›
›

Giáo trình Kỹ thuật di truyền - Chương 1: Các vector sử dụng trong công nghệ chuyển gen ở động vật và thực vật

pdf 47 trang ngocly 3250
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Kỹ thuật di truyền - Chương 1: Các vector sử dụng trong công nghệ chuyển gen ở động vật và thực vật", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfgiao_trinh_ky_thuat_di_truyen_chuong_1_cac_vector_su_dung_tr.pdf

Nội dung text: Giáo trình Kỹ thuật di truyền - Chương 1: Các vector sử dụng trong công nghệ chuyển gen ở động vật và thực vật

  1. 1 Chương 1 Các vector sử dụng trong công nghệ chuyển gen ở động vật và thực vật I. Vector Trong sinh học, vector là một phân tử DNA có khả năng mang một đoạn DNA ngoại lai và khi xâm nhập vào loại tế bào chủ thích hợp thì có khả năng tự tái bản không phụ thuộc vào sự sao chép của hệ gen tế bào chủ. Nói cách khác, vector là một phương tiện truyền thông tin di truyền trong cơ thể hoặc giữa các cơ thể khác nhau. Tế bào chủ thường được sử dụng là vi khuẩn E.coli. Phần lớn các vector là các phân tử DNA dạng vòng nhỏ (plasmid) hoặc là bacteriophage. Vector có thể được cắt ở một vị trí xác định bằng một enzym hạn chế và được nối với một đoạn DNA tương hợp khác được cắt bởi cùng enzym. Trong tạo dòng phân tử, vector là rất cần thiết bởi vì thực tế cho thấy rằng một đoạn DNA chứa gen không thể làm gì trong tế bào chủ. Vì nó không phải là một bộ phận của genome bình thường của tế bào, cho nên nó sẽ không được tái bản khi tế bào phân chia, không được biểu hiện và có khả năng bị phân huỷ khá nhanh. Trong kỹ thuật di truyền, vector là công cụ có khả năng nghiên cứu genome người và genome các loài khác và sự sử dụng chúng trong nghiên cứu đang trở nên ngày càng phổ biến một cách rộng rãi. II. Các đặc tính của vector - Vector phải đủ lớn để mang DNA ngoại lai nhưng không quá lớn. - Vector phải chứa các trình tự kiểm soát (control sequences) như khởi điểm tái bản (origin of replication), promoter.
  2. 2 - Vector phải mang một hoặc nhiều vị trí nhận biết của enzym hạn chế. - Vector phải mang các gen marker chọn lọc (thường là các gen kháng chất kháng sinh). Vì vậy các tế bào chứa chúng có thể được phát hiện một cách dễ dàng. III. Các bước trong tạo dòng phân tử - Nối vector và đoạn DNA ngoại lai cần được tạo dòng trong ống nghiệm để tạo DNA tái tổ hợp nhờ sự xúc tác của enzym ligase. - Biến nạp DNA tái tổ hợp vào một dòng tế bào chủ. Chọn lọc thể biến nạp trên môi trường agar trong đĩa petri có chất kháng sinh. - Tách dòng DNA tái tổ hợp bằng cách sử dụng mẫu dò (probe). IV. Các vector sử dụng để chuyển gen ở động vật và thực vật 1. Các vector sử dụng để chuyển gen ở động vật 1.1. Vector sử dụng để thêm gen Phần lớn các vector sử dụng hiện nay để tạo động vật chuyển gen bằng cách thêm gen được xây dựng để được hợp nhất vào genome. Các phương pháp đang được sử dụng hoặc nghiên cứu để tăng tần số hợp nhất của gen ngoại lai hoặc duy trì chúng như là các nhiễm sắc thể nhỏ độc lập. 1.1.1. Vector thẳng tối thiểu (Minimum linear vectors) Ở đại đa số trường hợp, các nhà nghiên cứu sử dụng các đoạn genome chứa một hoặc hai gen hay chuẩn bị các cấu trúc gen hoạt động chức năng từ các yếu tố khác nhau. Các đoạn của vector chứa các vùng phiên mã và điều hòa từ plasmid. Thực vậy, các vector vòng hợp nhất với tần số thấp hơn nhiều so với các đoạn DNA thẳng và trình tự plasmid thường phá hủy các gen chuyển đã liên kết. Ðiều này đúng đối với các vector khác nhau như plasmid, cosmid, phage, BAC và YAC. Tuy nhiên một số nghiên cứu cho thấy rằng vector BAC vòng hợp nhất vào genome với hiệu quả giống như bản sao mạch thẳng của chúng. Nói cách khác, các vector mang các đoạn
  3. 3 Hình 1.1: : Tạo dòng bằng vector plasmid
  4. 4 DNA genome dài ít nhạy với hiệu quả câm của các trình tự của prokaryote. Ðiều này là thích hợp nhất nhờ sự hiện diện của các yếu tố cách ly ở các đoạn genome dài hoặc nhờ một hiệu quả khoảng cách đơn giản. Các đoạn DNA không chứa các trình tự đặc biệt hợp nhất vào genome với tần số tương đối thấp. Một số DNA xen vào tạo ra số động vật chuyển gen nhiều hơn so với các DNA khác. Ðiều này có thể xuất hiện từ sự có mặt của các trình tự trong đoạn xen mà nhận biết thường xuyên các trình tự genome (Hình 1). Một số các đoạn xen vào có thể chứa các trình tự ưu tiên cho sự phiên mã của chúng và sự duy trì của chúng trong phôi, tăng cường sự hợp nhất xảy ra. 1.1.2. Vector chứa các trình tự lặp lại Cơ chế của sự hợp nhất được mô tả ở hình 1 bao hàm sự nhận biết giữa các trình tự của đoạn xen và của genome. Tần số của sự hợp nhất được tăng lên nhờ sự có mặt ở cả hai đầu của các đoạn xen các trình tự lặp lại cao trong genome chủ ngay cả khi chúng bị thoái hóa nhiều hoặc ít. Ở bò, một trình tự có mặt nhiều ở tâm động làm tăng thêm các đoạn xen đã tăng tần số hợp nhất. Ở trường hợp đặc biệt này, các gen chuyển vẫn không hoạt động. Ðiều này là do tâm động là vùng không phiên mã của genome phá hủy gen chuyển. Một phương pháp tương tự đã được tiến hành ở chuột, sử dụng các trình tự Alu. Các trình tự này là các yếu tố lặp lại. Các trình tự Alu chứa 200-300 nucleotid là có nhiều trong genome động vật có vú và đặc biệt là ở các vùng lân cận hoặc ở trong các vùng phiên mã. Một số trình tự Alu được phiên mã bởi RNA polymerase III, làm cho chức năng của RNA không rõ ràng và có thể không tồn tại. Các thí nghiệm đã cho thấy rằng tần số hợp nhất được tăng lên đối với các đoạn xen chứa trình tự Alu. 1.1.3. Vector transposon Transposonlà một đoạn DNA có khả năng tự tái bản một cách độc lập và xen vào một vị trí mới trong cùng nhiễm sắc thể hoặc một nhiễm sắc thể khác (Hình 1.2). Với tiến bộ của kỹ thuật di truyền transposonđã được sửa đổi, thiết kế thành các công cụ di truyền với mục đích đặc biệt.
  5. 5 Hình 1.2: Cấu trúc của transposon Kích thước của transposon nói chung là không dài hơn 2kb. Nhiều bản sao của transposon có mặt trong genome tại các vị trí ngẫu nhiên một cách rõ ràng. Transposon được phiên mã thành RNA, RNA được phiên mã ngược thành DNA sợi kép. DNA sợi kép này hợp nhất vào genome với hiệu quả cao. Sự hợp nhất được điều khiển bởi gen transposase mã hóa transposon và các trình tự lặp lại đảo ngược ITR (inverted repeated sequence). Các trình tự lặp lại đảo ngược có mặt ở cả hai đầu của transposon (Hình 1.3). Cơ chế này cho phép transposon trải rộng ra một cách nhanh chóng và tỏa khắp genome, bao gồm cả sự bất hoạt gen trong một số trường hợp. Sự lan tỏa của transposon bị giới hạn bởi cơ chế tế bào làm bất hoạt sự phiên mã của transposon. Transposon là vector có tiềm năng đối với sự hợp nhất gen ngoại lai vào genome. Ðể làm được điều này, một phần lớn vùng phiên mã của transposon bị mất đi, tạo ra khoảng trống đối với gen ngoại lai và ngăn cản transposon trải rộng một cách tự chủ và không kiểm soát trong genome. DNA tái tổ hợp chứa gen ngoại lai không có khả năng đặc biệt để tự hợp nhất vào genome. Sự có mặt của gen transposase là cần thiết đối với mục đích này. Tiêm đồng thời transposon mang gen ngoại lai và plasmid vòng có khả năng biểu hiện gen transposase cho phép transposon hợp nhất với hiệu quả có ý nghĩa, khoảng 1-5 % số phôi được tiêm (Hình 1.3). Protocol này được áp dụng trước tiên cho Drosophila, sử dụng transposon P và sau đó đã được sử dụng rộng rãi để tạo sinh vật chuyển gen (Kayser, 1997). Transposon thủy thủ (mariner) đã tỏ ra có hiệu quả đối với tế bào cá medaka, gà và động vật có vú. Các sửa đổi khác nhau của transposon này làm cho nó có thể mang một vector hiệu quả và an toàn đối với liệu pháp gen (Hackett, 2001).
  6. 6 Các vector khác được sử dụng để tạo côn trùng chuyển gen như Aedes aegypti hoặc tằm (Tamura, 1999). Gần đây transposon đã được sử dụng để tạo chuột chuyển gen (Dupuy, 2002). Hình 1.3: Sử dụng vector transposon để chuyển DNA ngoại lai Gen transposase được thay thế bằng gen mong muốn. Transposon tái tổ hợp được tiêm vào tế bào. Vector điều khiển sự tổng hợp enzyme gắn (intergrase) được cùng tiêm vào. Transposon được hợp nhất bằng cách sử dụng các trình tự lặp lại đảo ngược ITR của chúng Trong tất cả các trường hợp, transposon và plasmid mã hóa cho transposase phải được tiêm vào tế bào chất của phôi dưới các điều kiện khác nhau tùy thuộc từng loài. Về phương diện này, gà là khác với hầu hết các loài khác. Việc tiêm gen có thể được thực hiện ở giai đoạn phôi một tế bào mà không thể đưa trở lại vào con mẹ nuôi dưỡng như trường hợp đối với thú. Phôi tiêm gen phải được đưa vào noãn hoàng của một trứng không mang phôi. Sau vài tuần ấp trứng dưới các điều kiện được kiểm soát tốt, gà chuyển gen được sinh ra với một tỉ lệ thành công có thể chấp nhận (Shermann, 1998).
  7. 7 Vì vậy, vector transposon cho phép tạo ra các động vật chuyển gen đối với các loài mà vi tiêm DNA thông thường không thành công. Vector này cũng được xem là an toàn. Vector transposon thủy thủ ngay cả khi thiếu gen transsposae của nó cũng có thể tái bản và hợp nhất vào genome chủ với tần số thấp. Ðiều này là do sự có mặt của transposase nội sinh của tế bào chủ. Vấn đề này có thể giới hạn sự sử dụng transposon trong một số trường hợp. Trong khi đó, transposon BAC lợn con đã được sử dụng để tạo ra tằm chuyển gen ổn định hoàn toàn sau một số thế hệ. Transposon chỉ có thể mang các đoạn DNA ngoại lai với chiều dài giới hạn. Các cấu trúc phức tạp được sử dụng để biểu hiện gen ngoại lai rõ ràng cũng là một hạn chế. Ngoài ra các cơ chế tế bào phá hủy transposon có thể ức chế sự biểu hiện của gen chuyển trong một số trường hợp. 1.1.4. Vector retrovirus a. Cấu trúc của retrovirus Retrovirus là loại virus RNA, có vỏ bọc bên ngoài. Sau khi xâm nhiễm, genome virus được sao chép ngược thành DNA sợi kép, hợp nhất vào genome tế bào chủ và biểu hiện thành protein. Retrovirus đặc trưng bởi chu kỳ tái bản của chúng, được mô tả lần đầu tiên vào đầu thập niên 1900 (Ellermann và Bang.O, 1908). Hạt retrovirus có kích thước, hình dạng có thể thay đổi đôi chút nhưng đường kính khoảng 100nm. Vỏ của virus là glycoprotein, tạo thành các gai ở màng (Hình 1.4A). Protein trưởng thành này được chia làm hai loại polypeptid (Hình 1.4B): - Glycoprotein vỏ bên ngoài (SU), kháng nguyên chủ yếu của virus, có chức năng bám vào thụ quan. - Glycoprotein màng (TM), bám vào protein SU ở vỏ, chịu trách nhiệm đối với sự dung hợp màng.
  8. 8 A B Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc cắt ngang của retrovirus A. Cấu trúc cắt ngang B. Cấu trúc protein vỏ Bên trong màng là protein cơ bản (MA), không định hình. Protein này bao lấy capsid (CA). CA là protein phong phú nhất trong hạt virus (chiếm khoảng 33 % trọng lượng tổng số), có hình khối 20 mặt. Bên trong capsid là lõi, thường có hình nón, bao gồm: RNA genome, protein nucleocapsid (NC), enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase = RT) và enzyme hợp nhất (intergrase = IN). Genome retrovirus bao gồm hai bản sao của phân tử RNA sợi đơn, mạch thẳng, có cap ở đầu 5’ và đuôi poly A ở đầu 3’ (tương đương với mRNA). Genome retrovirus có kích thước khoảng 8- 11kb. Retrovirus được chia làm hai loại là retrovirus đơn giản và retrovirus phức tạp. RNA của retrovirus đơn giản chứa 3 nhóm gen chủ yếu: - Gen gas mã hóa protein lõi, capsid và nucleoprotein. - Gen pol mã hóa enzyme phiên mã ngược và enzyme hợp nhất. - Gen env mã hóa protein trong cấu trúc vỏ của virus. Trật tự của các nhóm gen này ở tất cả các retrovirus là không thay đổi: 5’ – gag – pol – env – 3’
  9. 9 Ngoài ra còn có nhóm gen pro mã hóa enzyme protease viruss. Các retrovirus đơn giản bao gồm hầu hết các virus gây ung thư như viruss bạch cầu chuột Moloney Mo-MLV (Moloney, 1960), virus ung thư tuyến vú chuột (mouse mammary tumor virus = MMTV) (Bittner, 1936 ). Các retrovirus phức tạp, ngoài ba nhóm gen chủ yếu gag, pol và env còn có các gen khác như tat, rev ở HIV-1. Nhóm virus này bao gồm các lentivirus kể cả virus HIV-1, spumavirus, HFV (human foamy virus) và SFV (simian foamy virus). Ở mỗi đầu của genome là các đoạn lặp dài tận cùng (LTR) chứa tất cả các tín hiệu cần thiết cho sự biểu hiện gen của virus. Một đoạn LTR gồm có 3 vùng: U3, R và U5. Vùng U3 bao gồm các yếu tố kiểm soát sự phiên mã, promoter và gen tăng cường (enhancer). Ðây là vùng không mã hóa có kích thước 75-250 nucleotid, là phần đầu tiên của genome được phiên mã ngược, tạo ra đầu 3’ của genome provirus. Vùng R thường là trình tự có kích thước ngắn chỉ khoảng 18-250 nucleotid tạo thành đoạn lặp trực tiếp ở cả hai đầu của genome. Vùng U5 là vùng không mã hóa có kích thước 200- 1.200 nucleotid tạo nên đầu 5’ của provirus sau khi phiên mã ngược. vùng U5 mang vị trí poly A và cùng với vùng R xác định sự gắn thêm đuôi poly A vào. Cả hai vùng U3 và U5 đều mang vị trí gắn att cần thiết cho sự hợp nhất genome của virus vào genome chủ. Mặt khác, genome virus còn có đoạn dẫn đầu (leader), vị trí bám primer (primer binding site = PBS) và vùng polypurine (polypurine tract = PPT). Ðoạn dẫn đầu không được dịch mã, khá dài, có kích thước khoảng 90-500 nucleotid, xuôi theo vị trí khởi đầu phiên mã, nằm giữa vùng U3 và R, ở phía đầu 5’ của tất cả các virus mRNA. PBT dài 18 nucleotid bổ sung với đầu 3’ của primer tRNA đặc hiệu được virus sử dụng để bắt đầu phiên mã ngược. PTT ngắn chỉ khoảng 10 A hoặc G có chức năng khởi đầu sự tổng hợp sợi (+) trong quá trình phiên mã ngược. Hình 1.5 : Sơ đồ cấu trúc genome của retrovirus
  10. 10 Ngoài ra còn có các trình tự cần thiết cho sự đóng gói genome virus gọi là trình tự Ψ (psi) và các vị trí cắt RNA ở gen env. Một số retrovirus chứa protooncogene. Khi protooncogene bị đột biến có thể gây ra ung thư. b. Vector retrovirus Vector retrovirus là cấu trúc DNA nhân tạo có nguồn gốc từ retrovirus, được sử dụng để xen DNA ngoại lai vào nhiễm sắc thể của vật chủ. Yếu tố chìa khóa trong việc sử dụng retrovirus làm thể truyền phân phối gen là sự an toàn sinh học (biosafety). Mục đích chính của thiết kế vector là bảo đảm tạo ra một virus không khả năng tái bản (replication incompetent virus) trong tế bào chủ (Hình 1.6 ). Hình 1.6: Virus nguyên vẹn có khả năng tái bản và vector retrovirus không có khả năng tái bản Về nguyên tắc, có thể tạo ra vector retrovirus có khả năng tái bản (replication competent retroviral vector) bằng cách thêm các trình tự cần thiết vào virus (Hình 1.6). Nhưng một thiết kế phổ biến hơn là thay thế các gen của virus bằng các gen chuyển mong muốn để tạo ra vector tái bản không hoàn toàn (replication defective
  11. 11 vector). Mặt khác, kích thước của đoạn DNA ngoại lai mà vector tái bản không hoàn toàn có thể tiếp nhận lớn hơn nhiều so với vector có khả năng tái bản. Sự biểu hiện của các protein retrovirus ở hầu hết các retrovirus gây ung thư xảy ra tự nhiên do một promoter đơn (single promoter) nằm trong đoạn lặp dài tận cùng (LTR) ở đầu 5’và sự biểu hiện của các vùng mã hóa virus phức tạp xảy ra nhờ sự cắt ghép xen kẻ (alternative splicing). Tuy nhiên, việc thiết kế vector là không bị giới hạn do sử dụng promoter retrovirus đơn. Một hướng thiết kế khác là sử dụng promoter phức (multiple promoter) và các trình tự tiếp nhận ribosome ở bên trong (internal ribosome entry site = IRES). Sự tải nạp và hợp nhất gen có hiệu quả phụ thuộc vào các yếu tố virus có mặt trong vector retrovirus. Một điểm lưu ý quan trọng khi thiết kế vector retrovirus là hiệu quả tái bản của virus trong cấu trúc vector. Phần lớn các vector retrovirus thường được thiết kế dựa trên virus Mo-MLV. Ðây là loại virus có khả năng xâm nhiễm vào cả các tế bào chuột (có thể phát triển vector ở mô hình chuột) và tế bào người (có thể điều trị bệnh cho người). Các gen của virus (gag, pol và env) được thay thế bằng các gen chuyển mong muốn và được biểu hiện ở các plasmid trong dòng tế bào đóng gói. Các vùng cần thiết bao gồm các đoạn lặp dài tận cùng ở đầu 3’ và 5’ (3’LTR và 5’LTR) và trình tự đóng gói. Trước đây virus hỗ trợ khả năng tái bản đã được sử dụng để đóng gói cả virus vector và virus hỗ trợ. Trong một phương pháp tinh vi hơn được sử dụng hiện nay, các dòng tế bào đã thao tác di truyền đặc hiệu đã biểu hiện các gem virus do các promoter không tương đồng được sử dụng để tạo ra các virus vector. Các dòng tế bào này được gọi là các dòng tế bào đóng gói hoặc các dòng tế bào hỗ trợ. Chuyển gen và biểu hiện gen bằng một vector virus được gọi là sự tải nạp để phân biệt với quá trình xâm nhiễm của retrovirus có khả năng tái bản (replication competent retrovirus = RCR). Sự biểu hiện của gen chuyển là do promoter hoặc gen tăng cường ở vị trí 5’ LTR hoặc bởi các promoter virus (như cytomegalovirus, Rous sarcoma virus) hoặc bởi các promoter của tế bào (như beta actin, tyrosine). Sự định vị chính xác codon khởi đầu
  12. 12 của gen chuyển và các thay đổi nhỏ của 5’LTR ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen chuyển (Rivire,1995). Hình 1.7: Quá trình đóng gói tạo hạt retrovirus Hình 1.8: Cơ chế hoạt động của vector retrovirus
  13. 13 Ðể nhận biết các tế bào biến nạp, các marker chọn lọc như neomycin và beta galactosidase được sử dụng và sự biểu hiện của gen chuyển có thể được cải tiến bằng cách thêm vào các trình tự ribosome bên trong (Saleh, 1997). Một yêu cầu đối với sự hợp nhất và biểu hiện của các gen virus là các tế bào đích phải phân chia. Ðiều này giới hạn liệu pháp gen tăng sinh tế bào in vivo và ex vivo, do đó các tế bào thu nhận từ cơ thể được xử lý để kích thích tái bản và sau đó được tải nạp với retrovirus trước khi đưa trở lại bệnh nhân. c. Ứng dụng của vector retrovirus Vector retrovirus là cần thiết cho liệu pháp gen, đã được sử dụng có hiệu quả trong nhiều liệu pháp gen chữa bệnh cho người như suy giảm miễn dịch do thiếu hụt enzyme ADA, ung thư, tiểu đường, thiếu máu, Các vector retrovirus khác nhau đã được thiết kế để tạo động vật chuyển gen và gà chuyển gen đặc biệt (Ronfort, Legras và Verdier, 1997). Các vector này mang các trình tự env có khả năng nhận biết các tế bào phôi gà. Chúng được tiêm vào trứng gà mới đẻ. Ở giai đoạn này, các tế bào hãy còn đa năng và có thể tham gia vào việc tạo thành giao tử, dẫn đến truyền gen ngoại lai cho thế hệ sau. Phương pháp này cho hiệu quả không cao. Phôi ở giai đoạn này chứa khoảng 60.000 tế bào. Chỉ một tỉ lệ nhỏ các tế bào này có cơ hội mang gen chuyển nhờ vector retrovirus. Gà chuyển gen tạo thành ở dạng thể khảm và có rất ít cơ hội truyền gen chuyển của chúng cho thế hệ sau. Một phương pháp khác đã chứng tỏ có hiệu quả hơn. Việc tiêm gen được thực hiện ở giai đoạn phôi 16 tế bào tại vùng lân cận của các tế bào gốc nguyên thủy. Các tế bào này được tiêm một cách ưu tiên, tạo ra các động vật chuyển gen có cơ hội truyền gen chuyển của chúng cho thế hệ sau (Hình 1.9). Vector retrovirus cũng được sử dụng để chuyển gen vào noãn bào của bò và khỉ (Chen, 1998, 2001). Ðể tiến hành công việc này đòi hỏi hai điều kiện đặc biệt. Vỏ của vector là protein G của VSV (vesicular somatitis virus) có chức năng nhận biết màng phospholipid và vì vậy cho phép tiêm vào nhiều loại tế bào khác nhau. Các hạt virus được tiêm vào giữa màng trong (zona pellucida) và màng noãn bào vào lúc màng nhân đã biến mất, tạo cho genome
  14. 14 virus cơ hội tốt nhất để có thể đến được genome tế bào chủ (Hình 1.9). Lentivirus là một phân lớp của retrovirus. Chúng có khả năng hợp nhất vào genome của các tế bào ở pha nghỉ, cả các tế bào tăng sinh và tế bào không tăng sinh. Khả năng này có được là do sự có mặt của một tín hiệu ở một trong số các protein virus. Protein virus này nhắm tới genome của virus ở vùng nhân. Lentivirus phức tạp hơn các retrovirus đơn giản, chứa thêm 6 gen tat, rev, vpr, vpu, nef và vif. HIV là một loại lentivirus. Vector lentivirus được nghiên cứu nhiều do tiềm năng sử dụng của chúng trong liệu pháp gen. Hình 1.9: Sử dụng vector retrovirus để tạo động vật chuyển gen Genome virus mang gen ngoại lai được đưa vào tế bào tổng hợp protein virus khuyết. Các hạt virus được sử dụng để tiêm vào noãn bào động vật có vú (bò, khỉ), các tế bào mầm nguyên thủy của gà hoặc phôi một tế bào của chuột. Một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng vector lentivirus tiêm vào phôi một tế bào hoặc ủ với phôi đã được loại bỏ màng trong là có hiệu quả đặc biệt đối với việc chuyển gen vào chuột (Lois, 2003).
  15. 15 Các vector này ngày càng được cải tiến tinh vi hơn. Genome của chúng có nguồn gốc từ lentivirus đã tạo ra các hạt virus tái tổ hợp có khả năng nhiễm vào tế bào phân chia hoặc tế bào không phân chia. Vector này chứa LTR đã được sửa đổi dẫn đến sự tự bất hoạt genome virus đã hợp nhất. Ðiều này làm giảm đáng kể khả năng tái tổ hợp tạo ra virus xâm nhiễm mang gen ngoại lai với phương thức không kiểm soát. Các loại vector này không có các gen tăng cường. Sự vắng mặt các gen tăng cường làm cho nó có thể thay thế cho một promoter nội sinh điều khiển gen mong muốn hoạt động mà không lệ thuộc vào ảnh hưởng của các gen tăng cường LTR. Vector này cũng chứa một yếu tố điều hòa sau phiên mã ưu tiên cho việc biểu hiện gen và một đoạn của virus HIV mà đoạn này cho phép genome virus đi vào nhân của tế bào không phân chia và hợp nhất vào DNA chủ. Các vector này cũng có thể điều khiển sự biểu hiện gen FGFP của chuột, tạo ra màu xanh huỳnh quang ở tất cả các loại tế bào hoặc chỉ ở tế bào cơ khi promoter hoạt động ở tất cả các loại tế bào hoặc chỉ ở tế bào cơ. Lưu ý rằng khoảng 80% chuột sinh ra là chuột đã được chuyển gen. Khoảng 90% số chuột này biểu hiện gen chuyển của chúng ở một số thế hệ. Protein VSV đã được sử dụng như là một vỏ bọc cho phép xâm nhiễm hiệu quả vào phôi. Ưu điểm chính của vector này là hiệu quả biến nạp cao, thao tác đơn giản, sự xâm nhiễm có thể được thực hiện bằng cách ủ phôi đã loại bỏ màng trong với thể virus. Phương pháp này được mở rộng đối với các động vật có vú khác mà không có vấn đề đặc biệt. Phương pháp này thuận lợi một cách đặc biệt cho việc chuyển gen vào chuột trong khi phương pháp vi tiêm là rất khó sử dụng ở đây. Hạn chế của vector này cũng không ít. Các hạt virus phải được kiểm soát an toàn sinh học bằng biện pháp thích hợp. Bước này ngày càng được tiêu chuẩn hóa nhằm tăng cường sử dụng các loại vector này cho liệu pháp gen. Các đoạn DNA có kích thước không vượt quá 7-9kb có thể được đưa vào vector này. Sự biểu hiện của gen reporter là tương đối thấp trong trường hợp này. Mặt khác, sự hợp nhất độc lập của vector xảy ra trong cùng một phôi dẫn đến động vật chuyển gen thể khảm.
  16. 16 Rõ ràng, phương pháp này chỉ có thể thay thế vi tiêm trong một số trường hợp. 1.1.5. Vector Adenovius a. Cấu trúc của adenovirus Adenovirus là loại virus không có vỏ, chứa genome DNA sợi kép, mạch thẳng. Trong khi có hơn 40 dòng adenovirus typ huyết thanh phần lớn gây nhiễm trùng đường hô hấp ở người thì chỉ có nhóm phụ C typ huyết thanh 2 hoặc 5 được sử dụng làm vector một cách ưu thế. Chu trình sống của adenovirus thường không liên quan đến sự hợp nhất vào genome vật chủ, chúng tái bản như các yếu tố episome trong nhân của tế bào chủ và vì vậy không có nguy cơ phát sinh đột biến xen (insertional mutagenesis). Tất cả các hạt adenovirus đều không có vỏ, đường kính 60- 90nm. Chúng có tính đối xứng icosahedron, dễ dàng nhìn thấy dưới kính hiển vi điện tử khi nhuộm âm tính. Vỏ capsid của adenovirus bao gồm 252 capssomer. Lõi của hạt virus chứa tối thiểu 4 protein: protein đầu mút (terminal protein = TP), gắn với đầu 5’ của genome bằng liên kết đồng hóa trị; protein V (180 bản sao/hạt virus) và protein VII (1070 bản sao/hạt virus), là các protein cơ bản và protein Mu, một protein nhỏ (4kD), vị trí và chức năng chưa được biết. A B Hình 1.10: Adenovirus A. Mô hình cấu trúc không gian adenovirus B. Aenovirus nhìn dưới kính hiển vi điện tử
  17. 17 Hình 1.11: Sơ đồ cấu trúc cắt ngang của adenovirus Genome của adenovirus là phân tử DNA sợi kép không phân đoạn, dài 30-38kb (các nhóm khác nhau có kích thước khác nhau), có thể mã hóa 30-40gen. Có 4 vùng gen phiên mã sớm là E1, E2, E3 và E4, có chức năng điều hòa và một sản phẩm phiên mã muộn mã hóa cho các protein cấu trúc. Các trình tự ở đầu mút của mỗi sợi là lặp lại đảo ngược vì vậy các sợi đơn đã biến tính có thể tạo ra cấu trúc “cán xoong” (“panhandle”). Ngoài ra, còn có protein 55kD liên kết với đầu 5’ của mỗi sợi bằng liên kết đồng hóa trị. b. Vector adenovirus Vector adenovirus là vector chuyển gen được tạo ra từ các adenovirus tái tổ hợp. Thế hệ adenovirus tái tổ hợp đầu tiên đã được thiết kế bằng cách loại bỏ gen E1. Sự loại bỏ gen E1 làm cho virus không có khả năng tái bản trong tế bào chủ. Gen E3 thường cũng được loại bỏ để dành chỗ cho gen chuyển. Phần genome mã hóa protein cấu trúc của virus được thay thế bằng một gen marker (như β-galactosidase) hoặc gen cDNA liệu pháp. Phần lớn các vector “cán xoong” được thiết kế
  18. 18 gần đây chỉ chứa một trình tự lặp lại đảo ngược ITR và một trình tự đóng gói. Tất cả các gen cần thiết của virus được cung cấp bởi virus hỗ trợ. Vector virus này không hợp nhất vào nhiễm sắc thể tế bào và nó tồn tại như một episome ở trong nhân. Adenovirus là một vector chuyển gen an toàn, có thể xâm nhiễm một cách hiệu quả vào các tế bào không phân chia và các tế bào đang phân chia của nhiều loại tế bào khác nhau do các loại tế bào đích này chứa các thụ quan phù hợp với adenovirus. Khi xâm nhiễm vào tế bào chủ, phần lõi mang genome virus và gen ngoại lai đi qua lỗ màng nhân. Trong nhân tế bào chủ, các gen của adenovirus và gen ngoại lai sẽ phiên mã và dịch mã trong tế bào chất để tạo nên các loại protein cần thiết cho virus và protein mong muốn do gen ngoại lai mã hóa. Hạn chế của vector adenovirus thứ nhất là giảm khả năng sinh miễn dịch và vị trí ở ngoài nhiễm sắc thể của nó làm cho sự biểu hiện gen chỉ nhất thời, không bền. Kết quả của một số nghiên cứu đã cho thấy rằng sự biểu hiện gen chuyển chỉ kéo dài từ một vài ngày đến một vài tuần. Hình 1.12: Cơ chế hoạt động của vector adenovirus
  19. 19 Ðể khắc phục những vấn đề nêu trên, các thế hệ adenovirus thứ hai và thứ ba đã được tạo ra. Trong các vector này, gen E4 (hoặc E2) mã hóa nhiều protein của virus được loại bỏ để giảm sự biểu hiện các protein virus. c. Ứng dụng của vector adenovirus Adenovirus người thế hệ thứ nhất đã được sử dụng rộng rãi làm vector chuyển gen in vivo (Wilson, 1996). Các vector này đã được sử dụng để chuyển gen người in vivo vào tế bào mũi, tế bào phổi (CFTR cDNA), tế bào màng trong mạch, tế bào thận (Heikkila, 1996; Sukhatme, 1997), tim, gan, hệ thần kinh trung ương, cơ, các tế bào mô máu và tế bào ung thư (Jaffe, 1992; Engelhardt, 1993; Chen, 1994; Chang, 1995; Cussack, 1996; Simon, 1999). Merrrich (1996) đã so sánh tính lây nhiễm của adenovirus tái tổ hợp typ 5 tái bản không hoàn toàn ở các tế bào màng trong mạch trong môi trường nuôi cấy in vitro. Kết quả cho thấy trong môi trường nuôi cấy, sự lây nhiễm là tốt ở cả tế bào màng trong mạch của người và lợn. 1.1.6. Vector episome Lợi thế của quá trình hợp nhất khi sử dụng vector này là DNA ngoại lai được truyền một cách ổn định cho thế hệ sau. Hạn chế chính là sự hợp nhất hiếm xảy ra. Một vấn đề khác là gen đã hợp nhất bị phụ thuộc vào hoạt động của môi trường chromatin của nó, làm thay đổi thường xuyên sự biểu hiện của gen chuyển. Mặt khác, số lượng bản sao hợp nhất bị hạn chế, nói chung là không vượt quá 10 và trong một số trường hợp không phải tất cả các bản sao này được phiên mã có hiệu quả. Người ta đang mong muốn loại bỏ phần lớn các hạn chế này khỏi vector episome. Genome episome đã được phát hiện trong một số cơ thể sống. Ðây là trường hợp đối với vi khuẩn chứa nhiều plasmid. Thỉnh thoảng các đoạn nhiễm sắc thể có nguồn gốc từ sự suy thoái cục bộ của nhiễm sắc thể được tìm thấy trong tế bào, đặc biệt trong một số tế bào khối u. Các đoạn nhiễm sắc thể này là các nhiễm sắc thể nhỏ (minute chromosome) được tái bản một cách độc lập và truyền lại cho các tế bào con. Các lớp virus khác nhau có genome tái bản một cách độc lập và truyền lại cho các tế bào con. Ðây là trường hợp đối với các virus họ herpes.
  20. 20 Genome episome phải chứa một số các yếu tố để được bền vững. Genome episome có dạng vòng hoặc dạng thẳng. Khi ở dạng vòng, thành phần nhỏ nhất của chúng là khởi điểm tái bản. Tại khởi điểm tái bản này sự tổng hợp DNA được bắt đầu như là một hệ thống làm cho nó có thể truyền genome tái bản đến các tế bào con. Genome episome dạng thẳng phải mang telomere ở cả hai đầu. Cấu trúc telomere này có mặt ở các đầu mút của các nhiễm sắc thể bình thường. Chúng thường xuyên bị suy thoái bởi exonuclease và được phục hồi lại nhờ một phức hợp enzyme đặc hiệu. Telomere bảo vệ nhiễm sắc thể khỏi bị suy thoái bởi exonuclease. Khi tế bào già hơn, sự tổng hợp telomere trở nên ít hiệu quả hơn dẫn đến suy thoái nhiễm sắc thể và sự chết của tế bào. Các loại vector episome khác nhau có thể được thiết kế để tạo động vật chuyển gen. Chúng có kích thước tương đối nhỏ, chỉ mang các yếu tố tái bản và truyền lại cho các tế bào con. Một phương pháp khác bao gồm sự sử dụng các đoạn nhiễm sắc thể mang tất cả các yếu tố tự nhiên để chuyển gen cho thế hệ sau. Các vector episome được biết rõ và sử dụng thường xuyên nhất là plasmid, cosmid, phage, BAC và YAC. Không có một loại vector nào có thể được sử dụng ở eukaryote bậc cao do các yếu tố của chúng không hoạt động trong các tế bào động vật. Các vector này được sử dụng chủ yếu là để xây dựng DNA và tạo DNA tái tổ hợp để nghiên cứu và chuyển vào tế bào động vật. Các vector vi khuẩn chỉ chứa một khởi điểm tái bản. Số bản sao tạo ra sau khi tái bản DNA là đủ để cho phép truyền vector có tính thống kê đến các tế bào con. Vector YAC dạng thẳng đã được thiết kế (Hình 1.13). YAC chứa các telomere, một khởi điểm tái bản (ARS 1), một tâm động (CEN 4), một gen chọn lọc (Ura 3) và các vị trí tạo dòng. Vector này tương đối ngắn và dễ thao tác. Sở dĩ như vậy là do khởi điểm tái bản và tâm động ngắn. Khởi điểm tái bản của nấm men Saccharomyces cerrevisae được tập trung trong một vùng genome ngắn trong khi ở Saccharomyces pombe khởi điểm tái bản dài đến trên vài nghìn base. Vector YAC có thể mang các đoạn DNA dài 1000kb và chúng có thể được thiết kế trong nấm men bằng tái tổ hợp tương đồng. Hạn chế chủ yếu của vector YAC là không ổn định (Giraldo và Montoliu, 2001).
  21. 21 Hình 1.13: Cấu trúc của vector YAC Vector này chứa một khởi điểm tái bản DNA (ARS 1), một tâm động (CEN 4) làm cho nó có thể phân chia vector tái bản về các tế bào con, telomere bảo vệ DNA khỏi bị suy thoái bởi exonuclease, hai gen chọn lọc (TRP 1 và UR 3) và một vị trí tạo dòng mà có thể đưa vào một đoạn có kích thước lên đến 1000kb Vector BAC đã được thiết kế để tái bản trong E.coli và chỉ hiện diện một bản sao trong mỗi tế bào. Chúng có thể mang các đoạn DNA có kích thước lên đến 250kb. Chúng có thể được xây dựng trong vi khuẩn bằng tái tổ hợp tương đồng. Ðiều này cho phép cả việc đưa các đoạn DNA ngoại lai vào trong vector cũng như loại bỏ chúng đi. Vector BAC hiện là công cụ tốt nhất cho việc chuẩn bị các cấu trúc mang các đoạn DNA có kích thước lớn để dùng cho việc tạo động vật chuyển gen (Giraldo và Montoliu, 2001) (Hình 1.14). Hình 1.14: Sơ đồ cấu trúc vector BAC
  22. 22 Trong tế bào động vật, vẫn không thể tạo ra các vector ngắn mang các yếu tố tự nhiên đã tìm thấy trong nhiễm sắc thể. Khởi điểm tái bản ở genome động vật là các vùng xác định không tốt. Một số vùng đã được mô tả đặc điểm và được sử dụng để tái bản DNA trong tế bào nuôi cấy và trong chuột chuyển gen. Như thế đoạn DNA genome chứa vài nghìn bp là luôn được yêu cầu để khởi đầu một quá trình tái bản DNA. Một phương pháp khả thi là tạo dòng các đoạn DNA genome vào vector và chọn lọc các đoạn có khả năng tái bản cao nhất trong tế bào động vật. Thí nghiệm này đã cho thấy rằng tối thiểu một khởi điểm tái bản là có mặt trong một đoạn DNA động vật có kích thước khoảng 40kb (Kelleher, 1998). Các khởi điểm tái bản là không thích hợp để cho một vector vòng được truyền một cách có hiệu quả đến các tế bào con và thế hệ động vật con. Một nghiên cứu được tiến hành cách đây vài năm cho thấy rằng vector chứa một hỗn hợp các khởi điểm tái bản động vật trong một plasmid có hiệu quả cao đối với việc tạo chuột chuyển gen. Vector này có thể được truyền từ chuột sang vi khuẩn, từ vi khuẩn sang phôi lợn và từ phôi lợn quay trở lại vi khuẩn (Attal, 1997). Tuy nhiên vector này không ổn định khi xen một gen vào trong nó. Hơn nữa nó không được duy trì trong suốt đời sống của chuột và không được truyền lại cho thế hệ con. Vì vậy vector này chứa một khởi điểm tái bản có hiệu quả đối với sự truyền lại có tính chất thống kê trong quá trình phân chia tế bào nhanh nhưng không có hiệu quả trong quá trình phân chia tế bào chậm. Điều này được giải thích là do vector này không mang bất kỳ yếu tố nào đóng vai trò của tâm động. Nhiễm sắc thể eukaryote chứa các trình tự lặp lại ở phần trung tâm của chúng. Các trình tự lặp lại này bám vào bộ khung tế bào (cytoskeleton) trong suốt quá trình nguyên phân, cho phép các nhiễm sắc thể được phân chia về các tế bào con với phương thức thích hợp. Vùng tâm động đã được thêm vào một vài vector episome. Các đoạn tâm động rất dài tất nhiên được sử dụng và chúng mang tính đặc hiệu loài. Vì vậy không thể sử dụng chúng để thiết kế các vector ngắn. Một số virus có genome dạng vòng tái bản với tần số cao trong tế bào động vật và vì vậy được truyền lại cho các tế bào con có tính chất thống kê. Đây là trường hợp của virus SV40.
  23. 23 Khởi điểm tái bản của virus SV40 đã được nghiên cứu kỹ. Khởi điểm này có kích thước ngắn nhưng cần có kháng nguyên T mã hoá bởi genome SV40 và các thành phần tế bào Linh trưởng để tái bản. Vector SV40 chuyển vào tế bào tổng hợp kháng nguyên T (tế bào Cos) được sử dụng phổ biến để biểu hiện gen ngoại lai với tần số cao. Vector này không tái bản trong các tế bào không thuộc bộ Linh trưởng và vì vậy không thể sử dụng để tạo động vật chuyển gen. Virus herpes ở trạng thái tiềm sinh trong các tế bào nhiễm. Mỗi tế bào chứa một hoặc vài bản sao genome virus mà các bản sao này được truyền cho các tế bào con. Trong những trường hợp nhất định và đặc biệt khi cơ thể bị nhiễm suy giảm miễn dịch, genome virus tái bản với tần số cao gây ra trạng thái bệnh lý có liên quan. Đây là trường hợp đối với virus Herpes simplex, cytomegalovirus, virus Epstein-Barr và một số virus khác. Các virus này có khởi điểm tái bản và một hệ thống tâm động giả (pseudocentromeric system). Hai yếu tố này đã được nghiên cứu một cách chi tiết ở virus Epstein-Barr (EBV). Các vùng có kích thước nhỏ nhất cần thiết cho sự tái bản của genome EBV và sự di truyền của chúng cho các tế bào con là vùng khởi điểm tái bản P (ori P) và gen EBNA 1 (Epstein-Barr nuclear antigen). Vùng khởi điểm tái bản P chứa hai vùng có chức năng riêng biệt. Cả hai đều bám vào protein EBNA 1. Một vùng của khởi điểm tái bản P làm đúng chức năng khởi điểm tái bản. Vùng thứ hai là cần cho sự truyền genome của virus cho các tế bào con. Các kết quả nghiên cứu đã cho thấy rằng khởi điểm tái bản của EBV chỉ hoạt động ở tế bào Linh trưởng và chó. Khởi điểm tái bản EBV có thể bị mất và được thay thế bằng các đoạn DNA genome người hoặc các động vật có vú khác. Một số các đoạn DNA genome này chứa một khởi điểm tái bản cho phép vector tái bản và truyền lại cho các tế bào con ngay cả ở chuột chuyển gen (Kelleher, 1998). Tuy nhiên vẫn chưa có bằng chứng chứng minh rằng các vector ổn định và đã truyền lại cho thế hệ con. Trong tất cả các trường hợp, vector EBV phải mang gen EBNA 1 và vùng khởi điểm tái bản P để cho protein EBNA 1 này bám vào. Hệ thống EBV EBNA 1-ori P không mang tính đặc hiệu loài. Các vector chứa phức hợp EBNA 1-ori P bám không đặc hiệu
  24. 24 vào chromatin trong các tế bào eukaryote khác nhau. Một nghiên cứu mới đây cho thấy rằng EBNA 1 bám vào ori P và protein EBP 2 nhận ra các thành phần chưa biết được ở chromatin (Hình 1.15 ). Một vector vòng mang vùng ori P bám vào EBNA 1 và một khởi điểm tái bản nấm men đã được duy trì hoàn toàn hiệu quả ở nấm men biểu hiện cả các gen EBNA 1 và EBP người (Kapoor, Shire và Frappier, 2001). Điều này cho phép đưa ra giả thuyết là vector episome mang một khởi điểm tái bản hoạt động ở tế bào chuột và các gen mã hoá protein EBNA 1 và EBP 2 có thể được duy trì như vector vòng episome trong suốt đời sống của động vật và truyền lại cho thế hệ con. Genome EBV có kích thước 200kb và vector EBV có thể mang đoạn DNA ngoại lai có kích thước trên 100kb. Vector chứa khởi điểm tái bản SV40 và một trình tự MAR cũng có khả năng duy trì ổn định như các episome trong tế bào nuôi cấy (Jenke, 2002). Các loại vector này hiện đã được nghiên cứu ở các phòng thí nghiệm là các vector con thoi (shuttle) vì chúng mang cả hệ thống tái bản của prokaryote và eukaryote. Chúng có thể được truyền đến vi khuẩn đường ruột (intestine bacteria) và gieo rắc vào trong môi trường. Điều này có thể tránh được một cách dễ dàng bằng cách loại bỏ khởi điểm tái bản của prokaryote. Khả năng thiết kế các vector độc lập khác bao gồm sự sử dụng các đoạn DNA genome dài chứa các khởi điểm tái bản tự nhiên, một tâm động và các telomere. Các vector này là các nhiễm sắc thể nhân tạo của người (HAC), chỉ có thể có được sau khi xảy ra các đột biến ngẫu nhiên loại bỏ đi một phần lớn nhiễm sắc thể nhưng giữ lại các yếu tố nhỏ nhất để tạo ra một hệ thống tự chủ (Vos, 1998; Voet, 2001). Thao tác đối với vector này không dễ dàng và rất khó để đưa gen ngoại lai vào trong chúng. Hơn nữa, các đoạn genome dài này chứa nhiều gen có thể can thiệp vào sinh lý học động vật hoặc can thiệp vào gen quan tâm khi nó được thêm vào vector. Nhiễm sắc thể chuột có kích thước 60Mb bao gồm DNA vệ tinh quanh thể trung tâm của chuột đã được tạo ra trong một dòng tế bào lai động vật gậm nhấm/người. Cấu trúc này đã được duy trì trong một thời gian dài trong tế bào nuôi cấy, ở chuột chuyển gen và đã truyền lại cho thế hệ sau (Co, 2000).
  25. 25 Hình 1.15: Cấu trúc của vector episome vòng dựa trên genome virus Epstein-Barr (EBV) Protein EBNA 1 được mã hoá bởi genome EBV bám vào một vùng khác của genome EBV. Protein EBNA 1 bám vào một protein của tế bào là EBP 2. Protein EBP 2 liên kết với các yếu tố không đặc hiệu của chromatin. Hệ thống giống như tâm động này cho phép truyền vector cho các tế bào con. Khởi điểm tái bản của EBV hoạt động hầu như riêng biệt trong các tế bào Linh trưởng. Một nghiên cứu cách đây vài năm cho thấy rằng nhiễm sắc thể số 2 của người có thể được chuyển vào genome chuột. Nó đã tồn tại và truyền lại cho thế hệ sau. Nhiễm sắc thể số 2 của người đã được chuyển từ nguyên bào sợi người đến tế bào gốc phôi chuột
  26. 26 bằng dung hợp tế bào. Các tế bào gốc phôi mang nhiễm sắc thể người được sử dụng để tạo chuột chuyển gen thể khảm. Chuột chuyển gen thể khảm này đã biểu hiện gen globulin miễn dịch (immunoglobulin) nằm trên nhiễm sắc thể số 2. Vì vậy có thể thu được các kháng thể đơn dòng người từ những con chuột này (Tomizuka, 1997). Vector episome sẽ hoàn toàn hữu dụng cho các nhà nghiên cứu, cho việc nghiên cứu gen trong các tế bào bị nhiễm cũng như đối với liệu pháp gen và việc tạo động vật chuyển gen. 1.2. Vector thay thế gen Một tái tổ hợp tương đồng giữa hai đoạn DNA có thể xảy ra trong các cơ thể khác nhau nếu chúng mang một trình tự DNA chung. Ở vi khuẩn kích thước cần thiết của đoạn DNA này là một vài trăm bp, ở nấm men tối thiểu là 20-50bp và ở tế bào động vật là vài ngàn bp để gây nên tái tổ hợp tương đồng. Cơ sở của cơ chế tái tổ hợp tương đồng được mô tả ở hình 1.16. Nếu một trình tự tương đồng đơn có mặt trong genome và DNA ngoại sinh thì sự tái tổ hợp dẫn đến sự hợp nhất đích (targeted intergration) của DNA ngoại lai (Hình 1.17). Nếu hai trình tự tương đồng khác biệt hiện diện trong DNA ngoại sinh thì hai tái tổ hợp tương đồng xảy ra một cách độc lập dẫn đến sự thay thế riêng biệt một vùng genome (Hình 1.16). Vì vậy một trình tự ngoại lai có thể được hợp nhất một cách chính xác vào vị trí đã cho của genome. Trình tự ngoại lai này có thể làm ngắt quãng gen đích, làm cho nó trở nên bất hoạt. Protocol này được gọi là knock-out gen. Trình tự ngoại lai có thể là một gen hoạt động có thể liên quan hoặc không liên quan với gen đích. Sự hợp nhất này được gọi là knock-in gen. 1.3. Vector sắp xếp lại các gen đích Tái tổ hợp tương đồng trong một genome là sự kiện sinh lý quan trọng xảy ra trong các trường hợp khác nhau. Sự sắp xếp lại genome tạo ra các gen globulin miễn dịch hoạt động chức năng là một ví dụ. Thật là quan trọng để sắp xếp lại genome ở các vị trí mà không thể tiến hành một cách tự nhiên với một phương thức kiểm soát.
  27. 27 Hình 1.16: Sự chọn lọc dương tính và âm tính kép để tách chiết tế bào mà tái tổ hợp tương đồng xảy ra A. Tái tổ hợp tương đồng bao hàm sự hợp nhất của gen neor và loại đi gen TK. Các tế bào này là kháng với G418 và gancyclovir. B. Sau sự hợp nhất của vector vào một vị trí ngẫu nhiên, các tế bào kháng với G418 nhưng nhạy cảm với gancyclovir Hai hệ thống không phát hiện thấy trong giới động vật đã được bổ sung để thực hiện điều này. Một hệ thống có nguồn gốc từ bacteriophage P1. Genome này chứa các trình tự LoxP với kích thước 34 bp, có khả năng tái kết hợp và mang tính đặc hiệu cao chỉ khi có mặt enzyme recombinase của phage Cre. Hệ thống thứ hai là tương tự một cách cơ bản nhưng có nguồn gốc khởi đầu từ nấm men. Trình tự FRT tái kết hợp với hiệu quả cao và mang tính đặc hiệu khi có mặt enzyme recombinase Flp. Hệ thống Cre-LoxP là phổ biến nhất và được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác nhau (Nagy, 2000). Các thể đột biến khác nhau của các trình tự LoxP, FRT đang được sử dụng để điều chỉnh hiệu quả và tính đặc hiệu của sự tái tổ
  28. 28 hợp. Hai loại enzyme recombinase cũng tồn tại dưới dạng các thể đột biến khác nhau. Trong thực tế, trình tự LoxP hoặc FRT phải được thêm vào cấu trúc của gen. Hình 1.17: Sự thay thế gen bằng thể đột biến sử dụng tái tổ hợp tương đồng kép Ưu điểm chính của các hệ thống LoxP và FRT là sự tái tổ hợp chỉ xảy ra khi có mặt recombinase. Các tế bào hoặc động vật có vùng DNA tiếp giáp với các trình tự LoxP thì không có recombinase. Các enzyme này có thể được bổ sung vào trong tế bào in vitro hoặc in vivo ở động vật chuyển gen bằng cách vi tiêm trực tiếp vào tế bào chất hoặc bằng phương pháp chuyển nhiễm (transfection method) đối với protein. Gen recombinase có thể được
  29. 29 đưa vào tế bào bằng vector adenovirus. Các vector này được tiêm vào mô của động vật chuyển gen mang vùng DNA tiếp giáp với các trình tự LoxP. Hơn nữa, plasmid chứa các gen recombinase cũng có thể được đưa vào phôi giai đoạn một tế bào hoặc vào các tế bào soma. Các plasmid này có ít cơ hội hợp nhất do cấu trúc dạng vòng của chúng. Chúng biến mất nhanh chóng trong quá trình nhân tế bào và sự có mặt của recombinase là nhất thời. Các recombinase cũng có thể được truyền cho động vật chuyển gen bằng sự chuyển gen. Chuột chuyển gen mang gen recombinase có thể được lai với các dòng chứa vùng DNA tiếp giáp với trình tự LoxP. Một cách lý tưởng, các gen recombinase không nên biểu hiện ở nhiều trường hợp trong tất cả các mô hoặc biểu hiện thường xuyên. Nếu điều này là cần thiết thì recombinase có thể được đặt dưới sự kiểm soát của các promoter hoạt động trong tất cả các loại tế bào. Trái ngược lại, các promoter đặc hiệu đối với từng mô có thể hạn chế sự tái tổ hợp LoxP trong tế bào mà các promoter này hoạt động. Hệ thống biểu hiện này đã kiểm soát bởi tetrecycline và các dẫn xuất của tetracycline, cho phép gen recombinase chỉ được biểu hiện trong một loại tế bào và chỉ khi động vật có tetracycline. Một bước điều hoà khác có thể thêm vào để kiểm soát recombinase Cre. Các gen dung hợp mang trình tự mã hoá recombinase Cre và một phần các thụ quan steroid đã được xây dựng. Protein dung hợp này chỉ hoạt động khi có mặt steroid và steroid đã gây ra sự biến đổi hình thể của protein. Trình tự NLS (nuclear localization signal = tín hiệu định vị nhân) cho phép recombinase tập trung ở nhân và đạt hiệu quả ngay cả khi ở nồng độ thấp. Trường hợp này có thể xảy ra phụ thuộc vào tính đặc hiệu tế bào nhưng các promoter yếu đang được sử dụng để biểu hiện các gen recombinase. Tất cả các hệ thống tinh vi này nhằm gây ra sự tái tổ hợp có thể càng chính xác để giống hệt như sự biểu hiện các gen tự nhiên hoặc để tạo ra các điều kiện thí nghiệm thích hợp nhất. Điều quan trọng là tránh sự biểu hiện cao của gen ricombinase. Các enyzme này bộc lộ một vài độc tính đối với tế bào ở nồng độ cao, còn hầu như là thích hợp nhờ khả năng nhận biết các vị trí giống như LoxP hoặc FRT trong genome động vật.
  30. 30 2. Các vector sử dụng để chuyển gen ở thực vật 2.1. Các vector biến nạp vào tế bào thực vật sử dụng Agrobacterium 2.1.1. Sự gây ra các khối u do Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens và A. rhizogenes là hai loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình chóp (crown gall) (Hình 1.18 và hình 1.19 ) và bệnh lông rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm. Chỉ rất ít thực vật một lá mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối u hình chóp. Lý do giới hạn vật chủ này hiện nay còn chưa được biết. Một lần khởi đầu, sự sinh trưởng khối u có thể tiếp diễn khi vắng mặt vi khuẩn và mô khối u có thể được sinh trưởng vô trùng bằng nuôi cấy mô trong các môi trường thiếu sự bổ sung auxin và cytokinin ngoại sinh mà bình thường là cần thiết để xúc tiến sự sinh trưởng của mô thực vật in vitro. Mô khối u tổng hợp amino acid mới và các dẫn xuất của đường được biết chung là opine. Loại opine tổng hợp trong khối u (ví dụ như nopaline, octopine, agrocinopine, mannopine và agropine) phụ thuộc vào dòng Agrobacterium khởi đầu sự hình thành khối u. Octopine và nopaline là hai loại opine có nguồn gốc từ arginine và dễ dàng phát hiện nhất trong mô khối u hình chóp. Do đó nhiều dòng Agrobacterium tumefacien phổ biến được thiết kế theo kiểu octopine hoặc nopaline. Agropine, một dẫn xuất của đường được tìm thấy phổ biến trong các khối u lông rễ gây ra bởi A. rhizogenes. Agrobacterium chịu trách nhiệm đối với sự hình thành khối u dị hóa một cách có chọn lọc opine mà nó tổng hợp được và sử dụng opine như là một nguồn cacbon và nitơ. Cả việc gây ra khối u và tổng hợp opine liên quan với sự có mặt của một loại plasmid có kích thước lớn là Ti-plasmid (Tumour inducing =Ti= gây ra khối u) trong tế bào vi khuẩn A. tumefaciens và Ri-plasmid (Root inducing = Ri = gây ra lông tơ) ở A. rhizogenes.
  31. 31 Hình 1.18: Bệnh khối u hình chóp Hình 1.19: Các khối u hình ở cây mâm xôi (Rubus) do chóp ở cành táo A.tumefaciens gây ra Hình 1.20: Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 2.1.2. Ti-plasmid của Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid (Hình 1.21A)được tìm thấy trong tất cả các dòng A.tumefaciens gây độc, có kích thước khoảng 200-250 kb. Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở nhiệt độ dưới 30oC. Bằng phương pháp lai DNA-DNA và lập bản đồ chuỗi kép dị hợp (heteroduplex mapping), người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng. Kết quả phân tích di truyền cho thấy vùng T-DNA (transferred DNA) và vùng gây độc (virulence) liên quan đến sự hình thành khối u trong khi hai vùng khác liên quan đến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong Agrobacterium. Trong khi hình thành khối u, T-DNA được chuyển vào tế bào thực vật và hợp nhất với genome nhân. T-DNA ổn định trong
  32. 32 genome nhân. Lai Ti-plasmid với DNA của khối u đã cho thấy T- DNA trong tế bào thực vật là tương ứng song song với T-DNA trong Ti-plasmid của Agrobacterium. Kết quả này chứng tỏ không có sự sắp xếp lại vị trí của T-DNA trong lúc khối u được tạo thành. Một hoặc nhiều bản sao của T-DNA có thể có mặt ở các đoạn lặp nối tiếp. Chúng cũng có thể tách ra và liên kết với các vùng khác nhau của DNA thực vật. Vị trí hợp nhất của T-DNA vào DNA thực vật là hoàn toàn ngẫu nhiên. Các vùng tương đồng với T-DNA đã được tìm thấy ở các Ti-plasmid khác nhau (Hình 1.21B ). Trong các dòng A.tumefaciens kiểu nopaline được sử dụng phổ biến. Vùng T-DNA có kích thước khoảng 24 kb. Ở một số khối u hình chóp kiểu octopine, hai đoạn không kề nhau đã được tìm thấy là TL và TR. TL có kích thước 14 kb, có mặt trong tất cả các dòng tế bào đã biến nạp và có chức năng tương đương với T-DNA ở các dòng tế bào nopaline. TR có kích thước 7 kb, được hình thành từ phía bên phải của TL- DNA trong Ti- plasmid, không phát hiện thấy trong tất cả các dòng khối u nhưng khi số bản sao của nó khác với TL người ta giả thiết là đã xảy ra một quá trình chuyển độc lập. T-DNA được phiên mã trong các tế bào khối u (Hình 1.23B), tạo ra nhiều mRNA polyadenyl. Các loại sản phẩm phiên mã của T- DNA tích lũy lại là tương đối thấp so với các mRNA của thực vật khác. Giải trình tự T-DNA kiểu nopaline đã cho thấy có 13 khung đọc mở lớn (open-reading frame) trong khi ở TL-DNA và TR-DNA kiểu octopine tương ứng là 8 và 6. Các sản phẩm phiên mã phía cánh phải của T-DNA kiểu nopaline có chức năng tương đương với các sản phẩm phiên mã phía cánh phải của TL-DNA (Hình 1.21B). Toàn bộ sự tổ chức của các gen trên T-DNA và các vùng lân cận là tương tự với các gen của genome eukaryote mặc dù chúng không chứa intron. So sánh các trình tự, sự phát sinh đột biến mất đoạn và gen nhảy cũng như sự tăng sinh của các sản phẩm gen riêng lẻ ở E.coli đã được sử dụng để phát hiện ra chức năng một số sản phẩm gen được mã hóa bởi T-DNA. Một gen ở trong vùng TL octopine mã hóa enzyme octopine synthase. Ở Ti-plasmid nopaline, các gen opine synthase bao gồm nopaline synthase (nos) và agrocinopine synthase (acs). Trong Ti-plasmid octopine, vùng TR mã hóa hai protein chịu trách nhiệm đối với sự tổng hợp manopine và một sản phẩm của gen xúc tác cho sự biến đổi ngược manopine thành agropine. Locus tmr
  33. 33 mã hóa một enzyme liên quan đến hệ thống cytokinin và sự đột biến ở đây dẫn đến sự tăng sinh rễ từ các khối u hình chóp đã gây ra ở một số loài (các thể đột biến rễ). Các locus tms 1 và tms 2 liên quan đến sự tổng hợp không điều hòa của auxin và sự đột biến một trong hai locus gây nên sự tăng sinh chồi từ các khối u hình chóp ở nhiều loại thực vật (các thể đột biến chồi). Vì vậy, T-DNA mang các gen (tms 1, tms 2 và tmr) mà sản phẩm của chúng không chịu sự điều hòa bình thường của các con đường chuyển hóa thực vật liên quan đến sự tổng hợp phytohormone và điều này gây ra kiểu hình ung thư. Do đó các gen tms 1, tms 2 và tmr được xem là các gen ung thư. Tuy nhiên cần lưu ý rằng các gen được mã hóa bởi T-DNA không đòi hỏi phải chuyển T-DNA vào tế bào thực vật và cũng không duy trì sự ổn định của nó trong genome thực vật. 2.1.3. Ri-plasmid của Agrobacterium rhizogenes Sự khởi đầu của bệnh lông tơ do A.rhizogenes tương tự như sự biến nạp nhờ A.tumefaciens. Dưới sự kiểm soát của vùng gây độc, hai vùng phân tán của Ri-plasmid được chuyển vào genome thực vật (Huffman, 1984; De Paolis, 1985). Các vùng này có tên là TL (T-left T-DNA) và TR (T-right T-DNA). TR T-DNA chứa các gen sản xuất opine (mannopine hoặc agropine) và các dòng được định rõ đặc điểm nhờ các gen opine đặc trưng của chúng (De Paolis, 1985). Mặt khác TR T-DNA còn chứa hai gen mã hóa cho sự tổng hợp auxin. Các gen này tương đồng rất cao với các gen auxin của A.tumefaciens và cho thấy có thể bổ sung thêm các dòng mang các gen auxin đột biến của chúng (Offringa, 1986). TL T-DNA không tương đồng với T-DNA của A.tumefaciens (Huffman, 1984). Toàn bộ TL T-DNA của đã được giải trình tự và nó chứa tối thiểu 11 khung đọc mở, tương tự với các khung đọc mở đã được tìm thấy ở genome của eukaryote. Chúng có promoter và các yếu tố polyadenine hóa cần thiết để thực hiện chức năng khi chuyển vào trong genome thực vật (Simpson, 1986). Các gen này không tương đồng với bất kỳ gen nào
  34. 34 Hình 1.21: Cấu trúc và sự biểu hiện của Ti-plasmid kiểu octopine và nopaline A. Bản đồ của Ti-plasmid kiểu octopine (pTiAch5) và kiểu nopaline (pTiC58) cho thấy vị trí tương đối và kích thước của các vùng chức năng chính. Các vị trí tô đậm chí các vùng tương đồng lớn của 2 plasmid. //: Các đoạn lặp trực tiếp 25 bp; CON: vùng mã hóa chức năng tiếp hợp ORI: vùng mã hóa chức năng tái bản và khởi điểm tái bản B. Bản đồ của vùng T kiểu nopaline và octopine cho thấy các vùng chức năng chính, các vùng tương đồng và các sản phẩm phiên mã. Các sản phẩm phiên mã đã được biết là: 3(nos): nopaline synthase; 3 (ocs): octonopaline synthase; acs: agrocinopine synthase; 1(tms 1): tryptophan mono-oxygenase; 2(tms 2): indole-3-acetamide hydrolase; 4(tmr): DMA transferase; agr: 3 sản phẩm phiên mã cần cho sự tổng hợp agropine.
  35. 35 đã biết và cũng không có sự tương đồng có ý nghĩa nào đối với T- DNA (kiểu octopine) của A.tumefacien. TR T-DNA là không cần thiết đối với sự duy trì kiểu hình lông tơ. Tuy nhiên ở nhiều loài, các dòng Agrobacterium có cả TL và TR T-DNA là độc nhiều hơn so với các dòng chỉ mang một T-DNA (Vilaine và Case-Delbart, 1987). 2.2. Cơ chế chuyển T-DNA Các vùng T-DNA của cả A.tumefaciens và A.rhizogenes đều nằm ở bên cạnh các đoạn lặp trực tiếp 25 bp (Hình 1.11) và các điểm kết thúc của T-DNA đã hợp nhất trong genome thực vật nằm sát với các trình tự này. Trình tự liên ứng của biên T-DNA là GGCAGGATATTC/GA/G GT/GTCTAAA/TT/C. Hầu hết các nghiên cứu cơ chế chuyển T-DNA từ Agrobacterium vào tế bào thực vật đã được tiến hành ở A.tumefaciens. Việc loại bỏ bờ phải của Ti-plasmid kiểu nopaline đã làm mất sự hình thành khối u, nhưng khi đoạn oligonucleotid tương đồng với bờ phải được tạo dòng với sự định hướng chính xác với Ti-plasmid thiếu bờ phải thì sự hình thành khối u lại được phục hồi (Wang, 1984), cho thấy rằng các trình tự lặp 25 bp phân cực và tác động đều (cis-acting). Sự tiếp xúc của Agrobacterium với các hợp chất giải phóng từ mô thực vật bị tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid phiên mã (Hình 1.22). Trong quá trình này một chất có hoạt tính hóa học cao và đặc trưng đã được nhận biết là acetosyringone. Gen vir A và gen vir C được biểu hiện ở vi khuẩn sinh trưởng sinh dưỡng mặc dù gen vir C chỉ được phiên mã ở mức độ thấp. Khi Agrobacterium gặp dịch rỉ của các tế bào thực vật bị tổn thương, hoặc acetosyringone tinh khiết, sản phẩm của gen vir A (có thể liên kết với màng) sẽ nhận diện và tương tác với acetosyringone và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen vir C. Sau đó protein vir C đã biến đổi hoạt hóa làm cho các gen vir B, C, D và E không hoạt động và làm tăng cường sự phiên mã của gen vir C. Sự cảm ứng gen vir xảy ra nhờ sự xuất hiện các điểm đứt sợi đơn trong các trình tự biên 25 bp nằm ở mép của T-DNA (Stachel và Zambryski, 1986; Albright, 1987) và sự xuất hiện phân tử sợi đơn mạch thẳng tương ứng với T-DNA (Hình 1.22). Các sản phẩm của operon vir D có hoạt tính endonuclease (Yanofsky, 1986). Bằng một
  36. 36 cơ chế tương tự sự tiếp hợp của vi khuẩn, T-DNA được chuyển sang tế bào thực vật và xen một cách ổn định vào DNA nhân (Stachel và Zambryski, 1986). Sự kiện này có thể liên quan đến protein được mã hóa bởi operon vir E (Winans, 1987). Mô hình mô tả các sự kiện xảy ra ở mức phân tử trong sự tương tác giữa tế bào thực vật và Agrobacterium để hình thành khối u hình chóp được trình bày ở hình 1.22. 2.3. Plasmid Agrobacterium là vector biến nạp Khả năng chuyến một cách tự nhiên các trình tự DNA xác định vào genome thực vật của Agrobacterium đã được sử dụng vào việc phát triển các vector biến nạp thực vật. Các vector này lợi dụng một số đặc tính bẩm sinh của Agrobacterium là quá trình biến nạp trung gian (mediated transformation process). Vào đầu thập niên 1980, một số nhóm nghiên cứu Ti-plasmid đã loại bỏ tất cả các gen onc của T-DNA. Khám phá quan trọng thứ nhất là các gen onc này không cần thiết đối với việc chuyển T-DNA vào tế bào thực vật và không hợp nhất vào DNA nhân. Vì vậy các gen này có thể được thay thế. Nó không chỉ cho phép xen DNA ngoại lai vào mà còn cho phép loại bỏ các chức năng của gen onc. Tuy nhiên cần lưu ý rằng, nos hoặc ocs là các gen marker hữu ích đối với sự biến nạp bởi vì hoạt tính enzyme của các sản phẩm gen của chúng có thể được phát hiện bằng một xét nghiệm đơn giản. Cho đến nay, giới hạn kích thước của đoạn DNA xen vào chưa được công bố. Sự kiện quan trọng thứ ba là sự khám phá các sản phẩm của gen vir còn hoạt động chức năng trong trans. Cuối cùng, T-DNA không gây ung thư có mặt trong toàn bộ thực vật tái sinh được truyền lại cho thế hệ sau theo kiểu di truyền Mendel. 2.4. Các thành phần cơ bản của vector Ti-plasmid không gây ung thư Ðặc điểm của chuyển gen qua trung gian Agrobacterium là bất kỳ DNA nào đã tạo dòng đều có thể được chuyển vào genome của tế bào thực vật hai lá mầm. DNA ngoại lai phải được nằm ở mép các trình tự biên của T-DNA và duy trì ổn định trong dòng Agrobacterium mang nhóm bổ sung đầy đủ của các gen vir dạng cis hoặc trans (định vị trên plasmid hỗ trợ gây độc phân tán). Các gen trên nhiễm sắc thể của Agrobacterium kết hợp với vùng gây độc đã
  37. 37 được mô tả và có liên quan với việc vi khuẩn nhận ra một thành phần của bề mặt tế bào thực vật, rồi gắn vào sau đó. Hình 1.12: Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật và cơ chế chuyển T-DNA
  38. 38 Ðể nhận ra các tế bào đã được biến nạp, các gen trội kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn đã được xen vào trong các trình tự lặp 25 bp dưới sự kiểm soát của T-DNA promoter và các tín hiệu polyadenyl hóa. Các gen kháng thuốc kháng sinh dạng khảm như thế biểu hiện một cách có hiệu quả trong tế bào thực vật ở bất kỳ môi trường di truyền nào. Việc liên kết một cách chặt chẽ các gen marker với DNA ngoại lai có 2 lợi ích: thứ nhất là để chọn lọc trực tiếp các mô thực vật đã được biến nạp DNA ngoại lai vào một cách chắc chắn; thứ hai là đảm bảo DNA ngoại lai trong các dòng biến nạp đặc trưng đã chọn lọc không xen vào vùng genome không được phiên mã. 2.5. Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa trên Ti- plasmid Cả A.tumefaciens và A.rhizogenes đều được sử dụng để chuyển DNA ngoại lai vào tế bào thực vật. Nhiều vector biến nạp dựa trên Ti-plasmid đã được phát triển (Bảng 1.1 và bảng 1.2). Các vector này không chứa bất kỳ trình tự ung thư nào và vì vậy tế bào thực vật có thể sinh trưởng bình thường sau khi chuyển DNA vào nhân của nó. Các vector không gây ung thư hiện đang sử dụng có thể được chia làm hai loại là cis và trans, dựa vào việc có hay không các vùng T-DNA nằm ở mép các trình tự lặp trực tiếp 25 bp trên cùng đơn vị tái bản (replicon) như các gen vir hoặc trên một plasmid phân tán (Hình 1.13). Trước đây, loại vector thường được đề cập đến là vector liên hợp (co-intergrative vector), tuy nhiên gần đây vector nhị thể (binary vector) là phổ biến hơn. 2.5.1. Cis vector Ðây là các vector có nguồn gốc từ Ti-plasmid kiểu dại mà gen onc trên T-DNA đã được loại bỏ và trong một số trường hợp được thay thế bằng một đoạn DNA đặc hiệu có vùng tương đồng với một vector tạo dòng nhỏ mà chỉ có thể tái bản ở E.coli. Chiến lược vector này phụ thuộc vào sự liên hợp trong A.tumefaciens giữa các vùng tương đồng trên Ti-plasmid đã sửa đổi (hỗ trợ mang gen vir) và một vector tạo dòng nhỏ ở E.coli (vector trung gian) mang gen marker
  39. 41 chọn lọc sẽ hoạt động chức năng trong các tế bào thực vật và các trình tự duy nhất cho việc xen DNA ngoại lai vào. Vector trung gian mang trình tự DNA ngoại lai thường được đưa vào A.tumefaciens bằng sự tiếp hợp và sử dụng sự chọn lọc thích hợp sẽ thu được thể nhận tiếp hợp với DNA ngoại lai đã ổn định trong T-DNA là kết quả của tái tổ hợp tương đồng (Hình 1.23A ). Hình 1.23: Sơ đồ hệ thống vector liên hợp (A) và vector nhị thể (B) VIR: vùng gây độc; HOM: các vùng tương đồng trong đó sự tái bản có thể xảy ra đối với sự liên hợp; LB: biên trái; RB: biên phải; MCS (multicloning site): các trình tự tạo dòng; PTM: marker biến nạp thực vật; RES: marker kháng thuốc kháng sinh để chọn lọc đối với sự có mặt của các trình tự vector trong vi khuẩn chủ; oriT: khởi điểm chuyển; ColE1: khởi điểm tái bản từ plasmid ColE1; RK2: vùng có phổ khởi điểm tái bản rộng, có nguồn gốc từ pKR2
  40. 42 Ở một số vector như pGV3850 (Hình 1.24), cả hai biên của T-DNA là ở trên Ti-plasmid đã sửa đổi. Trong các vector như pGV2260 (Debleare, 1982), các trình tự lặp 25 bp là ở trên vector trung gian, trong khi ở vector pTiBS3-SE (Fraley, 1985), biên phải là ở trên vector trung gian và biên trái ở trên gen vir của plasmid. Bất kỳ ở đâu trong các vị trí khởi đầu của các trình tự lặp 25 bp, kết quả thực sau khi liên hợp là sự xen các trình tự DNA ngoại lai ở biên T-DNA lặp lại trên Ti-plasmid đã sửa đổi. Vì vậy ở các dòng A.tumefaciens mang cấu trúc này, T-DNA được chuyển vào genome thực vật trong suốt sự biến nạp là kết quả hoạt động của vùng vir dạng cis. Hình 1.24 : Cấu trúc và sự sử dụng vector liên hợp pGV3850 Bản đồ cho thấy cấu trúc của vector biến nạp thực vật pGV3850 và vector trung gian pGV1103 và kết quả của việc hợp nhất pGV1103 vào pGV3850. LB: biên trái; RB: biên phải; Pnos: promoter nopaline synthetase; npt-II: trình tự mã hóa neomycin phosphotransferase-II từ Tn5; ocA: trình tự polyadenyl hóa octopine synthase; E: EcoRI; H: HindIII; B: BamHI; nos: nopaline synthase; ApR: gen kháng ampicillin; KmR: gen kháng kanamycin
  41. 43 Một ví dụ chi tiết về vector cis là pGV3850 (Zambryski, 1983). Vector này đã được loại bỏ các gen onc của Ti-plasmid kiểu nopaline (C58) và thay bằng pBR322 (Hình 1.25). Bất kỳ trình tự DNA ngoại lai nào đã được tạo dòng trong pBR322 đều có thể đưa vào pGV3850 bằng quá trình chuyển vào Agrobacterium theo cách tiếp hợp tái tổ hợp bao gồm hai bước. Trước hết pBR322 mang gen cần chuyển và một marker kháng thuốc kháng sinh cho phép chọn lọc Agrobacterium (kanamycin hoặc streptomicin/spectinomycin) được đưa vào dòng Ecoli chứa hai plasmid hỗ trợ pGJ28 và pRGdrd11. Các plasmid này cung cấp ColE1 có chức năng hỗ trợ, cho phép chuyển cả 3 plasmid vào Agrobacterium qua tiếp hợp. Tuy nhiên pBR322 không thể tái bản trong Agrobacterium và vì vậy nó sẽ không được bảo tồn, nhưng sự tái tổ hợp có thể xảy ra giữa pBR322 và pGV3850 làm cho gen quan tâm được chuyển vào Ti- plasmid. Thể nhận tiếp hợp có thể được chọn lọc nhờ tính kháng do plasmid mã hóa và tính kháng rifampicin do nhiễm sắc thể của Agrobacterium mã hóa. 2.5.2. Vector nhị thể Vector trans hoặc vector nhị thể được dựa trên các plasmid có thể tái bản ở cả E.coli và Agrobacterium và các plasmid này có chứa các trình tự biên của T-DNA (Hình 1.23B). Các vector này có thể được thiết kế sao cho các trình tự biên cạnh MCS cho phép xen DNA ngoại lai vào và các marker cho phép chọn lọc trực tiếp các tế bào thực vật đã được biến nạp. Plasmid có thể được thao tác ở trong E.coli và được chuyển vào qua sự tiếp hợp với các dòng Agrobacterium mang plasmid có chứa vùng vir nhưng thiếu T-DNA và các trình tự lặp 25 bp. Các plasmid như thế thường là các thể đột biến mất đoạn đơn giản của Ti-plasmid octopine kiểu dại hoặc kiểu nopaline (Bảng 1.2). Việc chuyển DNA ngoại lai trên vector tạo dòng vào tế bào thực vật có thể được thực hiện do hoạt động chức năng của vùng vir. pBin19 là một vector nhị thể phổ biến dựa trên đơn vị tái bản (replicon) vật chủ mở rộng của pRK252 (Hình 1.25A). Vì vậy nó có thể tái bản trong cả E.coli và Agrobacterium, cho phép xen DNA ngoại lai vào vector và sàng lọc trong E.coli trước khi chuyển vào Agrobacterium. Vector này chứa marker kháng kanamicin (Kmr)
  42. 44 Hình 1.25 : Cấu trúc và sự sử dụng vector nhị thể pBin19 A. Bản đồ của vector nhị thể pBin19 LB: biên trái; RB: biên phải; lac: vùng bổ sung α của operon lac; Pnos: promoter gen nopaline synthetase; npt-II: trình tự mã hóa neomycin phosphotransferase-II từ Tn5; nosA: trình tự polyadenyl hóa gen nopaline synthase. B. Sự xâm nhập của pBin19 vào A.tumefaciens LBA4404 sử dụng plasmid hỗ trợ pRK2013 và sau đó loại bỏ plasmid hỗ trợ trong Agrobacterium. giúp chọn lọc trực tiếp ở trong vi khuẩn cũng như các trình tự biên T-DNA ở cạnh một marker chọn lọc trội với mục đích sử dụng trong
  43. 45 các tế bào thực vật (một gen kháng kanamicin nằm cạnh promoter nos và trình tự poly(A) thêm vào) và một MCS ở trong vùng bổ sung α của β-galactosidase. Sự sàng lọc các thể tái tổ hợp có thể được tiến hành ở Lac- E.coli nhờ sự bổ trợ α với sự có mặt của IPTG và X- GAL (Groneborn và Messing, 1978). Vector này có thể được đưa vào Agrobacterium bằng sự tiếp hợp sử dụng các chức năng hỗ trợ của pKR2013. Agrobacterium chủ LBA4404 chứa Ti-plasmid (pLBA4404) đã loại bỏ T-DNA nhưng vùng vir vẫn không đổi. Thể nhận tiếp hợp có thể được chọn lọc nhờ tính kháng kanamicin và rifampicin. Ví dụ về hệ thống vector nhị thể được trình bày ở bảng 1.2. Các vector nhị thể này khác nhau về kích thước, sự tái bản ổn định trong Agrobacterium, các vị trí tạo dòng, sự bổ trợ α để có thể sàng lọc plasmid tái tổ hợp trên các đĩa X-GAL, các gen marker để chọn lọc các thực vật biến nạp và các gen marker để chọn lọc các thể nhận tiếp hợp, nhưng phần lớn được biết là thích hợp với một số plasmid hỗ trợ mang gen vir của A.tumefacien cũng như với nhiều Ri- plasmid. 2.6. Vector biến nạp thực vật sử dụng A.rhizogenes Các vector này được sử dụng lần đầu tiên khi biến nạp vào các loại thực vật mà sự tái sinh toàn bộ cơ thể từ các tế bào đơn lẻ là khó khăn. Ở một số loài, sự tái sinh cơ thể có thể xảy ra từ sự nuôi cấy rễ gây ra bởi A.rhizogenes thông qua sự phát triển phôi soma hoặc sự phát sinh cơ quan. Cơ chế kiểu hình lông rễ bị ức chế làm phát sinh hình thái chồi hiện nay chưa rõ. Thực vật tái sinh từ lông rễ thường bị biến đổi hình thái: lá bị gấp nếp, hệ thống rễ ăn nghiêng, sinh trưởng cằn cỗi và khả năng sinh sản kém. 2.6.1.Vector liên hợp Ðây là vector trung gian được thiết kế cho phép thao tác ở E.coli và chứa vùng T-DNA của Ri-plasmid. Sự dẫn nhập vector vào A.rhizogenes mang một Ri-plasmid bình thường làm ổn định các trình tự của vector trung gian là kết quả của tái tổ hợp tương đồng nội phân tử trong Ri-plasmid (Jensen, 1986).
  44. 46 2.6.2.Vector nhị thể Vector nhị thể đã loại bỏ hết khả năng gây hại có nguồn gốc từ A.tumefaciens (Bevan, 1984; Van den Elzen, 1985) có thể đưa vào A.rhizogenes và sẽ tái bản ổn định miễn là sự chọn lọc được duy trì. Sau đó nhiễm A.rhizogenes mang vector nhị thể với thực vật sẽ làm chuyển T-DNA từ vector nhị thể cùng với T-DNA của A.rhizogenes vào genome thực vật (Shalin, 1986; Simpson, 1986). Các gen này khi chuyển vào genome thực vật được định vị ở giữa các trình tự biên của vector nhị thể. Các trình tự biên của vector nhị thể này có tác dụng sau khi sự cảm ứng của vùng vir của Ri-plasmid kiểu dại ở ngay tại chỗ (Simpson, 1986; Trulson, 1986). Ðiều này có thể xảy ra là do độ tương đồng lớn, ở mức DNA, giữa các vùng gây độc (virulence region) của A.tumefacien và A.rhizogenes (Huffman, 1984). Gần đây lông tơ (hairy root) cà chua và dưa chuột đã được tạo ra bởi A.rizhogenes kiểu dại mang vector nhị thể với marker chọn lọc Kmr. Thể tái sinh từ môi trường nuôi cấy lông rễ kháng kanamicin này đã được sàng lọc đối với thực vật kiểu hình bình thường và một số đã được phục hồi mà thiếu T-DNA của A.rizhogenes nhưng có mặt T-DNA của vector nhị thể (Shalin, 1986; Trulson, 1986) là do sự chuyển độc lập của các T-DNA tách rời. Ðặc tính này của A.rhizogenes làm cho nó trở nên hấp dẫn như là một vector biến nạp nếu như quá trình này có thể được mở rộng đối với nhiều loại cây trồng khác. Tài liệu tham khảo chính Makrides SC. 2003. Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. Elsevier Science B. V. USA. Louis-Marie H. 2003. Animal Transgenesis and Cloning. John Wiley and Sons, Ltd. USA. Leland HH, Leroy H, Michael LG, Ann ER, Lee MS, Ruth CV. 2000. Genetics, The McGraw-Hill Companies, Inc. USA. Winter PC, Hickey GI, Fletcher HL. 1998. Instant Notes Genentics. Printed by Biddles Ltd, Guildford. UK.
  45. 47 Glick BR, Jackj P. 1994. Molecular Biotechnology. ASM Press. Washington D.C. USA. Chopra VL, Anwan N. 1990. Genetic Engineering and Biotechnology. Oxford and IBH Publishing CO.PVT, Ltd. UK. John D, Roderick S, Philip A, Richard W. 1988. Plant Genetics Transformation and Gene Expression (A Laboratory Manual). Blackwell Scientific Publications. UK.