tương ứng với số lượng phôi bào có màu xanh đậm. Những phôi có phôi bào sắp xếp không đồng đều có màu vàng. * Nguồn: Theo Prados F. J. và cs (2012) [76] Sự “đồng đều” giữa các phôi bào còn cần phải gắn với từng giai đoạn phân chia hay số phôi bào cụ thể. Ở những phôi quá trình phân bào diễn ra trọn vẹn, như ở phôi có 2, 4 và 8 phôi bào thì các phôi bào bình thường phải có kích thước tương đồng với nhau. Còn ở những phôi không phân chia trọn
17 vẹn, như phôi có 3, 5, 6, 7, 9 hay 10 phôi bào thì việc xem xét sự “ đồng đều” về mặt kích thước phôi bào cần phải thận trọng để xác định đâu là phôi phân chia bình thường và đâu là phôi phân chia bất thường. Trong hình 1.2 mô tả những phôi bào phân chia bình thường có màu xanh đậm. Như vậy 1 phôi có 5 phôi bào phân chia bình thường phải gồm 2 phôi bào nhỏ và 3 phôi bào lớn hơn. Lý do là vì có 1 phôi bào (ở giai đoạn phôi có 4 phôi bào) đã phân chia trước. Kết quả là có 2 phôi bào nhỏ và 3 phôi bào lớn tạo thành phôi có 5 phôi bào. Tương tự, phôi có 6 phôi bào phân chia bình thường phải gồm: 4 phôi bào nhỏ và 2 phôi bào lớn. Phôi có 7 phôi bào phân chia bình thường có 6 phôi bào nhỏ và 1 phôi bào lớn. Khi phôi bào lớn này phân chia sẽ tạo ra phôi có 8 phôi bào đồng đều nhau [76]. 1.4.1.4. Các nghiên cứu đánh giá về đặc điểm nhân của phôi bào Năm 2003, Van Royen E. và cs nghiên cứu 10.388 phôi giai đoạn phân chia đã nhận thấy tình trạng đa nhân của phôi bào liên quan đến bất thường phân bào, tăng tỉ lệ mảnh vỡ bào tương, làm giảm tỉ lệ phôi làm tổ, giảm tỉ lệ thai diễn tiến. Phôi giai đoạn phân chia được xác định là có phôi bào đa nhân khi quan sát thấy có ít nhất một phôi bào có trên một nhân. Tác giả cũng nhận định có khó khăn khi đánh giá tình trạng đa nhân của phôi nuôi cấy ngày 3 vì lý do có các phôi bào có kích thước nhỏ hơn và số lượng phôi bào cũng nhiều hơn so với phôi nuôi cấy ngày 2. Do đó tỉ lệ quan sát thấy phôi bào đa nhân của ngày 3 cũng giảm thấp hơn so với quan sát ở nhóm phôi bào ngày 2 [103]. Các nghiên cứu của Van Royen J và cs (2003); Moriwaki T. và cs (2004) cho thấy khả năng làm tổ của phôi có phôi bào đa nhân giảm thấp và giảm tỉ lệ có thai [70], [103]. Những nghiên cứu của Hardarson T. và cs (2001); Agerholm I. E. và cs (2008), đều cho kết quả là tỉ lệ bất thường nhiễm sắc thể rất cao đối với phôi có phôi bào đa nhân khi đánh giá ở thời điểm nuôi cấy giai đoạn phôi phân chia [11], [43]. Công trình nghiên cứu của Ziebe S. và cs (2003); Scott L. và cs (2007), nhận thấy việc sử dụng phôi có chứa phôi
18 bào đa nhân để chuyển phôi còn làm tăng nguy cơ sảy thai, và giảm tỉ lệ có thai diễn tiến [89], [110]. 1.4.2. Một số phương pháp đánh giá phân loại phôi giai đoạn phân cắt Chủ yếu các phương pháp đánh giá phân loại chất lượng phôi giai đoạn phôi phân chia đều dựa vào hình thái: số lượng phôi bào, độ đồng đều của các phôi bào, và tỉ lệ mảnh vỡ bào tương có trong phôi. 1.4.2.1. Phương pháp đánh giá hình thái phôi theo Salumets A., 2001 Phôi nuôi cấy đến ngày thứ 2 được đánh giá hình thái phôi theo Salumets A. và cs (2001) dựa theo số phôi bào, độ đồng đều các phôi bào, tỉ lệ mảnh vỡ bào tương (MVBT) so với thể tích phôi. Theo tác giả phôi sẽ được chia thành 4 độ: - Độ 4: phôi có 4 tế bào đồng đều, không có MVBT. - Độ 3: phôi có 2 - 4 tế bào, MVBT chiếm dưới 20 % thể tích của phôi. - Độ 2: phôi có tỉ lệ MVBT chiếm từ 20 đến 50 % thể tích của phôi. - Độ 1: phôi có tỉ lệ MVBT chiếm trên 50 % thể tích của phôi. Đây là phương pháp đánh giá phân loại phôi ngày 2 phổ biến và dễ áp dụng. Tuy nhiên về các mốc phân loại theo tỉ lệ MVBT là 20% và 50% tỏ ra ít có giá trị trong việc phân biệt những phôi có chất lượng xấu và trung bình [86]. 1.4.2.2. Phương pháp đánh giá hình thái phôi theo Holte J., 2007 Dựa vào 5 tiêu chuẩn để đánh giá hình thái phôi giai đoạn phân chia : (1) - Số lượng phôi bào: 2, 3, 4, 5, hoặc ≥ 6 phôi bào (2) - Tỉ lệ mảnh vỡ bào tương (MVBT) so với thể tích phôi, chia thành 5 độ: + Độ 0: không có MVBT + Độ 1: MVBT ≤ 10 % thể tích phôi + Độ 2: MVBT từ 10 % đến ≤ 25 % thể tích phôi + Độ 3: MVBT từ 10 % đến ≤ 50 % thể tích phôi + Độ 4: MVBT > 50 % thể tích phôi (3) - Độ đồng đều các phôi bào, chia 3 độ:
19 + Độ 0: kích thước các phôi bào bằng nhau + Độ 1: kích thước các phôi bào khác nhau không vượt quá 50 % + Độ 2: kích thước các phôi bào khác nhau vượt quá 50 % (4) - Tính đối xứng của phôi bào, chia 3 độ: + Độ 0: phôi phân chia hoàn toàn đối xứng + Độ 1: có một chút không đối xứng + Độ 2: phôi phân chia không đối xứng (5)- Tỉ lệ đa nhân của các phôi bào trong phôi, chia thành 4 độ: + Độ 0 (tỉ lệ từ 0 – 25 %) + Độ 1 (tỉ lệ > 25 – 50 %) + Độ 2 (tỉ lệ > 50 – 75 %) + Độ 3 (tỉ lệ > 75 – 100 %). Độ 0 Độ 1 Độ 2 A B Hình 1.3. Phân độ đối xứng và đồng đều giữa các phôi bào theo Holte J. A. Tính đối xứng; B: Tính đồng đều * Nguồn: Theo Holte J. và cs (2007) [49]
20 Nhận định chung của các tác giả: phôi ngày 2 có 4 phôi bào, đồng đều về kích thước sắp xếp có tính đối xứng, tỉ lệ mảnh vỡ bào tương ít dưới 20% thì được xếp vào các phôi tốt, cho tỉ lệ cấy chuyển và thai lâm sàng cao. Mặc dù phương pháp phân loại theo Holte J. rất chi tiết, nhưng lại tỏ ra khó áp dụng vì tính phức tạp. Nhất là khả năng linh hoạt cần phải đánh giá nhanh chất lượng của phôi để ra quyết định thì phương pháp này sẽ gây khó khăn cho các nhân viên làm việc trong labô khi tiến hành đánh giá chất lượng phôi [49]. 1.4.2.3. Phương pháp đánh giá hình thái phôi theo Baczkowski T., 2004 Năm 2004, Baczkowski T. và cs đã xây dựng tiêu chuẩn cho điểm hình thái của phôi nuôi cấy ngày thứ 3 tương đối đầy đủ và dễ áp dụng. Cách mã hoá cho điểm dựa trên: - Số phôi bào (là một con số) - Hình thái của phôi bào (là một chữ cái viết hoa) A. Các phôi bào đồng đều B. Các phôi bào không đồng đều C. Xuất hiện không bào trong phôi bào - Hình thái mảnh vỡ bào tương (là một con số) 1. Không có mảnh vỡ bào tương 2. Tỉ lệ mảnh vỡ bào tương 50 %. Theo cách đánh giá này thì với 1 phôi được nuôi cấy ở ngày thứ 3 có 8 phôi bào, các phôi bào đồng đều, và không có mảnh vỡ bào tương sẽ được kí hiệu là: 8A1. Do đó phương pháp đánh giá này cho phép đánh giá chất lượng phôi nhanh, giảm thời gian phơi nhiễm có hại cho phôi. Ngoài ra, việc áp dụng cũng dễ dàng tạo thuận lợi, và có độ chính xác cao hơn khi đánh giá chất lượng phôi trước chuyển [15].
21 Tuy nhiên, cách cho điểm theo mảnh vỡ bào tương vẫn theo các mốc tỉ lệ 20% và 50%. Việc lựa chọn tỉ lệ mảnh vỡ bào tương trên 50% phân loại phôi xấu và dưới 50% là những phôi chấp nhận được làm cho khả năng phân loại phôi chất lượng xấu và trung bình của phương pháp phân loại này không rõ ràng. 1.5. Hình thái phôi ngày 5 và mối liên quan đến hình thái phôi ngày 3 1.5.1. Những nghiên cứu về hình thái phôi nuôi cấy ngày 5 Mặc dù trường hợp thụ tinh trong ống nghiệm thành công đầu tiên trên thế giới là từ kết quả chuyển phôi giai đoạn phôi túi (phôi nuôi cấy ngày 5), nhưng hiện nay việc chuyển phôi tại hầu hết các cơ sở thụ tinh ống nghiệm trên thế giới vẫn phổ biến áp dụng chuyển phôi giai đoạn phôi phân chia. Dễ hiểu là do việc nuôi cấy phôi kéo dài đến giai đoạn phôi túi còn nhiều yếu điểm, như: kéo dài thời gian phơi nhiễm của phôi, thao tác phức tạp, tốn kém và đặc biệt là hiệu quả không cao so với chuyển phôi nuôi cấy ngày 2 hoặc ngày 3. Năm 2010, Kallen B. và cs khi so sánh những chỉ số của trẻ sơ sinh ở nhóm chuyển phôi túi và chuyển phôi giai đoạn phân chia, cho thấy có sự tăng nhẹ các yếu tố nguy cơ khi chuyển phôi giai đoạn phôi túi. Từ đây đưa ra khuyến cáo không nên áp dụng chuyển phôi túi cho tất cả trường hợp thụ tinh trong ống nghiệm [53]. Tuy nhiên, trong vài năm gần đây, cùng với sự phát triển của hệ thống nuôi cấy phôi hiện đại dựa trên những hiểu biết đầy đủ về sự phát triển của phôi giai đoạn sau nén đã cho phép kéo dài thời gian nuôi cấy phôi trong ống nghiệm đến giai đoạn phôi túi. Bên cạnh đó, lý do mà đa số các nghiên cứu ủng hộ cho việc nuôi cấy phôi kéo dài và chuyển phôi giai đoạn phôi túi là có thể lựa chọn được phôi có sức sống tốt nhất, tiềm năng làm tổ cao nhất và khả năng đồng bộ với niêm mạc tử cung của mẹ để tăng kết quả của một chu kỳ thụ tinh trong ống nghiệm đồng thời giảm số lượng phôi chuyển, giảm nguy cơ đa thai. Hiện nay, trên thế giới đã có những hướng nghiên cứu kết hợp sử dụng các đặc điểm hình thái của phôi túi và xét nghiệm sàng lọc di truyền của phôi
22 với mục đích lựa chọn phôi tiềm năng nhất sử dụng chuyển phôi nhằm tăng hiệu quả của chu kỳ IVF [107]. Nhưng đa phần các nghiên cứu vẫn ủng hộ cho chuyển phôi giai đoạn phôi túi và chủ yếu sử dụng những tiêu chuẩn hình thái để lựa chọn phôi chuyển [35], [37]. Năm 2011, Maheshwari A. và cs trong một nghiên cứu tổng hợp các kết quả chuyển phôi ở các quốc gia thuộc châu Âu và châu Mỹ, cũng nhận thấy có sự gia tăng tỉ lệ chuyển phôi giai đoạn phôi túi và đặc biệt là chuyển phôi đơn [66]. Hệ thống đánh giá hình thái phôi giai đoạn phôi túi được 2 tác giả là Gardner D. K. và Schoolcraft W. B. đề cập lần đầu tiên vào năm 1999 đã nhanh chóng được áp dụng tại hầu hết các trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm trên thế giới (bảng 1.2). Bảng 1.2. Phân loại phôi túi theo tiêu chuẩn của Gardner D. K. (1999) Sự phát triển của xoang túi phôi 1 Giai đoạn sớm phôi túi: xoang túi phôi < 50% thể tích của phôi. 2 Phôi túi: xoang túi phôi ≥ 50% thể tích của phôi. 3 Phôi túi đầy đủ: xoang túi phôi chiếm hoàn toàn thể tích phôi 4 Phôi túi mở rộng: xoang túi phôi phát triển, màng trong suốt mỏng. 5 Phôi túi đang thoát màng: lá nuôi bắt đầu thoát khỏi màng trong suốt. 6 Phôi túi đã thoát màng: phôi túi đã thoát khỏi màng trong suốt. Xếp loại cho nụ phôi A Khi có nhiều tế bào, gắn kết chặt với nhau. B Khi chỉ có vài tế bào gắn kết lỏng lẻo. C Khi có rất ít tế bào. Xếp loại cho lá nuôi A Có nhiều tế bào tạo nên biểu mô liên kết chặt chẽ với nhau. B Có ít tế bào; liên kết lỏng lẻo C Có rất ít tế bào tạo nên một biểu mô lỏng lẻo. *Nguồn: Theo Gardner D. K. và Schoolcraft W. B. (1999)[38] Mặc dù cách đánh giá hình thái của Gardner D. K. chưa bao hàm trọn vẹn các đặc điểm về hình thái của phôi túi, đặc biệt là những trường hợp có
23 các yếu tố không theo quy luật, nhưng ưu điểm của cách phân loại này là rất dễ áp dụng và đã phân loại được phôi túi dựa trên 3 tiêu chí quan trọng. Đây cũng là 3 thành phần cấu tạo chính của phôi túi, đó là: - Sự phát triển của xoang túi phôi - Đặc điểm của lá nuôi tế bào (TE- Trophectoderm) - Nụ phôi (ICM - Inner Cell Mass) Trong đó, mức độ phát triển của xoang túi phôi được chia thành 6 điểm. Khi xoang túi phôi phát triển từ độ 3 trở lên, thì có thêm những mô tả chi tiết về 2 loại tế bào xuất hiện là tế bào lá nuôi (TE) và nụ phôi (ICM). Theo hệ thống phân loại này thì lá nuôi và nụ phôi được chia thành 3 loại dựa trên số lượng và sự gắn kết của các tế bào. 1.5.1.1. Những nghiên cứu về mức độ phát triển của xoang túi phôi Sự phát triển của phôi túi được xác định khi bắt đầu xuất hiện những khoang chứa dịch của bản thân khối phôi. Lượng dịch tiết ngày một nhiều và tích tụ lại để hình thành một xoang, sau này sẽ phát triển thành xoang túi phôi. Cùng thời điểm này, khối tế bào trong phôi cũng có những thay đổi quan trọng, biệt hóa để hình thành 2 loại tế bào, đó là lá nuôi và nụ phôi. Đồng thời số lượng tế bào cũng tăng lên nhanh chóng. Nghiên cứu của Hardarson T. và cs (2003), đã ghi nhận số lượng tế bào phôi túi trong giai đoạn này lên đến 322 tế bào, với phạm vi dao động rất lớn thể hiện sức sống của phôi khác nhau [1], [2], [42]. Việc nghiên cứu thời điểm và mức độ phát triển của xoang túi phôi có vai trò rất quan trọng, quyết định sự thành công của chuyển phôi túi. Các kết quả nghiên cứu của các tác giả Gardner D. K. và cs (2000); Shapiro B. S. và cs (2008); Ahlstrom A. và cs (2011), đều cho cùng một kết luận về vai trò xoang túi phôi gắn với tiềm năng phát triển của phôi túi. Nếu chuyển những phôi túi có thời gian tạo hang sớm và có mức độ phát triển tốt thì tỉ lệ phôi làm tổ và tỉ lệ có thai tăng đáng kể [12], [35], [90]. Gần đây, trong một nghiên
24 cứu của Van den Berg I. M. và cs (2009), đã nhận thấy phôi túi mang giới tính nữ thường có tốc độ phát triển kém hơn so với phôi túi mang giới tính nam. Điều này được giải thích do phôi mang giới tính nữ có hiện tượng bất hoạt nhiễm sắc thể X trong một khoảng thời gian từ giai đoạn phôi có 8 phôi bào đến khi phôi bắt đầu có hiện tượng tạo hang. Điều đó đã làm cho tốc độ mở rộng của xoang túi phôi chậm hơn ở phôi mang giới tính nữ so với phôi mang giới tính nam, trong khi tiềm năng phát triển và khả năng sống cũng như làm tổ của 2 loại phôi là như nhau [101]. Năm 2013, Van den Abbeel E. và cs, nghiên cứu ảnh hưởng của các tiêu chuẩn về hình thái phôi túi đến khả năng tiên lượng thành công của kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm, cũng nhận thấy có mối tương quan giữa độ giãn rộng của xoang túi phôi với tỉ lệ có thai sinh sống [100]. Cùng năm 2013, Thompson S. M. và cs đã nghiên cứu đánh giá độ giãn rộng của xoang túi phôi có liên quan đến việc tiên lượng tỉ lệ thai lâm sàng và thai sinh sống của một chu kỳ thụ tinh trong ống nghiệm. Như vậy, có thể nói đã có rất nhiều nghiên cứu đánh giá và kết luận vai trò của tốc độ phát triển xoang túi phôi đến kết quả của quá trình tiên lượng cũng như dự kiến kết quả thành công của một chu kỳ chuyển phôi túi [97]. 1.5.1.2. Những nghiên cứu về hình thái nụ phôi Ngay khi phôi túi phát triển đầy đủ, khi thể tích xoang chiếm toàn bộ thể tích khối phôi, cần có thêm những tiêu chí để phân loại chất lượng phôi túi rõ ràng hơn. Vì lúc này phôi túi đã hình thành 2 loại tế bào với các đặc trưng hình thái khác nhau. Các tế bào ở lớp phía ngoài của phôi túi sẽ có đặc điểm giống như một lớp tế bào biểu mô dạng dẹt. Chúng có xu thế dẹt lại để hình thành lớp "biểu mô" làm ranh giới của phôi túi với môi trường xung quanh. Lớp tế bào này gọi là lá nuôi (TE - Trophectoderm). Những tế bào nằm ở trong lòng xoang túi phôi thường có kích thước lớn hơn, tập trung thành một cụm và nắm lệch về một cực của phôi túi, được gọi là nụ phôi (ICM - Inner
25 Cell Mass). Về sau này khối tế bào nụ phôi sẽ biệt hóa để hình thành thai, còn lớp tế bào lá nuôi sẽ biệt hóa thành các phần phụ của thai như bánh rau, dây rốn [1], [2]. Có một số nghiên cứu của Balaban B. (2000) và Richter K. S. (2001), chỉ ra có mối liên hệ chặt chẽ giữa đặc điểm về hình thái của nụ phôi với kết quả có thai lâm sàng. Nếu nụ phôi càng lớn và các tế bào liên kết càng chặt thì tỉ lệ thành công khi chuyển những phôi này sẽ cao hơn. Cũng trong nghiên cứu của mình, tác giả Richter K. S. còn bổ sung thêm kiểu hình thái tốt nhất của nụ phôi là hình ovan [16], [84]. Năm 2011, Ahlstrom A. và cs đã tiến hành hồi cứu đánh giá vai trò độc lập của từng yếu tố ảnh hưởng đến việc đánh giá tiên lượng tỉ lệ có thai. Kết quả cho thấy vai trò quan trọng của hình thái nụ phôi trong việc đánh giá tiên lượng kết quả tỉ lệ thai sinh sống. Khi chuyển phôi túi có nụ phôi loại A thì tỉ lệ thai sinh sống lên tới 45,3% trong khi chuyển phôi túi có nụ phôi loại B và C thì tỉ lệ thai sinh sống tương ứng là 31,0 % và 14,3% [12]. Mới đây trong nghiên cứu của Van den Abbeel E. và cs về mối liên hệ giữa các đặc điểm hình thái của phôi túi và kết quả của chu kỳ chuyển phôi đơn, nhận thấy vai trò của việc phân loại nụ phôi trong khả năng tiên lượng sảy thai sớm. Trong đó, tỉ lệ có thai diễn tiến ở nhóm chuyển 1 phôi có phân loại nụ phôi lần lượt là A, B và C có kết quả tương ứng là: 46%, 33% và 22% [100]. 1.5.1.3. Những nghiên cứu về hình thái lá nuôi Lá nuôi (Trophectoderm – TE) là những tế bào có kích thước nhỏ hơn so với tế bào nụ phôi và nằm bọc phía ngoài ngay sát với màng trong suốt. Lá nuôi có thể dễ dàng phân biệt so với khối tế bào nụ phôi khi phôi túi bắt đầu giãn rộng. Cũng chính vì lý do này cho nên việc xem xét đánh giá hình thái lá nuôi cũng như hình thái nụ phôi chỉ được đặt ra với những phôi túi có độ giãn rộng từ 3 trở lên (xếp loại theo thang 6 điểm trong hệ thống phân loại chất lượng phôi túi của Gardner D. K. năm 1999) [38].
26 Cho đến nay, những hiểu biết đầy đủ về vai trò của lớp lá nuôi có ảnh hưởng như thế nào đến khả năng phát triển của phôi túi trong giai đoạn sớm còn chưa đầy đủ. Về mặt phôi thai học, chúng giữ vai trò quan trọng trong việc giúp cho phôi làm tổ vào niêm mạc tử cung của mẹ. Đặc biệt là những hiểu biết gần đây về vai trò của lớp lá nuôi tại cực phôi. Chúng tiết ra một số yếu tố hỗ trợ, hoạt hóa với niêm mạc tử cung tại vị trí phôi làm tổ. Các tế bào lá nuôi này còn thực hiện chức năng giúp cho phôi thoát ra khỏi màng trong suốt vẫn bao bọc phôi trong suốt giai đoạn phôi phân chia và biệt hóa trước đó. Năm 2003, Sathananthan H. và cs đã nghiên cứu và xác định vai trò quan trọng của lá nuôi trong việc hỗ trợ phôi thoát màng và làm tổ tại vị trí gần khối tế bào nụ phôi [87]. Cho đến nay các nghiên cứu đều thống nhất phân chia lá nuôi thành 3 loại, kí hiệu bằng các chữ cái: - (A): là loại tốt nhất, lá nuôi có nhiều tế bào, các tế bào gắn kết chặt chẽ hình thành một lớp “biểu mô” toàn vẹn bao quanh phôi túi - (B): là loại trung bình có ít tế bào lá nuôi hơn so với loại A, hình thành một lớp "biểu mô" lỏng lẻo không toàn vẹn - (C): là loại kém nhất có rất ít tế bào, các tế bào to và hình thành một lớp lá nuôi có chỗ bị đứt đoạn Tác giả Ahlstrom A. và cs (2011); Hardarson T. và cs (2012), đã nhận thấy đặc điểm hình thái của lá nuôi có vai trò quan trọng hơn so với hình thái nụ phôi trong việc dự đoán tỉ lệ làm tổ của phôi và tiên lượng tỉ lệ thai sinh sống. Đây cũng là nghiên cứu làm căn cứ để đánh giá phân loại phôi túi theo 3 loại: tốt, trung bình và xấu [12], [14], [44]. Năm 2012, Honnma H. và cs đã công bố nghiên cứu trên 1087 chu kỳ rã đông và chuyển phôi nuôi cấy ngày 5 sau rã đông, khẳng định lại vai trò quan trọng của lá nuôi chứ không phải nụ phôi trong việc xem xét đánh giá lựa chọn phôi để chuyển. Phải chăng có sự vô lý khi đánh giá vai trò của lá
27 nuôi (TE) quan trọng hơn so với nụ phôi (ICM) trong quá trình phát triển của phôi túi ở giai đoạn sớm [50]. Năm 2013, De Paepe C. và cs, trong nghiên cứu được công bố trên tạp chí Human reproduction, đã phần nào giải thích vai trò quan trọng của lá nuôi ở giai đoạn phát triển sớm của phôi túi. Trong nghiên cứu của mình, tác giả De Paepe C. và cs đã nhận thấy khi nuôi cấy độc lập phôi túi chỉ có lá nuôi (đã tách bỏ các tế bào nụ phôi), các tế bào này sẽ tiếp tục biệt hóa để hình thành khối tế bào nụ phôi mới. Đây là một quan niệm rất mới và khác biệt với những hiểu biết trước đây về việc hình thành 2 khối tế bào có kích thước khác nhau ngay từ những ngày đầu của quá trình phân cắt phôi [27]. Tại Việt nam, cũng đã có một số trung tâm bắt đầu tiến hành nuôi cấy và chuyển phôi túi. Tuy nhiên, tại hội thảo của nhóm SGART lần thứ 5 năm 2012 nêu ra vấn đề cần cân nhắc khi lựa chọn nuôi cấy phôi túi tại Việt nam. Nguyên nhân do đa số các trung tâm thụ tinh ống nghiệm ở Việt nam chưa có hệ thống nuôi phôi ổn định và đội ngũ nhân sự cũng chưa đủ mạnh để có thể kiểm soát được các yếu tố chi phối đến chất lượng nuôi cấy phôi dài ngày. Ngoài ra, lý do chính ủng hộ cho chuyển phôi túi là giảm số lượng phôi chuyển và giảm nguy cơ đa thai. Trong khi đó, ở Việt nam vấn đề đa thai sau thụ tinh ống nghiệm chưa phải là vấn đề lớn. Trên thực tế đa số bệnh nhân làm thụ tinh ống nghiệm tại Việt nam mong muốn có song thai [10]. 1.5.2. Mối liên quan về hình thái của phôi nuôi cấy ngày 3 và ngày 5 Năm 2000, Racowsky C. và cs đã tiến hành nghiên cứu đánh giá mối liên quan của phôi nuôi cấy ngày 3 và ngày 5 với mục đích đưa ra tiêu chuẩn lựa chọn những bệnh nhân có thể nuôi cấy kéo dài đến ngày 5 và chuyển phôi túi. Ở đây, tác giả mới chỉ xem xét mối liên quan về số lượng phôi bào của phôi nuôi cấy ngày 3 và khả năng phát triển đến giai đoạn phôi túi. Kết quả cho thấy, khả năng có phôi túi khi tiếp tục nuôi cấy đến ngày 5, cao nhất là ở nhóm các bệnh nhân có trên 2 phôi 8 phôi bào [80].
28 Năm 2001, Boostanfar J. D. và cs tiếp tục nghiên cứu mối liên quan giữa số lượng phôi bào của phôi nuôi cấy ngày 3 và khả năng phát triển của những phôi này đến giai đoạn phôi túi. Khoảng 68,9% phôi có trên 7 phôi bào khi nuôi cấy ngày thứ 3 sẽ phát triển đến giai đoạn phôi túi. Đối với các phôi chỉ có từ 4 - 6 phôi bào tỉ lệ hình thành phôi túi giảm xuống còn 38,1%. Điều đó khẳng định vai trò của số lượng phôi bào khi nuôi cấy ngày 3 là quan trọng trong việc phát triển tiếp đến phôi túi [19], [80]. Năm 2003, Hardy K. và cs đã nhận thấy tỉ lệ mảnh vỡ bào tương (MVBT) của phôi nuôi cấy ngày 3 có ảnh hưởng đến chất lượng của phôi túi khi nuôi cấy ngày 5. Trong đó, 70% các phôi nuôi cấy ngày 3 có tỉ lệ MVBT 25% là có khả năng phát triển tiếp và hình thành phôi túi, nhưng chất lượng phôi túi của nhóm này cũng rất thấp. Đây cũng là nghiên cứu đưa ra các mốc về tỉ lệ mảnh vỡ bào tương là 10% và 25% trong cách đánh giá phân loại chất lượng phôi nuôi cấy ngày 3 là: tốt, trung bình, và xấu. Phôi tốt có tỉ lệ MVBT 25% [45]. Cũng trong năm 2003, Racowsky C. và cs đã công bố nghiên cứu thực hiện trên tổng số 5112 bệnh nhân thụ tinh trong ống nghiệm có nuôi cấy phôi đến giai đoạn phôi túi. Đây là một nghiên cứu rất quy mô, đánh giá so sánh chất lượng các phôi nuôi cấy ngày 3 và ngày 5. Trong nghiên cứu này, tác giả cũng lần đầu tiên đánh giá toàn bộ 3 yếu tố đặc trưng của hình thái phôi nuôi cấy ngày 3 (số lượng phôi bào, độ đồng đều, và tỉ lệ MVBT) có ảnh hưởng như thế nào đến khả năng tiên lượng sống sót của phôi khi nuôi cấy đến giai đoạn phôi túi. Kết quả cho thấy có liên quan về hình thái của phôi ngày 3 và hình thái phôi nuôi cấy đến giai đoạn phôi túi [79]. Năm 2007, Nomura M. và cs đặt lại vấn đề xem xét những đặc điểm hình thái đặc trưng nhất của phôi nuôi cấy ngày 3 có ảnh hưởng đến tỉ lệ phát
29 triển phôi túi. Thiết kế nghiên cứu này chặt chẽ hơn so với nghiên cứu của Racowsky C. và cs (2003), đặt ra những câu hỏi cụ thể về tỉ lệ phần trăm phát triển đến phôi túi giữa nhóm ≥ 7 phôi bào với nhóm ≤ 6 phôi bào, giữa nhóm có tỉ lệ MVBT ≥ 50% với nhóm tỉ lệ MVBT < 50%, và giữa nhóm có phôi bào đồng đều với nhóm phôi bào không đồng đều. Kết quả cho thấy có mối liên quan chặt chẽ về mặt hình thái giữa phôi nuôi cấy ngày 3 và khả năng phát triển đến giai đoạn phôi túi [75]. Gần đây, năm 2011, Stoop D. và cs nêu ra vấn đề chuyển 1 phôi ngày 5 dựa trên việc lựa chọn đánh giá tương quan các đặc điểm hình thái của phôi nuôi cấy ngày 3. Nghiên cứu tiếp tục khẳng định vẫn phải dựa vào tiêu chuẩn hình thái của phôi khi nuôi cấy ngày 3 để quyết định lựa chọn nuôi cấy kéo dài cũng như việc lựa chọn phôi chuyển [93]. Năm 2012, Braga D. P. và cs đặt vấn đề nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố như tuổi người mẹ, BMI, liều FSH hay sự tương quan về hình thái của phôi nuôi cấy sẽ là yếu tố quan trọng đánh giá tiên lượng khả năng nuôi cấy kéo dài đến giai đoạn phôi túi. Kết quả cho thấy sự phát triển của phôi túi có tương quan nghịch với các yếu tố tuổi người mẹ, liều FSH trung bình hay chỉ số BMI. Nhưng lại có tương quan thuận giữa chất lượng của phôi giai đoạn phân chia với khả năng phát triển của phôi đến giai đoạn phôi túi [20] Năm 2010, Guerif F. và cs cũng nhận thấy có mối liên quan giữa chất lượng phôi ngày 3 và khả năng phát triển khi nuôi cấy kéo dài đến giai đoạn phôi túi. Tỉ lệ hình thành phôi túi từ 28,6% ở nhóm phôi ngày 3 có chất lượng xấu tăng lên đến xấp xỉ 48% đối với phôi có chất lượng trung bình. Đặc biệt ở những phôi ngày 3 có chất lượng rất tốt tỉ lệ hình thành phôi túi tăng lên đến trên 80% [41]. 1.6. Những nghiên cứu đánh giá phân loại phôi liên tục Lựa chọn phôi liên tục là tập hợp dữ liệu mang tính hệ thống về các thông số phát triển của phôi nuôi cấy từ khi thụ tinh đến khi chuyển phôi, sử
30 dụng các đặc điểm hình thái đặc trưng nhất của phôi. Việc áp dụng đánh giá phân loại phôi liên tục cho phép lựa chọn những phôi tiềm năng nhất cho chuyển phôi để đạt hiệu quả cao, đặc biệt với những quốc gia mà việc áp dụng chuyển phôi đơn là một quy định bắt buộc. Nếu chỉ sử dụng đơn thuần tiêu chuẩn hình thái phôi hay của hợp tử để lựa chọn phôi chuyển sẽ khó có thể lựa chọn được những phôi có tiềm năng phát triển cao nhất làm tăng khả năng làm tổ của phôi. Năm 2007, Guerif F. và cs, khi nghiên cứu trên 4000 phôi, đã nêu ra sự hạn chế khi chỉ sử dụng đơn độc tiêu chuẩn hình thái của hợp tử hay của phôi ngày 2 để quyết định chọn và chuyển phôi ngày 5 [40]. Năm 2013, Nicoli A. và cs, tổng hợp 41 nghiên cứu đánh giá riêng vai trò của hình thái hợp tử đối với khả năng tiên lượng kết quả thụ tinh trong ống nghiệm. Kết quả cho thấy có liên quan giữa hình thái và chất lượng hợp tử với chất lượng phôi giai đoạn phân chia hay phôi túi. Nhưng sự liên quan không đủ mạnh để có thể chỉ dựa vào hình thái hợp tử cho phép kết luận chất lượng phôi tốt nhất [74]. Năm 2014, Berger D. S. khi nghiên cứu gần 2000 phôi của hơn 300 bệnh nhân, đã một lần nữa khẳng định việc đánh giá hình thái tiền nhân không có ý nghĩa tiên lượng kết quả của chu kỳ thụ tinh trong ống nghiệm vì còn nhiều bước can thiệp vào sự phát triển tiếp theo của phôi [17]. Năm 2012, Kamran S. C. tiếp tục nghiên cứu 218 trường hợp chuyển 1 phôi và 225 trường hợp chuyển 2 phôi ngày 3, kết quả cho thấy nếu chỉ căn cứ vào các yếu tố hình thái của phôi ngày 3 không đủ mạnh để tiên lượng tỉ lệ thành công của chu kỳ thụ tinh trong ống nghiệm [54]. Từ những kết quả nghiên cứu này, một câu hỏi đặt ra là phải chăng nên sử dụng kết hợp các dữ liệu mang tính liên tục, xâu chuỗi các đặc điểm hình thái của từng phôi riêng biệt được nuôi cấy từ ngày thứ 1 (giai đoạn hợp tử), đến ngày thứ 2 (phôi 4 phôi bào), sang ngày thứ 3 (phôi có 7 - 8 phôi bào) và ngày thứ 5 (phôi túi) để lựa chọn chính xác nhất phôi tối ưu. Vì thế trong khoảng 5 năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu ủng hộ cho việc sử dụng hệ
31 thống tủ cấy time-lapse như một phương pháp tiên tiến trong việc nuôi cấy, theo dõi và lựa chọn phôi chuyển. Hệ thống tủ cấy time-lapse được hiểu là một tủ cấy có gắn camera hồng ngoại được lập trình để tự động ghi lại hình ảnh của từng phôi riêng biệt trong mỗi khoảng thời gian nhất định mà không cần phải đưa dụng cụ chứa phôi ra khỏi tủ cấy. Đây là ưu điểm chính của hệ thống time-lapse. Nhìn chung hệ thống này cho phép thu thập thông tin đầy đủ nhất về cả quá trình phát triển của phôi trong ống nghiệm để có cái nhìn tổng quan khi lựa chọn phôi chuyển. Ủng hộ cho quan điểm đánh giá chất lượng phôi liên tục bằng tủ cấy time lapse có các tác giả Pribenszky C. (2010), Montag M. (2011), Conaghan J. (2013), Berger D. S. (2014) [17], [24], [69], [77]. Conaghan J. và cs đã phân tích 3 nghiên cứu so sánh tỉ lệ hình thành phôi túi ở nhóm sử dụng tủ cấy time-lapse. Đối tượng nghiên cứu được phân chia thành 2 nhóm để đánh giá khả năng phát triển đến giai đoạn phôi túi của phôi nuôi cấy ngày 3: (1) Chỉ dựa vào hình thái phôi nuôi cấy ngày 3 và (2) dựa vào hình thái ngày 3 kết hợp dữ liệu hệ thống của phôi trong time- lapse. Kết quả tỉ lệ phát triển phôi túi ở trong 2 nhóm của 3 nghiên cứu độc lập lần lượt là: 59,7% so với 86,3%; 41,9% so với 84% và 79,5% so với 86,6% [24]. Tuy nhiên, vấn đề có nên áp dụng tủ cấy time-lapse trong nuôi cấy phôi hay không vẫn còn nhiều tranh cãi. Năm 2011, tác giả Cruz M. và sau đó là Kirkegaard K. (2012), đều đánh giá không có sự khác biệt về chất lượng của phôi nuôi cấy bằng tủ cấy CO 2 bình thường và tủ cấy time-lapse. Điều khác biệt duy nhất là khả năng lựa chọn phôi tốt nhất sử dụng cho chuyển phôi khi sử dụng tủ cấy time-lapse [26], [56]. Một vấn đề nữa là về tài chính, khi so sánh giữa giá tủ cấy time-lapse và tủ cấy thường. Đây sẽ là vấn đề cần cân nhắc nhất là với những trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm tại các nước đang phát triển trong đó có Việt nam. Bên cạnh đó, cũng có những quan điểm ủng hộ cho việc sử dụng nhiều thông tin để lựa chọn phôi chuyển, như các hệ thống đánh giá cho điểm phôi
32 cộng dồn từ giai đoạn hợp tử đến ngày chuyển phôi. Ủng hộ cho quan điểm này có các tác giả Laasch C. và Puscheck E. (2004); Rienzi L. (2005); Scott L. (2007); Liu Q. (2008); Sohrabvand F. (2011). Các nghiên cứu khẳng định vai trò của việc sử dụng cách nuôi cấy từng phôi riêng biệt trong giọt môi trường thể tích nhỏ có phủ dầu và sử dụng tủ cấy CO 2 thông thường kết hợp đánh giá hình thái phôi liên tục từng thời điểm ngày thứ 1, ngày thứ 3, và giai đoạn phôi túi để lựa chọn phôi chuyển sẽ làm tăng tỉ lệ thành công. Nhìn chung các phương pháp đều nêu bật tính ưu việt khi sử dụng nhiều thông tin nhưng cách đánh giá cho điểm nhiều khi không nhất quán và khó áp dụng nhất là việc cần đánh giá nhanh chất lượng phôi trước khi chuyển [60], [64], [85], [89], [91]. Một quan điểm khác áp dụng lựa chọn phôi liên tục là đánh giá riêng biệt chất lượng từng phôi theo từng ngày nuôi cấy để đến ngày chuyển phôi lựa chọn ra những phôi ưu năng nhất bằng cách kết hợp các thông tin đã thu thập trước đó. Ủng hộ cho cách đánh giá phôi liên tục này có các nghiên cứu của Della Ragione T. (2007) và Qian Y. L. (2008) [28], [78]. Tại Việt nam, hiện nay chưa có nghiên cứu nào đánh giá ưu điểm hay cách kết hợp áp dụng đánh giá phân loại phôi liên tục để lựa chọn phôi chuyển ngày 3 hay giai đoạn phôi túi. 1.7. Đồng thuận đánh giá chất lượng hình thái noãn và phôi nuôi cấy trong ống nghiệm Vấn đề chính mà các nhà phôi thai học trên thế giới mong muốn là làm sao có thể thống nhất cách đánh giá chất lượng phôi ở phạm vi quốc tế. Khi đó, các thông tin thu được sẽ có tính giá trị cao hơn, tạo thuận lợi trong những thử nghiệm lâm sàng, cũng như khả năng lặp lại thử nghiệm vì đã có một bản quy chế thống nhất, dễ so sánh. Xuất phát từ lý do này, 2 tổ chức lớn và uy tín về hỗ trợ sinh sản là Hiệp hội các nhà phôi học thế giới (Alpha- Scientist in Reproductive Medicine) và Hiệp hội sinh sản và phôi học người của Châu Âu (ESHRE-
33 European Society of Human Reproduction and Embryology) đã nhóm họp tại Istanbul (Thổ Nhĩ Kỳ ) vào đầu năm 2010 để cùng giải quyết vấn đề. Đồng thuận đánh giá chất lượng noãn và phôi đã ra đời và được công bố rộng rãi trên toàn thế giới vào đầu năm 2011, với mục đích như một văn bản hướng dẫn cách phân loại phôi được thống nhất bởi các chuyên gia hàng đầu thế giới trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản. Tại Việt Nam, cuối năm 2012, Hội phụ sản khoa và sinh đẻ có kế hoạch Việt nam, tên viết tắt là VINAGOFPA, cũng đã xuất bản ấn phẩm về đồng thuận đánh giá và phân loại noãn, phôi trong hỗ trợ sinh sản [7]. 1.7.1. Đồng thuận đánh giá chất lượng hợp tử của phôi nuôi cấy ngày 1 Thời điểm đánh giá chất lượng hợp tử là khoảng 16 -18 giờ sau khi thụ tinh. Hiện nay các nhà phôi thai học đều thống nhất sử dụng hệ thống phân loại tiền nhân theo 4 tiêu chuẩn của Scott L. và cs năm 2000 [88]. Bảng 1.3. Phân loại hợp tử theo Scott L. (2000) Phân Kích thước và vị trí Số lượng và Cách sắp xếp của NPB loại của hai tiền nhân kích thước NPB Bằng nhau, sát nhau ở 3-7 Xếp thẳng hàng ở vùng Z1 trung tâm Tương đương tiếp giáp 2 tiền nhân Bằng nhau, sát nhau ở 3-7 Phân tán trong 2 tiền Z2 trung tâm Tương đương nhân Bằng nhau, sát nhau ở 3-7, kích thước Xếp thành hàng hoặc Z3 trung tâm không đều phân tán Không bằng nhau 3-7 NPB Xếp thành hàng hoặc Z4 Hoặc không sát nhau phân tán * Nguồn: Theo Scott L. và cs (2000) [88] * NPB: Nucleolar Precursor Bodies (Hạt nhân trong tiền nhân) Những noãn thụ tinh với 2 tiền nhân có số lượng và kích thước của các hạt nhân bằng nhau và xếp thẳng hàng (Z1) được chứng minh là những phôi có tiềm năng phát triển và tiềm năng sống tốt nhất. Những hợp tử xếp loại Z3 hoặc Z4 thường tạo ra những phôi ngày 3 có chất lượng rất kém, tỉ lệ tạo phôi túi giảm hẳn và tỉ lệ làm tổ của phôi thấp, cho nên cần loại bỏ những hợp tử
34 này khi cần nuôi cấy kéo dài và chuyển phôi ngày 5. Nhìn chung là nên sử dụng các phôi phát triển từ hợp tử Z1, Z2 để chuyển phôi [88]. Từ đó, các tác giả thống nhất phân chia chất lượng hợp tử ngày 1 thành 3 loại (Bảng 1.4) Bảng 1.4. Đồng thuận phân loại hợp tử ngày 1 của tổ chức Alpha Phân loại Đánh giá Mô tả Loại 1 Hợp tử đồng đều Tương đương theo phân loại Z1 và Z2 Loại 2 Hợp tử không đồng Các loại phân loại theo Z-score còn lại, đều Loại 3 Hợp tử bất thường Tiền nhân không có hoặc chỉ có 1 hạt nhân * Nguồn: Theo đồng thuận đánh giá phân loại noãn và phôi (2011) [14] 1.7.2. Đồng thuận đánh giá chất lượng phôi nuôi cấy ngày 2 và ngày 3 Bảng 1.5. Đồng thuận đánh giá phân loại phôi ngày 2 và 3 của tổ chức Alpha Mức Đánh giá chất Mô tả độ lượng phôi - Có 4 phôi bào đối với phôi ngày 2 và 8 phôi bào đối với phôi ngày 3 1 Tốt - Các phôi bào có kích thước tương đối đồng đều - Tỉ lệ mảnh vỡ bào tương 25 % - Có phôi bào đa nhân * Nguồn: Theo đồng thuận đánh giá phân loại noãn và phôi, (2011)[14] Các tác giả thống nhất thời điểm đánh giá chất lượng phôi nuôi cấy ngày 2 là 43-45 giờ và ngày 3 là 67-69 giờ tính từ thời điểm tinh trùng tiếp xúc với noãn. Việc đánh giá chất lượng phôi giai đoạn phôi phân cắt ngày 2
35 và ngày 3 chủ yếu dựa vào số lượng phôi bào, độ đồng đều và kich thước giữa các phôi bào, tỉ lệ mảnh vỡ bào tương và sự có mặt của phôi bào đa nhân. Bảng 1.5 mô tả chi tiết tiêu chuẩn đồng thuận đánh giá hình thái phôi giai đoạn phân chia (phôi nuôi cấy ngày 2 và ngày 3). Sau khi căn cứ trên các tiêu chuẩn đã lựa chọn, chất lượng phôi giai đoạn phôi phân cắt được chia thành 3 mức độ là: tốt, trung bình và xấu. 1.7.3. Đồng thuận đánh giá chất lượng phôi túi Chuyển phôi ngày 5 có nhiều ưu điểm, nhất là việc lựa chọn phôi tiềm năng và khả năng hạn chế nguy cơ sinh đa thai. Một phôi ngày 5 có chất lượng tốt khi có độ giãn rộng tối đa hay đang ở giai đoạn thoát màng; khối tế bào nụ phôi nổi bật, ranh giới rõ; các tế bào lá nuôi phát triển, ranh giới rõ, liên kết giữa các tế bào chặt chẽ. Bảng 1.6. Đồng thuận đánh giá chất lượng phôi túi của tổ chức Alpha Chỉ tiêu Phân Đặc điểm đánh giá loại 1 Phôi túi sớm 2 Phôi túi Tốc độ phát triển 3 Phôi túi nở rộng 4 Thoát màng (đã hoàn tất hoặc đang thoát màng) Nổi bật, quan sát rõ, có nhiều tế bào kết khối và A liên kết chặt Khối tế bào nụ Có thể quan sát rõ, nhiều tế bào nhưng không liên phôi (ICM) B kết chặt C Khó quan sát, có ít tế bào Nhiều tế bào, liên kết chặt với nhau thành một A Lớp tế bào lá lớp liên tục nuôi (TE) B Ít tế bào, liên kết rời rạc C Rất ít tế bào * Nguồn: Theo đồng thuận đánh giá phân loại noãn và phôi, (2011) [14] Về căn bản cách đánh giá chất lượng phôi này dựa theo tác giả Gardner D. K. (1999) (bảng 1.2) nhưng có một số điều chỉnh để có thể đánh giá độ giãn rộng của phôi theo 4 cấp độ thay vì 6 cấp độ. Với cách đánh giá này cũng cho
36 phép thống nhất cách đánh giá chất lượng phôi giai đoạn phôi túi dễ dàng hơn, để có thể phân chia phôi túi thành 3 loại tốt, trung bình và xấu. Như vậy, cùng với việc thống nhất tiêu chuẩn đồng thuận đánh giá chất lượng noãn và phôi giữa các tác giả trên thế giới cho phép có "thước đo chuẩn" để đánh giá chất lượng của một chu kỳ thụ tinh ống nghiệm nói chung và chất lượng hệ thống nuôi cấy phôi nói riêng giữa các trung tâm trên thế giới cũng như tại Việt nam. Để từ đó có thể triển khai những nghiên cứu hay thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm, đánh giá so sánh hiệu quả thụ tinh hay chất lượng phôi giữa các labô, các trung tâm một cách dễ dàng.
37 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng Đối tượng nghiên cứu: gồm 181 chu kỳ thụ tinh trong ống nghiệm của 181 bệnh nhân lựa chọn ngẫu nhiên để tiến hành nuôi cấy và chuyển phôi ngày 3 hoặc ngày 5 có kết hợp đánh giá hình thái phôi giai đoạn hợp tử (phôi nuôi cấy ngày 1) tại Trung tâm Đào tạo nghiên cứu công nghệ phôi, Học viện Quân y trong thời gian từ năm 2012 đến năm 2014. Trong tổng số 181 chu kỳ không có bệnh nhân nào lặp lại 2 lần, do vậy các kết quả thu được trên 181 bệnh nhân cũng tương đương với 181 chu kỳ thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm. Đối tượng thứ 2 gồm: 1323 phôi nuôi cấy ngày 3 và 184 phôi túi nuôi cấy ngày 5 của các bệnh nhân trên. Các bệnh nhân được chia thành 3 nhóm khác nhau về thời điểm chuyển phôi và cách lựa chọn phôi chuyển, cụ thể: - Nhóm 1: Gồm 441 phôi của 61 bệnh nhân chuyển phôi ngày 3, chỉ dựa vào hình thái tại thời điểm chuyển phôi để lựa chọn phôi chuyển (không phân loại phôi liên tục). - Nhóm 2: Gồm 452 phôi của 61 bệnh nhân chuyển phôi nuôi cấy ngày 3 căn cứ dữ liệu đánh giá phân loại phôi liên tục (PLPLT) từ ngày 1 đến ngày 3 để lựa chọn phôi chuyển (có PLPLT đến ngày 3) . - Nhóm 3: Gồm 184 phôi túi nuôi cấy kéo dài từ 430 phôi ngày 3 của 59 bệnh nhân chuyển phôi túi có căn cứ dữ liệu đánh giá phân loại phôi liên tục từ ngày 1 đến ngày 5 để lựa chọn phôi chuyển (có PLPLT đến ngày 5).
38  Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu - Chọn các bệnh nhân ≤ 35 tuổi. - Các bệnh nhân có niêm mạc tử cung ngày chuyển phôi từ 8mm đến 14mm trên siêu âm. - Có ít nhất 8 noãn thu được ở ngày chọc hút noãn. - Có ít nhất có 2 phôi có 7-8 phôi bào khi nuôi cấy đến ngày 3. - Các bệnh nhân có thang điểm tiên lượng tỉ lệ hình thành phôi túi ≥ 50% theo tiêu chuẩn của Dessolle L. năm 2010 [29].  Tiêu chuẩn loại trừ các bệnh nhân nghiên cứu - Các bệnh nhân trên 35 tuổi. - Các trường hợp bệnh nhân có chiều dày niêm mạc tử cung ngày chuyển phôi 14mm. - Các trường hợp có ít hơn 8 noãn ở ngày chọc hút. - Các trường hợp có ít hơn 2 phôi có 7-8 phôi bào khi nuôi cấy đến ngày 3 (căn cứ theo nghiên cứu của Racowsky năm 2000) [80]. - Các bệnh nhân có thang điểm tiên lượng tỉ lệ hình thành phôi túi < 50% theo tiêu chuẩn của Dessolle L. năm 2010 [29]. - Có bệnh lý dị dạng tử cung âm đạo. - Các trường hợp xin noãn hay xin phôi. 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm đào tạo, nghiên cứu Công nghệ phôi, Học viện Quân y. 2.1.3. Thời gian nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 12 năm 2011 đến tháng 06 năm 2014. Trong đó thời gian thu thập mẫu nghiên cứu từ tháng 08 năm 2012 đến tháng 06 năm 2014. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả tiến cứu có kết hợp so sánh 2 tỉ lệ.
39 2.2.2. Cỡ mẫu và chọn mẫu * Để so sánh kết quả có thai của nhóm chuyển phôi ngày 3 và ngày 5 Sử dụng công thức tính cỡ mẫu so sánh 2 tỉ lệ[8]: 2 푍훼/2 2 (1 ― ) + 푍훽 1(1 ― 1) + 2(1 ― 2) 푛 = ∆2 Trong đó: n: cỡ mẫu tối thiểu cần thiết cho mỗi nhóm Zα/2: Là hệ số tin cậy, với độ tin cậy là 95% thì Zα/2 = 1,96 Zβ: Là giá trị ứng với lực mẫu, đối với lực mẫu là 80% thì Zβ = 0,84 p1: Tỷ lệ có thai khi chuyển phôi nuôi cấy ngày 3 p2: Tỷ lệ có thai khi chuyển phôi nuôi cấy ngày 5 p = (p1+ p2)/2∆ = p 1- p2 Căn cứ theo Frattarelli J. L. và cs (2003) khi so sánh kết quả chuyển phôi ngày 3 với ngày 5, tỉ lệ có thai ở 2 nhóm lần lượt là 43,5% và 69,2% [34]. Như vậy: p1= 0,435 và p2= 0,692 Thay số vào công thức trên ta có n = 57,6. Như vậy, số lượng bệnh nhân tối thiểu cho mỗi nhóm nghiên cứu là 58. * Để đánh giá tỉ lệ hình thành phôi túi Sử dụng công thức tính cỡ mẫu ước tính một tỉ lệ [8]. 2 ( Z 1 ) . p (1 p ) n 2 d 2 Trong đó: n : cỡ mẫu nghiên cứu tối thiểu phải có Z1- α/2 : hệ số tin cậy, ứng với độ tin cậy 95% thì Z1- α/2 = 1,96 p: Tỉ lệ hình thành phôi túi từ nhóm phôi nuôi cấy ngày 5. Cỡ mẫu sẽ lớn nhất khi tỉ lệ này là 50% (p = 0,5). d: là sai số tuyệt đối cho phép, tôi cho là 5% = 0,05
40 Như vậy, số lượng phôi nuôi cấy ngày 3 tối thiểu phải có là 385 phôi. Trong nghiên cứu của tôi số phôi ở nhóm 3 (nhóm tiếp tục nuôi cấy đến giai đoạn phôi túi) là 430 phôi đã đảm bảo cỡ mẫu tối thiểu. * Sơ đồ nghiên cứu Sơ đồ 2.1 mô tả sơ đồ nghiên cứu của 181 bệnh nhân ở 3 nhóm nghiên cứu. Giữa các nhóm khác nhau về thời điểm chuyển phôi và việc có hay không đánh giá phân loại phôi liên tục để lựa chọn phôi chuyển. * Chọn mẫu Việc chọn mẫu được thực hiện theo phương pháp lựa chọn mẫu ngẫu nhiên phân tầng. Các bệnh nhân đủ tiêu chuẩn lựa chọn bệnh sẽ được đánh số sau đó sử dụng phần mềm R lựa chọn ngẫu nhiên chia vào 3 nhóm bệnh nhân. Điều đó đảm bảo các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng phôi như môi trường nuôi cấy, không khí, độ ẩm, nhiệt độ, tủ cấy sẽ đồng đều ở cả 3 nhóm nghiên cứu.
41 BN làm thụ tinh ống nghiệm Nhóm I Nhóm II Nhóm III (441 phôi / 61 BN) (452 phôi / 61 BN) (430 phôi / 59 BN) KHÔNG PLPLT CÓ PLPLT CÓ PLPLT Ngày 1 Đánh giá hình thái từng hợp tử theo tiêu chuẩn Scott 2000(Z1, Z2, Z3, Z4) Ngày 3 Đánh giá phôi ngày 3 theo tiêu chuẩnđồng thuận ALPHA (2011) 181 phôi túi / 59BN Chuyển phôi ngày 3 Ngày 5 Đánh giá phôi túi theo tiêu chuẩn đồng thuận ALPHA (2011) Chuyển phôi ngày 5 Sơ đồ 2.1. Các bước tiến hành nghiên cứu
42 2.2.3. Phương pháp, kỹ thuật 2.2.3.1. Phác đồ kích thích buồng trứng và trưởng thành noãn Sử dụng 3 phác đồ kích thích buồng trứng: - Phác đồ dài (long protocol) sử dụng thuốc GnRH đồng vận (GnRHa: Gonandotropin-releasing hormone agonist) trong khoảng thời gian 14 ngày, từ ngày 21 chu kỳ kinh. Thuốc sử dụng có thể là Triptorelin acetate (Diphereline; Ipsen Pharma Biotech, Pháp) hoặc Buserelin (Suprefact 1mg/ml; Sanofi). Sau khi kết hợp siêu âm không có nang tồn dư kết hợp định lượng nồng độ Estradiol máu dưới 50 ng/mL thì bổ sung thêm hormon kích thích nang noãn FSH: follitropin α (Gonal-f; Merck Serono, Ý) hoặc follitropin β (Puregon; Organon; Hà Lan) trong khoảng thời gian từ 8 đến 12 ngày. Liều sử dụng được cá thể hóa theo từng bệnh nhân cụ thể. - Phác đồ ngắn (Flare up) chỉ sử dụng thuốc GnRH đồng vận (Gonandotropin-releasing hormone agonist), Triptorelin acetate (Diphereline; Ipsen Pharma Biotech, Pháp) hoặc Buserelin (Suprefact 0,1mg/ml; Sanofi) vào ngày thứ 2 của chu kỳ kinh, sau đó kết hợp sử dụng hormone kích thích nang noãn follitropin α (Gonal-f; Merck Serono, Ý) hoặc follitropin β (Puregon; Organon; Hà Lan) trong khoảng từ 8 đến 12 ngày. - Phác đồ antagonist, sử dụng kết hợp hormone FSH với thuốc GnRH đối vận (GnRHanta: Gonandotropin-releasing hormone antagonist). Trong đó các hormone FSH: follitropin α (Gonal-f; Merck Serono, Ý) hoặc follitropin β (Puregon; Organon; Hà Lan) được sử dụng ngay từ những ngày đầu của chu kỳ kinh. Khi trên siêu âm xuất hiện có nang ≥14mm thì bổ sung GnRHanta. Sản phầm thường được sử dụng là: Cetrotide (Merck Serono, Ý hoặc Orgalutran (ganirelix) 0,25mg Organon, Ailen). Khi trên siêu âm có trên 2 nang có kích thước ≥18mm thì sử dụng thuốc kích thích rụng trứng để trưởng thành nang noãn (hCG - human chorionic gonadotropin: Pregnyl ( Organon; Hà Lan) hoặc IVF-C (LG Life
43 sciences, Hàn Quốc). Trong trường hợp tổng số nang xấp xỉ 20 hoặc trên 20 nang thì sử dụng Ovitrelle 0,25mg (Choriogonadotropin α; Merck Serono, Ý). Riêng với phác đồ antagonist có thể sử dụng chính GnRHagonist để trưởng thành nang noãn tránh nguy cơ quá kích buồng trứng. Noãn sẽ được lấy bằng chọc hút dưới hướng dẫn siêu âm qua đường âm đạo sau khi tiêm thuốc trưởng thành nang noãn trong khoảng thời gian từ 34 đến 35 giờ trước đó. Noãn lấy ra sẽ được rửa sạch bằng dung dịch G-MOPS (Vitrolife; Thụy điển) sau đó chuyển vào môi trường G-IVF (Vitrolife; Thụy o điển) và đặt trong tủ ấm CO2 37 C. 2.2.3.2. Chuẩn bị tinh trùng cho kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm Tinh trùng bệnh nhân được lấy vào lọ sạch trong ngày chọc hút noãn, đối với trường hợp chọc hoặc mổ lấy tinh trùng từ mào tinh hay tinh hoàn thì tiến hành thực hiện song song với thời điểm chọc hút noãn để làm ICSI. Đối với mẫu tinh trùng xuất tinh bình thường, lọ đựng tinh trùng được để trong tủ ấm 37 oC trong khoảng thời gian 30 phút để chờ ly giải. Sau khi ly giải, mẫu được đánh giá các chỉ số phân tích mẫu tinh trùng theo tiêu chuẩn của Tổ chức y tế thế giới. Mẫu tinh trùng sử dụng cho phương pháp làm IVF được lọc rửa theo phương pháp lọc kép. Đầu tiên, tinh trùng được lọc bằng phương pháp thang nồng độ ở môi trường SpermGrad (Vitrolife; Thụy điển) với 2 bậc nồng độ là 90% và 45%, quay ly tâm tốc độ 1500 vòng/phút × 15 phút bằng máy li tâm văng ngang. Tinh trùng lọc xong được rửa lần 2 bằng môi trường SpermRinse (Vitrolife; Thụy điển), quay ly tâm tốc độ 1000 vòng/phút × 10 phút. Cuối cùng cho bơi lên (Swim up) với môi trường G-IVF Plus (Vitrolife; Thụy o điển), đặt trong tủ ấm CO2 37 C trong khoảng thời gian 15- 30 phút. Tinh trùng thu được sau khi bơi lên được đếm, đánh giá chất lượng sau đó pha loãng bằng môi trường G-IVF Plus với mật độ từ 50.000 - 100.000 tinh trùng trong một giếng cấy của hộp cấy (Nunc) có 4 giếng.
44 Trường hợp mẫu tinh trùng thu được từ mào tinh, tinh hoàn hoặc các mẫu tinh trùng yếu sử dụng cho phương pháp ICSI, được rửa từ 1 đến 2 lần bằng dung dịch IVF hoặc G-IVF plus, li tâm tốc độ 1000 vòng/phút × 10 phút. Sau khi loại bỏ phần cặn lắng có hồng cầu, đánh giá phần tinh trùng còn lại. Tuỳ theo số lượng tinh trùng còn lại có thể tiếp tục li tâm lần 2 để cô đặc mật độ tinh trùng. Sau đó mẫu tinh trùng được bổ sung 0,3 - 0,5 ml IVF, đặt trong o tủ ấm 5% CO2 37 C, và sẵn sàng cho kỹ thuật ICSI. 2.2.3.3. Kỹ thuật IVF và ICSI Đối với kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF), noãn sau khi chọn sẽ được cấy vào hộp cấy 4 giếng vào thời điểm 2 - 4 giờ sau khi lấy noãn. Trong mỗi giếng cấy đã có tinh trùng chuẩn bị sẵn với mật độ từ 50.000 - 100.000 tế bào. Noãn chín được chuẩn bị cho kỹ thuật tiêm tinh trùng vào trong bào tương noãn (ICSI) được làm sạch khối tế bào nang bao quanh bằng cách sử dụng enzyme hyaluronidaze (Hyase; Vitrolife, Thụy điển). Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào trong bào tương noãn (ICSI) được thực hiện trên kính hiển vi đảo ngược Olympus IX 70 hoặc Nikon ECLIPSE Ti, độ phóng đại 200 lần có gắn bộ vi thao tác. Noãn sau khi lấy bỏ đám tế bào nang được cho vào các giọt môi trường Gamete hoặc G-IVF (Vitrolife) trên đĩa làm ICSI có đường kính đĩa 3cm (đĩa Falcon). Sử dụng thể tích khoảng 1 µl dung dịch G-IVF có chứa các tế bào tinh trùng đã được chuẩn bị để làm ICSI cho vào giọt dầu PVP trên đĩa làm ICSI. Mục đích để làm cho tế bào tinh trùng bơi chậm lại. Đĩa tiêm ICSI được phủ dầu OVOIL (Vitrolife; Thụy điển) trên bề mặt. Noãn được cố định bằng kim giữ có đường kính trong lòng khoảng 15µm. Tinh trùng được hút bằng kim tiêm có đường kính trong lòng khoảng 4µm, và được tiêm vào trong bào tương của noãn. Noãn được đánh giá thụ tinh sau khoảng thời gian 16 - 18 giờ đối với IVF đơn thuần, hoặc 14 - 16 giờ đối với ICSI. Các phôi tạo thành được nuôi cấy tiếp đến ngày thứ 3 và thứ 5 bằng môi trường G-1 plus và G-2 plus (Vitrolife; Thụy điển).
45 2.2.3.4. Nuôi cấy phôi và chuyển phôi * Nuôi cấy phôi Để thuận lợi cho đánh giá hình thái phôi liên tục, các noãn sau khi thực hiện kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) hoặc tiêm tinh trùng bào tương noãn (ICSI) được nuôi cấy trong hộp cấy 4 giếng (NUNC) trong môi trường tủ cấy benchtop (COOK benchtop incubator) với môi trường khí sử dụng là hỗn hợp khí trộn gồm O 2 5%; CO2 6% và còn lại là N2. Đánh giá thụ tinh ở thời điểm 17 ± 1 giờ; đánh giá hình thái hợp tử thời điểm 23 ± 1 giờ sau khi thực hiện kỹ thuật [14]. Ở nhóm 2 và nhóm 3, cần đánh giá phân loại phôi liên tục từ ngày 1 đến ngày 3 và ngày 5, sử dụng phương pháp nuôi cấy phôi đơn trong giọt môi trường thể tích 20 μl có phủ dầu. Để đảm bảo tính đồng đều trong nghiên cứu, môi trường nuôi cấy được thay mới hàng ngày ở cả 3 nhóm nghiên cứu [52]: + Noãn sau khi thụ tinh được đánh giá chất lượng và được nuôi cấy trong từng giọt môi trường riêng biệt có đánh số, với thể tích nuôi cấy 15-20μl G-IVF Plus có phủ dầu khoáng (OVOIL, Vitrolife, Thụy điển). + Nuôi cấy phôi từ ngày 1 đến ngày 3 sử dụng môi trường G-1 Plus (Vitrolife, Thụy điển) + Nuôi cấy phôi từ ngày 3 đến ngày 5 sử dụng môi trường G-2 Plus (Vitrolife, Thụy điển) * Lựa chọn phôi chuyển Tất cả 3 nhóm đều sử dụng chuyển phôi tươi và thống nhất tiêu chuẩn phân loại phôi theo đồng thuận để đánh giá chất lượng phôi chuyển [7], [14]. Cụ thể: + Nhóm 1: Chỉ sử dụng đánh giá phân loại phôi chuyển tại thời điểm chuyển phôi là hình thái phôi nuôi cấy ngày 3. + Nhóm 2: Sử dụng tổng hợp dữ liệu của từng phôi thông qua đánh giá phân loại phôi liên tục của phôi ngày 1 và ngày 3 để lựa chọn phôi chuyển.
46 + Nhóm 3: Sử dụng tổng hợp dữ liệu của từng phôi thông qua đánh giá phân loại phôi liên tục của phôi ngày 1, ngày 3 và ngày 5 để lựa chọn phôi chuyển. 2.2.3.5. Thời điểm đánh giá chất lượng phôi nuôi cấy Thời điểm đánh giá chất lượng phôi nuôi cấy có vai trò rất quan trọng, vì phôi là một cấu trúc động nên khả năng biến đổi về mặt hình thái diễn ra rất nhanh, chỉ sau vài giờ. * Cách xác định mốc thời gian bắt đầu thụ tinh Đối với kỹ thuật IVF mốc thời gian này được tính là khi bắt đầu thực hiện việc đưa noãn đã được chuẩn bị vào hộp cấy có chứa tinh trùng với mật độ 50.000-100.000 tinh trùng/mL. Đối với kỹ thuật ICSI, mốc thời gian này được tính là khi bắt đầu thực hiện việc tiêm tinh trùng vào bào tương noãn. * Các thời điểm đánh giá chất lượng phôi nuôi cấy Theo đồng thuận đánh giá chất lượng noãn và phôi, thời điểm đánh giá chất lượng noãn và phôi được trình bày trong bảng 2.1 Bảng 2.1. Thời điểm đánh giá thụ tinh và phân loại phôi từng giai đoạn Thời điểm (giờ) Tiêu chuẩn Đánh giá hợp tử 17 ± 1 Giai đoạn hợp tử Đánh giá phôi ngày 3 68 ± 2 Giai đoạn 8 phôi bào Đánh giá phôi ngày 5 116 ± 2 Phôi túi * Nguồn: Đồng thuận đánh giá phân loại noãn và phôi(2011)[14] Các thời điểm đánh giá gắn với những đặc điểm hình thái đặc trưng của phôi nuôi cấy được mô tả trong sơ đồ 2.2
47 0 giờ 16 - 18 giờ 66 - 70 giờ 114 - 118 giờ Sơ đồ 2.2. Thời điểm đánh giá chất lượng phôi nuôi cấy D0: noãn chín (giai đoạn MII) D1: thời điểm đánh giá hợp tử D3: phôi nuôi cấy ngày 3 D5: phôi túi nuôi cấy ngày 5 2.2.3.6. Hỗ trợ hoàng thể Các bệnh nhân sau khi chuyển phôi và sau khi xác định có thai được hỗ trợ hoàng thể nhằm tăng khả năng làm tổ của phôi. Tất cả 181 bệnh nhân chuyển phôi ngày 3 hoặc ngày 5 đều sử dụng thuốc hỗ trợ hoàng thể là hormon progesteron, ưu tiên sử dụng đường đặt âm đạo với liều 400mg - 800mg/ngày. Tùy từng trường hợp bệnh nhân cụ thể có thể bổ sung progesterone đường tiêm và estrogen đường uống với liều 4mg - 8mg/ngày. Có thể xem xét bổ sung thêm βhCG đường tiêm với liều 1000-1.500 IU cách ngày. Thời gian duy trì hỗ trợ hoàng thể đối với những trường hợp có thai là 12 tuần tính từ thời điểm chuyển phôi.
48 2.2.4. Đánh giá hình thái cấu trúc phôi 2.2.4.1. Đánh giá hình thái hợp tử Z1 Z2 Z3 Z4 Hình 2.1 Phân loại hợp tử theo Scott L. (2000) *Nguồn: Theo Scott L. và cs, 2000 [88] Các phôi thuộc nhóm 2 và nhóm 3 được đánh giá dữ liệu liên tục của từng phôi ở các thời điểm nuôi cấy: ngày 1, ngày 3 và ngày 5. Sử dụng đánh giá hình thái hợp tử theo phân loại của Scott L. (2000) để đánh giá chất lượng hợp tử ngày 1. Đây cũng là hệ thống đánh giá hình thái hợp tử được đồng thuận nhất trí trên phạm vi toàn cầu [7], [14], [88]. Hình 2.1 mô tả hình thái hợp tử theo Scott L. và cs (2000): - Z1: kích thước hai tiền nhân bằng nhau. Mỗi tiền nhân có số lượng hạt nhân từ 3 đến 7, xếp thẳng hàng tại điểm liên kết giữa hai tiền nhân. - Z2: kích thước hai tiền nhân bằng nhau. Mỗi tiền nhân có số lượng hạt nhân và kích thước cân bằng, nhưng các hạt nhân không sắp xếp thẳng hàng tại điểm liên kết giữa hai tiền nhân.
49 - Z3: kích thước hai tiền nhân không đồng đều. Số lượng, kích thước các hạt nhân giữa hai tiền nhân không đồng đều hoặc không cùng thẳng hàng tại điểm liên kết giữa hai tiền nhân. - Z4: kích thước hai tiền nhân không đồng đều, nhỏ và đặt không đúng vị trí. Các hạt nhân nhỏ và không sắp xếp thẳng hàng. 2.2.4.2. Đánh giá hình thái phôi ngày 3 Việc đánh giá phân loại hình thái phôi nuôi cấy ngày 3 được thực hiện cho toàn bộ 1323 phôi của cả 3 nhóm nghiên cứu. Chất lượng phôi nuôi cấy ngày 3 được đánh giá theo 3 đặc điểm chính là: số lượng phôi bào, độ đồng đều của phôi bào và tỉ lệ mảnh vỡ bào tương. A B Hình 2.2. Tiêu chuẩn đánh giá độ đồng đều của phôi bào A. Các phôi bào đồng đều B. Các phôi bào không đồng đều- Số lượng phôi bào: đếm trực tiếp tổng số phôi bào khi quan sát trên kính hiển vi. - Độ đồng đều phôi bào: đánh giá mức độ đồng đều phôi bào căn cứ theo tỉ lệ chênh lệch không vượt quá 1:4 theo tiêu chuẩn được công bố mới đây của Prados F. J. và cs, 2012 (Hình 1.1) [76]. Có thể khái quát hình ảnh phôi có phôi bào đồng đều và không đồng đều theo hình 2.2. - Tỉ lệ mảnh vỡ bào tương: Đánh giá tổng số thể tích mảnh vỡ bào tương so với tổng thể tích của khối phôi và phân thành các loại: 0%, từ 1- 10%, từ 10-25% và >25%. Hình ảnh khái quát tỉ lệ mảnh vỡ bào tương được mô tả trong hình 2.3
50 FR 0% FR 25% Hình 2.3. Phân loại phôi theo tỉ lệ mảnh vỡ bào tương Kết quả phân loại phôi ngày 3 chia làm 3 loại căn cứ theo tiêu chuẩn đồng thuận Alpha và đồng thuận đánh giá chất lượng noãn và phôi của VINAGOFPA (bảng 2.2) Bảng 2.2. Phân loại hình thái phôi ngày 3 theo tiêu chuẩn đồng thuận Phân loại Mô tả Phôi 7-8 phôi bào, các phôi bào tương đối đồng đều Tốt Tỉ lệ mảnh vỡ bào tương 25 % * Nguồn Đồng thuận đánh giá phân loại noãn và phôi, (2011) [14] 2.2.4.3. Đánh giá hình thái phôi túi (phôi ngày 5) Việc đánh giá phân loại hình thái phôi túi chỉ được thực hiện trên tổng số 184 phôi túi được nuôi cấy từ 430 phôi của nhóm 3. Các tiêu chuẩn đánh giá chất lượng phôi túi dựa vào mức độ phát triển xoang túi phôi, đặc điểm hình thái khối tế bào nụ phôi và lá nuôi. Về đặc điểm hình thái khối tế bào nụ
51 phôi và lá nuôi có sự thống nhất giữa tiêu chuẩn phân loại của tác giả Gardner D. K. (1999) và tiêu chuẩn phân loại hình thái của đồng thuận Alpha (2011) hay đồng thuận đánh giá chất lượng noãn và phôi. Hình thái lá nuôi và nụ phôi chia thành 3 loại A, B, C căn cứ trên số lượng tế bào và cách sắp xếp của các tế bào [7], [14], [35]. Riêng về tiêu chuẩn đánh giá mức độ giãn rộng hay mức độ phát triển của xoang túi phôi trong tiêu chuẩn phân loại của Gardner D. K. chia thành 6 mức độ: (1) Giai đoạn sớm của phôi túi, xoang túi phôi 1/2 thể tích của phôi (3) Phôi túi đầy đủ khi xoang túi phôi chiếm hoàn toàn thể tích phôi (4) Phôi túi nở rộng khi khoang túi phôi > thể tích của phôi và màng trong suốt mỏng (5) Phôi túi đang thoát màng lá nuôi bắt đầu thoát khỏi màng trong suốt (6) Phôi túi đã thoát màng Tuy nhiên, theo tiêu chuẩn phân loại đồng thuận Alpha (2011) và đồng thuận đánh giá chất lượng noãn và phôi của VINAGOFPA (2012) thì mức độ phát triển của xoang túi phôi được chia thành 4 loại: (1) Giai đoạn phôi túi sớm (2) Phôi túi (3) Phôi túi nở rộng (4) Phôi túi thoát màng Trong nghiên cứu của chúng tôi việc đánh giá hình thái phôi túi được thực hiện theo đồng thuận đánh giá chất lượng phôi theo tiêu chuẩn phân loại của Alpha năm 2011 (Bảng 1.6). Năm 2012, Honnma H. và Ahlstrom A. đều đánh giá vai trò của lá nuôi quan trọng hơn nụ phôi trong việc phân loại chất lượng của phôi túi. Do vậy sẽ phân chia phôi túi thành 3 loại: Tốt, trung bình
52 và xấu. Việc phân loại như vậy sẽ dễ dàng cho việc lượng hóa và so sánh mối tương quan về chất lượng giữa phôi nuôi cấy ngày 3 và ngày 5 [12], [50], [81]. Bảng 2.3. Phân loại chất lượng phôi túi Đánh giá chất Mô tả lượng phôi túi Phôi có mức độ giãn rộng ≥ 3 Tốt Phân loại ICM và TE là: AA; AB; BA Phôi có mức độ giãn rộng ≥ 3 Trung bình Phân loại ICM và TE là: BB; CA Phôi có mức độ giãn rộng 20mIU/mL; nhưng chưa xác định có túi ối trên siêu âm, (theo Zender-Fox D. L. và cs, 2011) [108] .
53 Tỉ lệ thai sinh hóa là tỉ lệ phần trăm giữa số chu kỳ có thai sinh hóa trên tổng số chu kỳ chuyển phôi. Hay số ca có thai sinh hóa trên tổng số 100 ca chuyển phôi (tính theo số chu kỳ). * Tỉ lệ có thai lâm sàng - Thai lâm sàng được xác định khi siêu âm đánh giá ở thời điểm tuần thứ 5 hoặc 6 tính từ thời điểm chuyển phôi xác định có tim thai. Tỉ lệ thai lâm sàng được hiểu là tỉ lệ phần trăm giữa số chu kỳ có thai lâm sàng trên tổng số chu kỳ chuyển phôi. * Tỉ lệ thai sinh sống - Tỉ lệ thai sinh sống là tỉ lệ phần trăm giữa số chu kỳ có thai sinh sống (có ít nhất 01 thai sinh sống) chia cho tổng số chu kỳ chuyển phôi. * Đa thai - Đa thai trong hỗ trợ sinh sản được định nghĩa là những trường hợp có trên một thai được sinh ra mà người mẹ có sử dụng sự can thiệp của kỹ thuật hỗ trợ sinh sản. Tỉ lệ đa thai là tỉ lệ phần trăm giữa số chu kỳ chuyển phôi có đa thai trên tổng số chu kỳ có thai sinh sống. 2.2.6. Thu thập số liệu Toàn bộ 181 bệnh nhân của 3 nhóm nghiên cứu được lập hồ sơ có sổ tay nghiên cứu và bệnh án nghiên cứu riêng biệt. Các số liệu trong bệnh án nghiên cứu và sổ tay nghiên cứu của 181 bệnh nhân được tổng hợp từ bệnh án gốc; sổ theo dõi kết quả thụ tinh trong ống nghiệm của Trung tâm công nghệ phôi. Kết quả đánh giá tỉ lệ có thai sinh hóa của bệnh nhân căn cứ theo các xét nghiệm nội tiết đã thực hiện tại labô Miễn dịch của Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh y dược học, Học viện Quân y. Kết quả siêu âm, thai lâm sàng, số túi ối, số tim thai được thực hiện và tổng hợp ghi chép trong sổ theo dõi kết quả thụ tinh trong ống nghiệm và bệnh án nghiên cứu bởi các bác sỹ siêu âm có kinh nghiệm. Các số liệu về
54 tình trạng thai sinh sống, tuổi thai, sảy thai được tổng hợp từ số theo dõi kết quả thụ tinh trong ống nghiệm của trung tâm. Các thông số đo đạc về hình ảnh của phôi nuôi cấy được chụp ảnh bằng cách sử dụng phần mềm chuyên dụng đo đạc RI của hãng Research Instruments (Anh quốc), với khả năng đo chính xác tới 0,1 μm. Hình ảnh của từng phôi nuôi cấy ngày 1, ngày 3 và ngày 5 sẽ được lưu trữ dưới dạng file ảnh để đảm bảo thời gian phôi chịu phơi nhiễm được rút ngắn và kết quả khi phân tích không làm ảnh hưởng đến chất lượng của phôi nuôi cấy. Ảnh 2.1. Phần mềm đo đạc hình thái phôi RI-Research Instruments 2.2.6.1. Thu thập số liệu đối với phôi nuôi cấy ngày 1 Thời điểm đánh giá phân loại là: 17 ± 1 giờ tính từ thời điểm cho tinh trùng tiếp xúc với noãn đối với kỹ thuật IVF hoặc thời điểm tiêm tinh trùng vào trong noãn đối với kỹ thuật ICSI. Kỹ thuật viên nuôi cấy phôi sẽ tiến hành đánh giá số phôi thụ tinh bình thường, những phôi 2 tiền nhân (2PN), chụp ảnh trên kính hiển vi đảo ngược bằng phần mềm đo đạc RI - Research Instruments và kết hợp đánh giá phân loại chất lượng hợp tử theo tiêu chuẩn phân loại hợp tử