›
›

Giáo trình Công nghệ sinh học thực vật (Phần 1) - Mai Xuân Lương

pdf 54 trang ngocly 1980
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Công nghệ sinh học thực vật (Phần 1) - Mai Xuân Lương", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfgiao_trinh_cong_nghe_sinh_hoc_thuc_vat_phan_1_mai_xuan_luong.pdf

Nội dung text: Giáo trình Công nghệ sinh học thực vật (Phần 1) - Mai Xuân Lương

  1. TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC ÑAØ LAÏT F 7 G GIAÙO TRÌNH COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC THÖÏC VAÄT GS.TS. MAI XUAÂN LÖÔNG 2005
  2. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 1 - MỤC LỤC MỤC LỤC - 1 - PHAÀN I. NHAÂN GIOÁNG IN VITRO - 3 - MÔÛ ÑAÀU - 3 - CHÖÔNG I. NHÖÕNG NGUYEÂN TAÉC CUÛA NUOÂI CAÁY MOÂ - 5 - TRONG COÂNG TAÙC VI NHAÂN GIOÁNG - 5 - I. GIÔÙI THIEÄU CHUNG - 5 - II. TAÙI SINH CAÂY CON TRONG NUOÂI CAÁY MOÂ - 6 - 1. Nhaân gioáng töø haït trong ñieàu kieän voâ truøng. - 6 - 2. Nuoâi caáy phoâi - 6 - 3. Nuoâi caáy teá baøo tröùng - 6 - III. NHAÂN GIOÁNG CAÂY CON BAÈNG BIEÄN PHAÙP NUOÂI CAÁY MOÂ - 7 - 1.Giai ñoaïn I. Kieán laäp vaø oån ñònh maãu caáy. - 7 - 2.Giai ñoaïn 2: nhaân gioáng - 9 - 3.Giai ñoaïn 3: hình thaønh reã. - 9 - 4.Giai ñoaïn 4. Laøm cho caùc caây taùi sinh thích nghi khí haäu - 10 - IV. SÔ LÖÔÏC LÒCH SÖÛ PHAÙT TRIEÅN CUÛA NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT.- 11 - CHÖÔNG II. PHOØNG THÍ NGHIEÄM NUOÂI CAÁY MOÂ TEÁ BAØO THÖÏC VAÄT. - 15 - I. BAÛO ÑAÛM ÑIEÀU KIEÄN VOÂ TRUØNG - 15 - 1. YÙ nghóa cuaû voâ truøng trong nuoâi caáy moâ thöïc vaät. - 15 - 2. Nguoàn nhieãm taïp. - 15 - 3. Voâ truøng duïng cu ïthuûy tinh, nuùt ñaäy vaø moâi tröôøng. - 15 - 4. Voâ truøng moâ caáy. - 16 - 5. Voâ truøng nôi thao taùc caáy vaø tuû caáy voâ truøng. - 17 - II. CHUAÅN BÒ MOÂI TRÖÔØNG - 17 - 1. Ñöôøng. - 18 - 2. Caùc muoái khoaùng ña löôïng. - 18 - 3. Caùc muoái khoaùng vi löôïng. - 19 - 4.Caùc vitamin - 19 - 5. Caùc chaát kích thích sinh tröôûng (phytohormone). - 20 - 6. Caùc chaát höõu cô khaùc. - 21 - 7. Chuaån bò caùc dung dòch ñaäm ñaëc vaø dung dòch laøm vieäc. - 21 - 8. Vaán ñeà löïa choïn moâi tröôøng - 23 - III. CHOÏN VAØ XÖÛ LYÙ MOÂ CAÁY. - 23 - IV. PHOØNG THÍ NGHIEÄM NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT. - 24 - 1.Caùch boá trí phoøng thí nghieäm nuoâi caáy moâ. - 24 - 2. Caùc thieát bò chuû yeáu cuûa phoøng thí nghieäm nuoâi caáy moâ thöïc vaät. - 24 - CHÖÔNg III. CAÙC PHÖÔNG PHAÙP NUOÂI CAÁY MOÂ - 26 - I. NUOÂI CAÁY ÑÆNH SINH TRÖÔÛNG - 26 - 1/ Nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng caây khoai taây - 27 - 2/ Nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng caây ñòa lan - 29 - II. NHAÂN GIOÁNG BAÈNG CON ÑÖÔØNG PHAÙT SINH PHOÂI VOÂ TÍNH - 32 - III. NHAÂN GIOÁNG BAÈNG CAÙCH TAÏO MOÂ SEÏO (CALLUS). - 34 - IV. NHAÂN GIOÁNG BAÈNG NUOÂI CAÁY LAÙT MOÛNG - 36 - GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  3. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 2 - V. ÖÙNG DUÏNG KYÕ THUAÄT VI GHEÙP TRONG NHAÂN GIOÁNG. - 38 - VI. NUOÂI CAÁY TUÙI PHAÁN - 41 - 1.Choïn vaät lieäu khôûi nguyeân - 41 - 2.Taïo caùc toå hôïp gen môùi baèng phöông phaùp lai höõu tính. - 41 - 3.Nuoâi caáy tuùi phaán caây lai. - 42 - VII. NUOÂI CAÁY VAØ DUNG HÔÏP PROTOPLAST ÔÛ THÖÏC VAÄT - 45 - 1. Taùch vaø nuoâi caáy protoplast thöïc vaät. - 46 - 2. Dung hôïp protoplast - 48 - VIII. CHUYEÅN GEN THÖÏC VAÄT - 51 - 1. Agrobacterium. - 51 - 2. Chuyeån gen nhôø Agrobacterium - 52 - PHAÀN II. NHAÂN GIOÁNG VOÂ TÍNH TRONG VÖÔØM ÖÔM - 54 - CHÖÔNG I. YEÁU TOÁ MOÂI TRÖÔØNG CUÛA NHAÂN GIOÁNG - 54 - I. CAÙC YEÁU TOÁ CÔ BAÛN VEÀ VI KHÍ HAÄU CUÛA MOÂI TRÖÔØNG NHAÂN GIOÁNG. - 54 - 1.Aùnh saùng - 54 - 2. Nöôùc vaø ñoä aåm - 55 - 3. Nhieät ñoä. - 55 - 4. Khí vaø trao ñoåi khí. - 55 - 5. Dinh döôõng khoaùng - 55 - II. KHAY, CHAÄU TROÀNG CAÂY - 56 - 1.Khay phaúng ñaùy - 56 - 2. Chaäu ñaát nung - 56 - 3. Chaäu plastic. - 56 - 4. Chaäu sôïi. - 56 - 5. Chaäu giaáy - 57 - 6. Tuùi polyethylene - 57 - 7. Khay troàng baèng goã. - 57 - III. QUAÛN LYÙ CAÙC YEÁU TOÁ THOÅ NHÖÔÕNG TRONG NHAÂN GIOÁNG VAØ SAÛN XUAÁT CAÂY GIOÁNG - 57 - CHÖÔNG II. KYÕ THUAÄT NHAÂN GIOÁNG MOÄT SOÁ CAÂY PHOÅ BIEÁN. - 63 - I. KÍCH THÍCH TAÏO REÃ. - 63 - II. SÖÛ DUÏNG PHYTOHORMONE KÍCH THÍCH CAØNH CHIEÁT RA REÃ. - 64 - III. NHAÂN GIOÁNG CAÂY TROÀNG TÖØ REÃ. - 65 - IV. NHAÂN GIOÁNG TÖØ VAÛY CUÛ - 69 - V. NHAÂN GIOÁNG TÖØ LAÙ - 70 - VI. NHAÂN GIOÁNG BAÈNG PHÖÔNG PHAÙP CHIEÁT CAØNH - 72 - VII. NHAÂN GIOÁNG CAÂY ÑOÃ QUYEÂN. - 73 - VIII. GHEÙP CAØNH - 74 - GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  4. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 3 - PHAÀN I. NHAÂN GIOÁNG IN VITRO MÔÛ ÑAÀU Gioáng laø moät khaâu raát quan troïng trong saûn xuaát noâng nghieäp. Coâng taùc gioáng chuû yeáu bao goàm caùc khaâu thu thaäp nguoàn gen, baûo quaûn quyõ gen, lai taïo, tuyeån choïn, thöû nghieäm gioáng vaø nhaân gioáng. Nhôø phöông phaùp nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät neân ngaøy nay phaàn lôùn caùc coâng vieäc naøy ñöôïc thöïc hieän moät caùch khaù thuaän lôïi vaø nhanh choùng. Söï hình thaønh vaø phaùt trieån cuûa phöông phaùp nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät laø keát quaû cuûa nhöõng phaùt hieän sau ñaây trong lónh vöïc sinh lyù thöïc vaät vaø di truyeàn hoïc phaân töû: 1. Tính toaøn theå (potipotency) cuûa moâ vaø teá baøo thöïc vaät cho pheùp taùi sinh ñöôïc caây hoaøn chænh töø moâ, thaäm chí töø moät teá baøo nuoâi taùch rôøi; 2. Khaû naêng taïo caùc caây ñôn boäi qua nuoâi caáy tuùi phaán, töø ñoù taïo caùc doøng ñoàng hôïp töû tuyeät ñoái vaø nhôø ñoù ruùt ngaén ñöôïc chu trình lai taïo; 3. Khaû naêng haáp thu ADN ngoaïi lai vaøo teá baøo thöïc vaät vaø khaû naêng chuyeån gen ñeå gaây bieán ñoåi (transformation) ôû thöïc vaät do ADN ngoaïi lai nhôø coâng ngheä gen (genetic engineering); 4. Khaû naêng nuoâi caáy caùc teá baøo thöïc vaät nhö nuoâi caáy vi sinh vaät daãn ñeán khaû naêng öùng duïng di truyeàn phaân töû vaøo thöïc vaät baäc cao ñeå phuïc vuï cho coâng taùc taïo gioáng; 5. Kyõ thuaät nuoâi caáy protoplast vaø khaû naêng dung hôïp protoplast, taùi sinh caây hoaøn chænh töø protoplast lai (cybrid); 6. Khaû naêng loaïi tröø virus baèng phöông phaùp nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng, taïo caùc doøng voâ tính saïch beänh ôû caùc caây nhaân gioáng voâ tính; 7. Khaû naêng duøng choài naùch, caùc theå choài protocorm vaøo nhaân gioáng voâ tính vôùi toác ñoä cöïc nhanh moät soá caây troàng; 8. Khaû naêng söû duïng phöông phaùp nuoâi caáy phoâi ñeå khaéc phuïc hieän töôïng baát thuï khi lai xa; 9. Khaû naêng baûo quaûn caùc nguoàn gen baèng nuoâi caáy trong oáng nghieäm; 10. Khaû naêng toàn tröõ caùc teá baøo thöïc vaät soáng trong thôøi gian daøi vaø ôû nhieät ñoä thaáp maø khoâng maát tính toaøn theå cuûa teá baøo. Nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät khoâng chæ goùp phaàn giaûi quyeát moät caùch coù hieäu quaû coâng taùc gioáng caây troàng maø coøn môû ra moät chaân trôøi môùi trong nghieân cöùu di GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  5. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 4 - truyeàn thöïc vaät, caùc cô cheá sinh toång hôïp ôû thöïc vaät, sinh lyù phaùt trieån, vai troø cuûa phytohormone trong ñôøi soáng thöïc vaät vaø nhieàu vaán ñeà sinh hoïc cô baûn khaùc. Nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät coøn laø coâng cuï ñeå thu nhaän caùc chaát coù hoaït tính sinh hoïc (alcaloid, steroid ) qua nuoâi caáy moâ teá baøo caây thuoác ôû quy moâ lôùn. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  6. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 5 - CHÖÔNG I. NHÖÕNG NGUYEÂN TAÉC CUÛA NUOÂI CAÁY MOÂ TRONG COÂNG TAÙC VI NHAÂN GIOÁNG I. GIÔÙI THIEÄU CHUNG. Khaû naêng kieán laäp vaø duy trì caùc cô quan vaø caùc moâ thöïc vaät (phoâi, ñænh sinh tröôûng, reã, hoa teá baøo, callus, teá baøo traàn) trong nhaân gioáng voâ truøng ñeå taùi sinh nhöõng caây môùi töø chuùng laø keát quaû cuûa nhöõng nghieân cöùu cô baûn vaø nghieân cöùu öùng duïng trong caùc phoøng thí nghieäm thöïc vaät hoïc, beänh hoïc vaø di truyeàn hoïc töø cuoái theá kyû 19. Coâng vieäc naøy ñöôïc goïi chung laø nuoâi caáy moâ vaø cô quan, nuoâi caáy trong oáng nghieäm, vi nhaân gioáng vaø thuaät ngöõ môùi nhaát laø coâng ngheä sinh hoïc. Caùc quy trình chính cuûa coâng ngheä sinh hoïc bao goàm taùi sinh choài, taùi sinh caây con, taïo callus vaø taïo phoâi voâ tính. Vi nhaân gioáng khaùc vôùi phöông phaùp nhaân gioáng truyeàn thoáng ôû choã quaù trình ñöôïc chia thaønh nhieàu giai ñoaïn ñeå coù theå kieåm moãi khía caïnh cuûa quaù trình taùi sinh vaø phaùt trieån caây con. Moãi böôùc cuûa traät töï coâng vieäc coù theå ñöôïc thao taùc (hoaëc laäp chöông trình) baèng caùch choïn maãu caáy vaø kieåm tra moâi tröôøng nhaân gioáng. Nhìn saâu vaøo caùc cô cheá sinh hoïc cuûa moãi quaù trình vi nhaân gioáng seõ coù theå tìm thaáy khaû naêng öùng duïng noù trong phöông phaùp nhaân gioángcaây con phuïc vuï saûn xuaát ñaïi traø. Trong chöông naøy seõ moâ taû caùc coâng vieäc ñaõ neâu vaø xaùc ñònh caùc cô sôû hình thaùi, sinh lyù vaø di truyeàn cuûa quaù trình sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa caây trong nuoâi caáy moâ. Tröôùc heát haõy cuøng nhau naém vöõng yù nghóa cuûa moät soá thuaät ngöõ quan troïng. • Nuoâi caáy moâ. Thuaät ngöõ naøy duøng cho moät traät töï caùc thao taùc duøng ñeå duy trì vaø sinh tröôûng cuûa caùc moâ thöïc vaät (taïo callus, teá baøo, teá baøo traàn), cuûa caùc cô quan trong nuoâi caáy voâ truøng. Kyõ thuaät naøy duøng ñeå nhaân gioáng, caûi bieán genotype (töùc taïo gioáng môùi), saûn xuaát sinh khoái chöùa caùc saûn phaåm hoùa sinh hoïc, nghieân cöùu beänh hoïc thöïc vaät, baûo quaûn phoâi vaø caùc nghieân cöùu khoa hoïc. Taát caû caùc thao taùc naøy ñeàu ñöôïc goïi chung laø coâng ngheä sinh hoïc. • Vi nhaân gioáng. Thuaät ngöõ duøng ñeå aùm chæ coâng vieäc nhaân gioáng thöïc vaät trong oáng nghieäm. Coù 4 giai ñoaïn phaùt trieån ñaëc tröng cuûa coâng vieäc naøy laø kieán laäp, nhaân choài, taïo reã vaø laøm cho caây con taùi sinh thích nghi vôùi khí haäu. • Maãu caáy. Ñoù laø maãu thöïc vaät duøng ñeå nhaân gioáng. Maãu caáy coù theå laø ñoaïn caønh caét, laùt moûng, choài hoaëc haït. • Taïo phoâi voâ tính. Söï hình thaønh phoâi töø caùc teá baøo sinh döôõng chöù khoâng phaûi töø hôïp töû sau khi thuï phaán. • Callus. Söï hình thaønh caùc teá baøo khoâng phaân hoùa (thöôøng laø töø caùc teá baøo nhu moâ). GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  7. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 6 - II. TAÙI SINH CAÂY CON TRONG NUOÂI CAÁY MOÂ. Phöông phaùp nhaân gioáng trong oáng nghieäm coù theå ñöôïc söû duïng coù hieäu quaû trong haøng loaït kieåu thao taùc cho naåy maàm vaø taùi sinh caây con neáu coù bieän phaùp baûo veä ñeå traùnh söï nhieãm taïp vaø khi nhöõng trôû ngaïi mang tính di tröyeàn cuûa maãu caáy ñöôïc khaéc phuïc. 1. Nhaân gioáng töø haït trong ñieàu kieän voâ truøng. Thaønh coâng cuûa phöông phaùp nhaân gioáng töø haït ñaït ñöôïc ñoái vôùi haït hoa lan. Haït hoa lan raát beù, khoâng chöùa chaát dinh döôõng döï tröõ vaø noùi chung phuï thuoäc vaøo quan heä coäng sinh vôùi moät soá loaïi naám ñaëc hieäu ñeå tieáp nhaän chaát dinh döôõng. Ngöôøi ta ñaõ tính ñöôïc khoaûng 30.000 haït trong moät quaû Catleya. Naêm 1922 Levis Knudson thoâng baùo keát quaû nuoâi caáy thaønh coâng hoa lan trong moâi tröôøng nuoâi caáy khoâng coäng sinh coù cung caáp muoái khoaùng vaø ñöôøng saccharose. Cô sôû cuûa söï thaønh coâng naøy laø söï phaùt hieän raèng calcium hypochloride coù theå ñöôïc söû duïng ñeå khöû truøng beà maët maø khoâng gaây ñoäc cho phoâi ñang naåy maàm. Quy trình naøy ñaõ ruùt ngaén ñaùng keå thôøi gian nhaân gioáng. Hieän nay noù vaãn ñöôïc söû duïng ñeå cho naåy maàm caùc haït lai. 2. Nuoâi caáy phoâi. Nuoâi caáy phoâi bao goàm taùch phoâi töø haït vaø cho noù naåy maàm trong moâi tröôøng voâ truøng. Coâng duïng chuû yeáu cuûa kyõ thuaät naøy laø “cöùu” caùc phoâi khoâng theå naåy maàm beân trong haït tröôùc khi quaû chín. Raát nhieàu caây lai giöõa caùc loaøi böôùc ñaàu ñöôïc nhaân gioáng baèng phöông phaùp naøy raát coù keát quaû nhöng ñoâi khi phoâi bò hoûng trong quaù trình phaùt trieån (hieän töôïng baát thuï cuûa phoâi voâ tính). Nhöõng doøng chín sôùm cuûa nhieàu loaïi caây aên quaû coù xu höôùng cho quaû chín tröôùc khi phoâi cuûa chuùng phaùt trieån ñaày ñuû. Trong ñieàu kieän töï nhieân nhöõng phoâi naøy deã bò hoûng nhöng neáu taùch chuùng vaø nuoâi chuùng trong moâi tröôøng nuoâi caáy thích hôïp thì coù theå laøm cho chuùng naåy maàm. ÖÙng duïng thöù hai cuûa nuoâi caáy phoâi laø kích thích naåy maàm nhöõng haït chín ñang nguû ñeå ruùt ngaén chu trình nhaân gioáng. 3. Nuoâi caáy teá baøo tröùng. Heä thoáng naøy bao goàm nuoâi caáy voâ truøng tröùng taùch rôøi, noaõn (ñaõ thuï phaán hoaëc chöa thuï phaán), vaø thöïc giaù noaõn gaén beân trong teá baøo tröùng. Maëc duø kyõ thuaät naøy ñaõ ñöôïc söû duïng laàn ñaàu tieân ñeå nghieân cöùu caùc vaán ñeà veà caây aên quaû vaø söï phaùt trieån cuûa haït, quy trình thích hôïp ñaõ ñöôïc söû duïng trong nhaân gioáng, ñaëc bieät laø trong vieäc laøm hoaøn thieän boä gen. Teá baøo tröùng chöa thuï tinh ñöôïc taùch vaø caáy trong moâi tröôøng dinh döôõng cuøng vôùi phaán hoa vaø sau ñoù cho thuï phaán trong oáng nghieäm. Quy trình naøy ñaõ ñöôïc söû duïng raát coù hieäu quaû ñoái vôùi nhöõng caây coù nhieàu loaïi teá baøo tröùng. Phaán hoa coù theå ñaët tröïc tieáp vaøo thöïc giaù noaõn ñeå oáng phaán coù theå phaùt trieån tröïc tieáp vaøo teá baøo tröùng. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  8. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 7 - Teá baøo tröùng nuoâi caáy raát coù hieäu quaû trong vieäc cöùu phoâi khi coøn raát non neáu nhö chuùng chöa bò taùch khoûi caây meï. Ñaây laø kyõ thuaät ñôn giaûn hôn nhieàu so vôùi nuoâi caáy phoâi. Caùc teá baøo tröùng coù theå ñöôïc khöû truøng deã daøng hôn vaø noùi chung coù theå sinh tröôûng deã daøng trong moâi tröôøng cô baûn coù chöùa muoái khoaùng, ñöôøng vaø ñoâi khi caàn theâm moät soá phytohormone. Kyõ thuaät nuoâi teá baøo tröùng ít phoå bieán vaø coù nhu caàu dinh döôõng khoaùng thay ñoåi. Ñoái vôùi ña soá caùc loaøi moâi tröôøng cô baûn veà muoái khoaùng voâ cô vaø ñöôøng laø quan troïng, nhöng auxin coù theå caàn ñöôïc söû duïng ñeå kích thích sinh tröôûng. III. NHAÂN GIOÁNG CAÂY CON BAÈNG BIEÄN PHAÙP NUOÂI CAÁY MOÂ. Vi nhaân gioáng phaàn lôùn caây troàng bao goàm 4 giai ñoaïn chuû yeáu ñöôïc thöïc hieän treân caùc moâi tröôøng khaùc nhau vaø chòu caùc bieän phaùp kieåm tra khaùc nhau: - Giai ñoaïn I: Kieán laäp, töùc taïo caùc ñieàu kieän caàn thieát ñeå taùi sinh caây con töø maãu caáy; - Giai ñoaïn II: Nhaân caây gioáng - Giai ñoaïn III: Taïo reã; - Giai ñoaïn IV: Laøm cho caùc caây taùi sinh thích nghi khí haäu. 1.Giai ñoaïn I. Kieán laäp vaø oån ñònh maãu caáy. Muïc tieâu cuûa giai ñoaïn I laø ñaët thaønh coâng maãu caáy vaøo moâi tröôøng voâ truøng baèng caùch traùnh bò nhieãm taïp vaø chuaån bò ñaày ñuû moâi tröôøng trong oáng nghieäm ñeå taùi sinh ñöôïc caây con moät caùch oån ñònh. Giai ñoaïn naøy bao goàm caùc noäi dung sau: 1/ Choïn maãu caáy. Söï löïa choïn vaø duy trì nguoàn thöïc vaät laø yeáu toá quan troïng ñaûm baûo söï thaønh coâng cuûa vi nhaân gioáng. Coù 3 khía caïnh ñoøi hoûi phaûi ñaëc bieät quan taâm: a/ Ñaëc ñieåm di truyeàn vaø phaùt sinh caù theå cuûa nguoàn thöïc vaät duøng ñeå nhaân gioáng. b/ Kieåm tra nguoàn gaây beänh. c/ Ñieàu kieän sinh lyù cuûa caây cho pheùp söû duïng noù trong nhaân gioáng. Tröôùc heát, xaùc ñònh ñuùng ñaëc ñieåm di truyeàn laø raát quan troïng bôûi vì söï nhaàm laãn ôû giai ñoaïn naøy coù theå laøm naåy sinh nhöõng vaán ñeà phöùc taïp vaø gaây neân söï thieät haïi ñaùng keå veà kinh teá tröôùc khi tìm ñöôïc con ñöôøng chuyeån sang caùc giai ñoaïn tieáp theo. Trong soá caùc loaøi vaø gioáng caây troàng khaùc nhau coù söï bieán ñoäng ñaùng keå veà khaû naêng taùi sinh caây con trong caùc ñieàu kieän nhaân gioáng khaùc nhau. Caàn phaûi thöïc hieän söï nghieân cöùu moät caùch coù heä thoáng ñeå coù ñöôïc nhöõng kieán thöùc vaø kinh nghieäm caàn thieát ñoái vôùi töøng loaïi caây. Caàn phaûi daønh thôøi gian ñeå xaùc ñònh nhu caàu cuûa nhöõng gioáng caây chöa quen thuoäc, maëc duø, noùi chung, coù theå tìm ñöôïc thoâng tin veà nhöõng gioáng caây ñoù trong caùc taøi lieäu ñaõ xuaát baûn. Noùi chung, nhöõng thöïc vaät deã nhaân gioáng baèng caùc bieän phaùp thoâng thöôøng thì cuõng ñeã thöïc hieän vi nhaân gioáng. Ví duï caùc loaïi thaûo moäc vöøa deã nhaân gioáng thoâng thöôøng vöøa deã thöïc hieän vi nhaân gioáng. Trong khi ñoù caùc loaïi caây goã thì khoù GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  9. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 8 - taùi sinh hôn nhieàu vaø ñeã nhaân gioáng chuùng caàn phaûi tìm ñöôïc caùc phöông phaùp thích hôïp. Thaønh coâng trong vi nhaân gioáng caùc loaøi caây goã raát phuï thuoäc vaøo ñaëc ñieåm cuûa caây non duøng ñeå nhaân gioáng. Vi nhaân gioáng caây con moïc töø haït deã hôn nhieàu so vôùi nhöõng caây ñaõ tröôûng thaønh, vaø caùc chuûng khaùc nhau cuûa cuøng moät loaøi caây troàng thöôøng coù caùc yeâu caàu ñaëc tröng rieâng trong vi nhaân gioáng. Noùi chung, yeáu toá haïn cheá trong vi nhaân gioáng laø söï hình thaønh reã chöù khoâng phaûi laø taêng sinh tröôûng boä reã ñaõ hình thaønh. Caùc thao taùc nhaèm thu nhaän nhöõng caây gioáng treû hoùa bao goàm söï löïa choïn nhöõng boä phaän coøn treû cuûa phaàn goác caây con sinh ra töø haït ñeå taïo ra choài baát ñònh vaø phoái hôïp baèng caùch gheùp nhöõng choài baát ñònh naøy vôùi caây con sinh tröôûng töø haït. Muïc ñích cuûa vi nhaân gioáng laø taïo ñöôïc caây gioáng treû hoùa coù ñaày ñuû khaû naêng ra reã. Söï tieán boä veà khaû naêng ra reã vaø song song vôùi noù laø nhöõng bieán ñoåi veà söùc khoûe vaø hình thaùi cuûa caây con ñaõ ñöôïc ghi nhaän ôû moät soá loaøi caây goã. 2/ Khöû truøng maãu caáy. Caùc yeáu toá gaây nhieãm trong vi nhaân gioáng bao goàm: a/ Nhieãm naám, naám moác, naám men vaø vi khuaån treân beà maët maãu caáy; b/ Nhieãm virus vaø caùc cô theå töông töï virus; c/ Caùc nguoàn beänh beân trong. Trong moät soá tröôøng hôïp caùc yeáu toá gaây nhieãm khoâng chæ laøm öùc cheá sinh tröôûng vaø söï ra reã cuûa caây con thu nhaän ñöôïc trong vi nhaân gioáng maø coøn duy trì taùc duïng öùc cheá naøy sau khi troàng caây con thu nhaän ñöôïc ra vöôøn öôm. Caùc yeáu toá gaây nhieãm haàu nhö coù maët khaép moïi nôi. Ñeå dieät tröø chuùng thöôøng hay söû duïng caùc chaát hoùa hoïc maø thoâng duïng nhaát laø Calcium hypochloride vaø Natrium hypochloride. Nhöõng chaát naøy gaây taùc duïng ñoäc cho vi sinh vaät gaây nhieãm nhöng ít ñoäc ñoái vôùi caây troàng ñöôïc nhaân gioáng trong oáng nghieäm. 3/ Ñieàu kieän sinh lyù laø söï xöû lyù maãu caáy ñeå vieäc nuoâi caáy deã thaønh coâng hôn. Coù 3 ñieàu kieän sinh lyù quan troïng laø: a/ Maãu caáy laáy töø nhöõng caây troàng trong caùc thuøng chöùa nuoâi trong nhaø kính vôùi söï kieåm tra moâi tröôøng chaët cheõ; b/ Phaûi taïo ñöôïc nhöõng caây gioáng khoûe maïnh; c/ Xöû lyù phytohormone. 4/ Moâi tröôøng nuoâi caáy. Moâi tröôøng nuoâi caáy thöôøng duøng laø moâi tröôøng nöûa raén coù chöùa agar hoaëc caùc saûn phaåm thöông maïi töông töï, caùc muoái khoaùng dinh döôõng ña löôïng vaø vi löôïng, nguoàn naêng löôïng maø chuû yeáu laø ñöôøng saccharose vaø moät soá vitamin caàn thieát. Ngoaøi ra, trong phaàn lôùn moâi tröôøng coøn coù chöùa caùc loaïi phytohormone thuoäc hai nhoùm auxin vaø cytokinin vôùi tyû leä thích hôïp ñoái vôùi töøng loaïi caây. Toác ñoä taùi sinh caây con trong caùc moâi tröôøng naøy tuøy thuoäc vaøo töøng loaïi caây troàng. 5/ Dòch ræ trong vi nhaân gioáng. Moät hieän töôïng khoâng mong muoán thöôøng xaûy ra khi tieán haønh vi nhaân gioáng vaø hieän töôïng dòch ræ töø maãu caáy thoaùt ra. Gaây taùc GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  10. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 9 - haïi nhieàu nhaát laø caùc hôïp chaát phenol khaùc nhau. Khi chuùng bò oxy hoùa seõ laøm cho moâi tröôøng ngaõ sang maøu naâu, öùc cheá söï taùi sinh vaø sinh tröôûng cuûa caây con. Ñeå haïn cheá taùc haïi cuûa loaïi dòch ræ naøy caàn phaûi coù bieän phaùp xöû lyù maø chuû yeáu laø söû duïng caùc chaát choáng oxy hoùa, keå caû boå sung caùc chaát haáp phuï vaøo moâi tröôøng nhö polyvinylpyrrolidone hoaëc than hoaït tính. 6/ Laøm oån ñònh maãu caáy. Caùc maãu caáy ñoøi hoûi phaûi ñöôïc caét vaø caáy chuyeàn nhieàu laàn ñeå taïo ra nhöõng caây con ñoàng nhaát vaø sinh tröôûng toát. Phaàn lôùn caây moät naêm vaø caây thaûo moäc ñöôïc oån ñònh nhanh choùng sau moät soá laàn caáy, trong khi ñoù caây goã ñoøi hoûi nhieàu laàn caáy hôn, thaäm chí raát khoù ñaït ñöôïc tính oån ñònh. Söï khoù khaên trong vieäc laøm oån ñònh maãu caáy thöôøng gaèn lieàn vôùi traïng thaùi sinh tröôûng cuûa maãu caáy: maãu caáy coøn non deã ñöôïc oån ñònh hôn. Muøa vuï sinh tröôûng cuûa maãu caáy cuõng lieân quan vôùi söï oån ñònh naøy. 2.Giai ñoaïn 2: nhaân gioáng. Muïc ñích cuûa giai ñoaïn 2 laø duy trì vieäc vi nhaân gioáng ôû traïng thaùi oån ñònh vaø nhaân ñöôïc nhieàu caây con theo yeâu caàu. Moâi tröôøng cô baûn cuûa giai ñoaïn 2 cuõng gioáng nhö giai ñoaïn 1.Toác ñoä vi nhaân gioáng nhanh choùng saûn phaåm thöông maïi coù theå ñoøi hoûi söï toái öu hoùa khoâng nhöõng caùc nguyeân toá voâ cô maø caû caùc yeáu toá khaùc cuûa moâi tröôøng. Ñieàu. naøy coù theå thöïc hieän ñöôïc baèng caùch thöû moät caùch heä thoáng caùc noàng ñoä khaùc nhau cuûa caùc nguyeân toá söû duïng trong söï phoái hôïp vôùi caùc yeáu toá khaùc. Caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng ñöôïc duøng ñeå duy trì möùc ñoä sinh tröôûng cô baûn cuõng nhö phaûn öùng phaùt trieån cuûa caây nhaân gioáng. Cytokinin ôû moät soá noàng ñoä coù taùc duïng khaù maïnh trong vieäc kích thích taïo choài. Noùi chung, noàng ñoä toái thieåu cuûa cytokinin kích thích taïo choài ñöôïc löïa choïn trong quaù trình nhaân gioáng. Noàng ñoä cao cuûa cytokinin vaãn kích thích taïo choài nhöng coù theå öùc cheá quaù trình sinh tröôûng cuûa choài theo chieàu daøi. Vì vaäy, xaùc ñònh chính xaùc noàng ñoä cytokinin laø raát caàn thieát. Auxin thöôøng ñöôïc duøng vôùi noàng ñoä thaáp hoaëc khoâng ñöôïc söû duïng ôû giai ñoaïn 2. Tæ leä nhaân gioáng laø soá caây thu ñöôïc trong moät laàn vi nhaân gioáng. Noùi chung, tæ leä nhaân gioáng töø choái baát ñònh lôùn hôn so vôùi töø choài naùch. Tuy nhieân, tæ leä nhaân gioáng töø moät soá loaïi choài ñaëc bieät thöôøng coù theå cao hôn choài baát ñònh. Vì vaäy, tæ leä nhaân gioáng cao nhaát khoâng nhaát thieát phaûi laø ñaùng ao öôùc nhaát ñeå duy trì chaát löôïng cuûa caây con thu ñöôïc.Taàn soá nhaân gioáng coù theå keùo daøi töø hai ñeán taùm tuaàn. Kyõ thuaät caáy chuyeàn caàn ñöôïc toái öu hoaù ñoái vôùi töøng loaïi caây troàng, bao goàm kích thöôùc vaø tính muøa vuï cuûa maãu caáy, phöông phaùp caét vaø höôùng ñaët maãu caáy leân moâi tröôøng. 3.Giai ñoaïn 3: hình thaønh reã. Chöùc naêng cuûa giai ñoaïn naøy laø taïo reã cho maãu caáy chuyeàn ñeå sau ñoù mang chuùng ra troàng treân moâi tröôøng voâ truøng cuûa vöôøn öôm. Vieäc taïo reã coù theå ñöôïc thöïc hieän beân trong hoaëc beân ngoaøi oáng nghieäm vaø bao goàm caùc caùch sau: Taïo reã trong oáng nghieäm. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  11. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 10 - a/ Caáy chuyeàn caùc ñoát caáy sang moâi tröôøng taïo reã coù tæ leä phytohormone thay ñoåi baèng caùch giaûm hoaëc hoaøn toaøn khoâng chöùa cytokinin vaø taêng auxin. Haøm löôïng muoái khoaùng thöôøng giaûm ñi moät nöûa. b/ Caáy chuyeàn caùc ñoát caáy sang moâi tröôøng taïo reã (thöôøng laø moâi tröôøng nöôùc) trong moät vaøi ngaøy vaø sau ñoù caáy chuyeàn chuùng sang moâi tröôøng khoâng chöùa auxin ñeå taïo reã. Maãu caáy coù theå ñöôïc ñaët döôùi aùnh saùng hoaëc trong toái ñoái vôùi vaøi loaøi, trong moâi tröôøng coù theå chöùa caùc yeáu toá boå sung höõu ích, ví duï phloroglucinol. Taïo reã beân ngoaøi oáng nghieäm Nhieàu heä thoáng vi nhaân gioáng thöông maïi hoaëc thöïc nghieäm traùnh taïo reã trong oáng nghieäm baèng caùch xöû lyù maãu caáy baèng auxin maø ñaët chuùng tröïc tieáp vaøo moâi tröôøng taïo reã trong ñieàu kieän söông muø hoaëc coù ñoä aåm cao ñeå cho chuùng ra reã. Phöông phaùp naøy khoâng nhöõng taïo ra söï di chuyeån toát ñeïp maãu caáy töø moâi tröôøng oáng nghieäm ra ñieàu kieän beân ngoaøi maø coøn giuùp tieát kieäm thieát bò nuoâi caáy. Coù hai caùch thöïc hieän: a/ Xöû lyù maãu caáy baèng auxin (thöôøng duøng IBA) baèng caùch nhuùng nhanh chuùng vaøo dung dòch phytohormone vaø gaén chuùng vaøo moâi tröôøng trong vöôøn öôm coù ñoä aåm cao; b/ Xöû lyù maãu caáy baèng auxin töø 5 ñeán 15 ngaøy nhö xöû lyù trong oáng nghieäm treân agar hoaëc trong moâi tröôøng nöôùc, sau ñoù röûa saïch agar vaø ñaët chuùng vaøo moâi tröôøng ngoaøi oáng nghieäm. Coù söï khaùc bieät roõ raøng veà hình thaùi giöõa söï hình thaønh reã trong oáng nghieäm vaø ngoaøi oáng nghieäm. Caùc maãu caáy ngoaøi oáng nghieäm coù xu höôùng taïo reã “bình thöôøng” hôn caù maãu caáy trong oàng nghieäm. Sau khi chuyeån ra troàng ôû vöôøn öôm nhöõng caây taïo reã trong oáng nghieäm coù theå bò cheát, trong khi nhöõng caây taïo reã ngoaøi oáng nghieäm deã thích nghi vôùi ñieàu kieän moâi tröôøng hô vaø coù tæ leä soáng soùt cao. Moät khía caïnh toát cuûa nhaân gioáng trong oáng nghieäm laø nhieàu loaïi thöïc vaät thoâng thöôøng khoù ra reã baèng caùch giaâm caønh ngoaøi oáng nghieäm laïi coù theå ra reã khi tieán haønh vi nghaân gioáng trong oáng nghieäm. Ñieàu naøy chuû yeáu lieân quan vôùi traïng thaùi tröôûng thaønh cuûa caây duøng laøm maãu caáy, bôùi vì nhöõng maãu caáy laáy töø khu vöïc coøn non cuûa caây thöôøng deã nhaân gioáng hôn. 4.Giai ñoaïn 4. Laøm cho caùc caây taùi sinh thích nghi khí haäu. Giai ñoaïn naøy bao goàm söï di chuyeån töø ñaëc ñieåm dò döôõng (caàn cung caáp ñöôøng) sang ñaëc ñieåm töï döôõng (coù khaû naêng quang hôïp) vaø söï thích nghi cuûa caây con môùi taùi sinh vôùi moâi tröôøng ngoaøi oáng nghieäm. Giöõ cho soá caây con naøy tieáp tuïc sinh tröôûng laø raát quan troïng vì söï thích nghi vôùi khí haäu vaø phaùt trieån trong ñieàu kieän töï döôõng raát phuï thuoäc vaøo khaû naêng sinh tröôûng tieáp tuïc cuûa caây con töø sau khi ñöa chuùng ra khoûi oáng nghieäm. Nhöõng caây con taùi sinh trong oáng nghieäm caàn phaûi giöõ trong ñieàu kieän coù ñoä aåm cao ñeå thích nghi daàn vôùi ñieàu kieän moâi tröôøng, ñaëc bieät laø laøm cho chuùng traùnh bò maát nöôùc. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  12. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 11 - Nhöõng choài con hình thaønh trong quaù trình vi nhaân gioáng coù hình thaùi laù khaù ñaëc bieät. Kích thöôùc laù vaø soá lôùp teá baøo taïo ra laù thaáp hôn ñaùng keå so vôùi nhöõng laø hình thaønh sau khi chuyeån caây con ra vöôøn öôm. Do ñoä aåm cao trong oáng nghieäm treân laù khoâng phaùt trieån lôùp saùp baûo veä vôùi soá löôïng vaø chaát löôïng caàn thieát. Keát quaû laø nhöõng laù hình thaønh trong vi nhaân gioáng bò khoâ raát nhanh sau khi ñöôïc ruùt ra khoûi oáng nghieäm. Xöû lyù ñeå thuùc ñaåy toác ñoä thích nghi vôùi khí haäu. Tröôùc khi ñöa caây ra khoûi oáng nghieäm: a/ Laøm giaûm ñoäâ aåm (khoaûng 35%) cuûa moâi tröôøng trong oáng nghieäm tröôùc khi ñöa caây con ra ngoaøi. Coâng vieäc naøy coù theå ñöôïc thöïc hieän baèng caùch ñaët chaát huùt aåm vaøo oáng nghieäm hoaëc laøm laïnh ñaùy oáng nghieäm. Môû naép oáng nghieäm töø 5 ñeán 7 ngaøy tröôùc khi ñem caây con ra ngoaøi coù theå laø moät bieän phaùp hieäu quaû. b/ Laøm taêng khaû naêng thaåm thaáu cuûa moâi tröôøng (thöôøng ñöôïc thöïc hieän baèng caùch boå sung theâm ñöôøng saccharose). c/ Söû duïng caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng tröôùc khi ñöa caây con ra ngoaøi coù theå mang laïi caùc keát quaû khaû quan khaùc nhau. Sau khi ñöa caây ra khoûi oáng nghieäm: a/ Giaûm töø töø ñoä aåm laø bieän phaùp xöû lyù thoâng duïng nhaát ñeå laøm cho caây con thích nghi vôùi khí haäu. Ñoä aåm coù theå duy trì baèng caùch xöû lyù söông muø giaùn ñoän hoaëc ñaët caây con trong maøng polyethylene. Ñaây laø böôùc raát quan troïng trong quaù trình cho caây laøm quen vôùi khí haäu. b/ Choáng thoaùt hôi nöôùc baèng caùc ñoäc toá thöïc vaät. Coâng vieäc naøy khoâng ñöôïc söû duïng roäng raõi vôùi muïc ñích thöông nghieäp. IV. SÔ LÖÔÏC LÒCH SÖÛ PHAÙT TRIEÅN CUÛA NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT. Sau khi hoïc thuyeát teá baøo cuûa Schwan vaø Schleiden ra ñôøi naêm 1838 nhieàu nhaø sinh hoïc tin töôûng raèng baèng caùch nuoâi caáy ngöôøi ta coù theå taïo thaønh coâng caùc phoâi nhaân taïo, vaø töø ñoù taïo caùc caây con hoaøn chænh, töø caùc teá baøo sinh döôõng. Giai ñoaïn ñaàu tieân cuûa lòch söû phaùt trieån cuûa nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät coù theå ñöôïc ñaùnh daáu baèng nhöõng thí nghieäm ñaàu tieân cuûa Kotte vaø Robbins. Naêm 1922 hai nhaø khoa hoïc naøy ñaõ böôùc ñaàu thaønh coâng trong vieäc duøng ñænh sinh tröôûng ñeå nuoâi caáy reã cuûa moät caây hoøa thaûo trong moâi tröôøng loûng coù chöùa muoái khoaùng vaø glucose. Giai ñoaïn thöù hai ñöôïc baét ñaàu naêm 1934 khi White, moät nhaø sinh hoïc ngöôøi Myõ, ñaõ nuoâi caáy thaønh coâng trong moät thôøi gian daøi ñaàu reã caø chua (Lycopersicum esculenttum) trong moät moâi tröôøng loûng chöùa muoái khoaùng, glucose vaø nöôùc chieát naám men, vaø sau ñoù thay theá nöôùc chieát naám men baèng hoãn hôïp 3 loaïi vitamin nhoùm B laø vitamin B1, vitamin B6 vaø vitamin PP. Sau khi Went vaø Thimann phaùp hieän chaát kích thích sinh tröôûng thöïc vaät ñaàu tieân laø IAA, naêm 1939 Gautheret ñaõ söû duïng thaønh coâng chaát naøy vaø caùc vitamin GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  13. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 12 - nhoùm B noùi treân ñeå kích thích sinh tröôûng moâ seïo cuûa caây caø roát vaø duy trì sinh tröôûng cuûa moâ seïo naøy trong thôøi gian voâ haïn treân moâi tröôøng thaïch. Naêm 1941 Overbeck chöùng minh taùc duïng kích thích sinh tröôûng cuûa nöôùc döøa trong nuoâi caáy phoâi caây hoï caø (Dacura); vaø sau ñoù, naêm 1948, Steward xaùc nhaän taùc duïng cuûa nöôùc döøa treân moâ seïo caø roát. Trong thôøi gian naøy cuøng vôùi IAA moät soá auxin khaùc ñaõ ñöôïc phaùt hieän vaø toång hôïp thaønh coâng, nhö NAA vaø 2,4D. Nhieàu taùc giaû nhaän thaáy cuøng vôùi nöôùc döøa 2,4D vaø NAA ñaõ giuùp taïo moâ seïo vaø phaân chia teá baøo ôû nhieàu thöïc vaät raát khoù nuoâi caáy. Naêm 1954 Skook phaùt hieän moät loaïi phytohormone ñaàu tieân thuoäc nhoùm cytokinin laø 6-furfuryllaminopurin (kinetin) töø dòch thuûy phaân ADN vaø taùc duïng kích thích sinh tröôûng cuûa noù ñoái vôùi moâ thaân caây thuoác laù. Vieäc phaùt hieän vai troø cuûa IAA, NAA, 2,4D, vaø kinnetin cuøng vôùi phaùt hieän vai troø cuûa nöôùc döøa vaø vitamin laø nhöõng böôùc tieán raát quan troïng trong quaù trình phaùt trieån cuûa nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät. Ñoù laø tieàn ñeà kyõ thuaät cho vieäc xaây döïng caùc moâi tröôøng nuoâi caáy oån ñònh veà maët hoùa hoïc ñeå thöïc hieän caùc thí nghieäm vaø nghieân cöùu khaùc nhau, daãn ñeán söï phaùt trieån nhanh choùng cuûa kyõ thuaät nuoâi caáy moâ trong giai ñoaïn tieáp theo. Ñaëc bieät quan troïng laø phaùt hieän cuûa Skoog vaø Miller naêm 1957 veà aûnh höôûng cuûa tæ leä cytokinin/auxin trong moâi tröôøng nuoâi caáy ñoái vôùi söï hình thaønh cô quan cuûa moâ seïo thuoác laù. Khi tæ leä naøy thaáp moâ seïo coù khuynh höôùng phaùt trieån reã; ngöôïc laïi, khi tæ leä naøy cao thì moâ seïo coù khuynh höôùng taïo choài. Hieän töôïng naøy ñöôïc xaùc nhaän ôû nhieàu caây khaùc nhau vaø ñoùng goùp raát lôùn vaøo vieäc ñieàu khieån sinh tröôûng, phaùt trieån, phaùt sinh cô quan cuûa moâ teá baøo nuoâi caáy. Thaønh coâng cuûa Skoog vaø Miller daãn ñeán nhieàu phaùt hieän quan troïng khaùc, môû ñaàu cho giai ñoaïn thöù ba cuûa nuoâi caáy moâ thöïc vaät. Giai ñoaïn naøy ñöôïc ñaùnh daáu baèng nhöõng thaønh coâng sau ñaây: - Taùch vaø nuoâi caáy thaønh coâng caùc teá baøo ñôn ôû daïng huyeàn phuø vaø nuoâi caáy chuùng trong thôøi gian daøi (Muir, Hildebrandt vaø Riker, 1954 – 1959;, Nickell, 1956; Bergman, 1960 ) Nhieàu taùc giaû ñaõ thaønh coâng trong vieäc taïo ñöôïc caây hoaøn chænh töø moät teá baøo, chöùng minh cho tính toaøn theå cuûa teá baøo thöïc vaät. Thaønh coâng naøy môû ra nhöõng trieån voïng môùi trong vieäc taïo ra caùc doøng teá baøo ñoät bieán, caùc doøng teá baøo sieâu saûn xuaát (over-production) moät saûn phaåm thöù caáp naøo ñoù vaø khaû naêng taàn soá ñoät bieán trong di truyeàn ñoät bieán ôû thöïc vaät baäc cao; - Thaønh coâng trong nuoâi caáy tuùi phaán ñeå taïo caây ñôn boäi (Guha vaø Maheswari, 1966 ñoái vôùi caây caø ñoäc döôïc; Bourgin vaø Nitsch 1967 ñoái vôùi caây thuoác laù ). Ngaøy nay vieäc taïo caây ñôn boäi qua nuoâi caáy tuùi phaán vaø haït phaán ñaõ thaønh coâng ôû raát nhieàu caây vaø ñaõ ñoùng goùp voâ cuøng to lôùn vaøo vieäc taêng theâm kieán thöùc di truyeàn thöïc vaät vaø thöïc tieãn choïn gioáng. - Phaùt hieän cuûa Cooking (1960) trong vieäc phaân huûy voû cellulose cuûa vaùch teá baøo thöïc vaät, taïo ra caùc teá baøo traàn (protoplast). Sau ñoù (1970) Nagata vaøTakebe taïo laïi ñöôïc voû cellulose cho nhöõng teá baøo traàn naøy vaø Takabe, Labid Melchers ñaõ GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  14. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 13 - nuoâi caáy vaø taùi sinh caùc caây hoaøn chænh töø protoplast. Do protoplast coù khaû naêng dung hôïp vôùi nhau vaø haáp thu caùc phaân töû lôùn hoaëc thaäm chí caùc cô quan töø beân ngoaøi neân vieäc nuoâi caáy thaønh coâng protoplast vaø taùi sinh caây hoaøn chænh töø chuùng môû ra trieãn voïng öùng duïng thaønh coâng naøy trong coâng taùc taïo gioáng, choïn gioáng. Ngaøy nay hy voïng naøy ñaõ ñöôïc thöïc hieän, khi nhieàu nhoùm nghieân cöùu khaùc nhau treân theá giôùi coâng boá lai thaønh coâng giöõa loaøi nhôø kyõ thuaät protoplast, moät vieäc khoâng theå thöïc hieän ñöôïc baèng lai höõu tính coå ñieån. Veà maët lyù luaän, protoplast laø coâng cuï khoâng thay theá ñöôïc ñeå nghieân cöùu hieän töôïng nhieãm saéc theå hoøa hôïp cuûa caùc teá baøo khaùc loaøi sau khi dung hôïp vaø vai troø cuûa ADN trong caùc cô quan töû vaø quan heä cuûa chuùng vôùi ADN cuûa nhaân teá baøo. - Thaønh coâng trong coâng ngheä chuyeån gen töø nhöõng naêm 1980-1982. Ngöôøi ta söû duïng caùc plasmid, töùc caùc phaân töû ADN voøng thöôøng coù trong caùc teá baøo vi khuaån ñeå chuyeån taûi caùc gen töø protoplast naøy ñeán protoplast khaùc. Baèng caùch ñoù ngöôøi ta ñaõ ñöa ñöôïc caùc gen ngoaïi lai vaøo teá baøo thöïc vaät. Tieáp sau ñoù ngöôøi ta coøn söû duïng caùc bieän phaùp khaùc ñeå chuyeån gen trong nuoâi caáy protoplast nhö kyõ thuaät söû duïng thieát bò xung ñieän (electroprorator), kyõ thuaät vi tieâm ( microinjection), kyõ thuaät sieâu aâm (ultrasonic gen transfer), kyõ thuaät baén gen (gene gun) - Thaønh coâng trong coâng taùc nhaân gioáng vaø phuïc traùng gioáng baèng phöông phaùp nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng. Ngay töø 1969 Morel ñaõ nhaän thaáy ñænh sinh tröôûng cuûa caùc loaøi ñòa lan (Cymbidium) khi ñem nuoâi caáy seõ hình thaønh caùc protocorm. Khi chia caét nhöõng protocorm naøy ñeå tieáp tuïc nuoâi caáy seõ hình thaønh nhöõng protocorm môùi. Khi ñeå trong nhöõng ñieàu kieän nhaát ñònh, nhöõng protocorm naøy seõ taùi sinh thaønh nhöõng caây hoaøn chænh. Hôn nöõa, caùc teá baøo ôû ñænh sinh tröôûng cuûa thöïc vaät chöùa raát ít hoaëc hoaøn toaøn khoâng chöùa virus, do ñoù, vôùi phöông phaùp nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng Morel coù theå phuïc traùng, taïo caùc doøng voâ tính khoâng bò nhieãm virus. Vieäc öùng duïng nuoâi caáy moâ thöïc vaät trong nhaân gioáng ñöôïc Nozeran naâng leân moät möùc môùi khi oâng nhaän thaáy söï hoùa treû cuûa caùc choài naùch caây nho vaø caây khoai taây ñem nuoâi caáy vaø caáy chuyeàn nhieàu laàn trong oáng nghieäm. Vieäc öùng duïng nuoâi caáy moâ trong nhaân gioáng vaø phuïc traùng gioáng ngaøy nay khoâng coøn haïn cheá ôû moät vaøi loaïi caây maø ñaõ ñöôïc thöïc hieän ôû quy moâ thöông maïi ñoái vôùi haøng loaït caây troàng coù yù nghóa kinh teá nhö chuoái, caø pheâ, coï daàu, saén, khoai lang, khoai taây, mía, caây aên quaû coù muùi v.v vaø ñaõ coù nhöõng ñoùng goùp to lôùn cho noâng nghieäp theá giôùi. Ngaøy nay chuùng ta ñang böôùc vaøo giai ñoaïn phaùt trieån thöù tö cuûa nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät. Ñoù laø giai ñoaïn nuoâi caáy moâ thöïc vaät ñöôïc öùng duïng maïnh meõ vaøo thöïc tieãn choïn gioáng, nhaân gioáng, vaøo vieäc saûn xuaát caùc chaát coù hoaït tính sinh hoïc vaø vaøo nghieân cöùu lyù luaän di truyeàn thöïc vaät baäc cao. Nhöõng hieåu bieát cô baûn veà ñôøi soáng cuûa moâ, cuûa teá baøo taùch rôøi trong moâi tröôøng nhaân taïo, veà nhu caàu cuûa chuùng ñoái vôùi nguoàn carbon, dinh döôõng khoaùng, vitamin, phytohormone nhöõng kyõ thuaät cô baûn ñeå taùch, nuoâi caáy, ñieàu khieån söï phaân hoùa töø caùc boä phaän khaùc nhau GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  15. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 14 - cuûa caây troàng laø nhöõng tieàn ñeà ñaõ ñöôïc chuaån bò töø nhöõng giai ñoaïn tröôùc. Ñoàng thôøi, nhieàu coâng ngheä môùi, nhieàu trang thieát bò hieän ñaïi ñaõ ñöôïc phaùt minh ñeå phuïc vuï cho vieäc öùng duïng caùc thaønh töïu cuûa nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät vaøo thöïc tieãn saûn xuaát. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  16. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 15 - CHÖÔNG II. PHOØNG THÍ NGHIEÄM NUOÂI CAÁY MOÂ TEÁ BAØO THÖÏC VAÄT. ÔÛ caùc cô sôû nghieân cöùu vaø saûn xuaát coù söû duïng kyõ thuaät nuoâi caáy moâ khaùc nhau tuøy thuoäc vaøo hoaøn caûnh thöïc teá ngöôøi ta coù theå xaây döïng caùc phoøng thí nghieäm vôùi caùc trang thieát bò vôùi möùc ñoä hieän ñaïi khaùc nhau. Tuy nhieân, taát caû caùc phoøng thí nghieäm naøy ñeàu phaûi ñaûm baûo ñöôïc ba yeâu caàu sau ñaây: - Baûo ñaûm ñieàu kieän voâ truøng; - Choïn ñuùng moâi tröôøng vaø chuaån bò moâi tröôøng ñuùng caùch; - Choïn moâ caáy thích hôïp, xöû lyù moâ caáy thích hôïp tröôùc vaø sau khi caáy. I. BAÛO ÑAÛM ÑIEÀU KIEÄN VOÂ TRUØNG. 1. YÙ nghóa cuaû voâ truøng trong nuoâi caáy moâ thöïc vaät. Moâi tröôøng nuoâi caáy moâ thöïc vaät raát thích hôïp cho naám vaø vi khuaån phaùt trieån. Do toác ñoä sinh tröôûng cuûa naám vaø vi khuaån raát nhanh so vôùi teá baøo thöïc vaät, neân neáu trong thôøi gian nuoâi caáy chæ nhieãm moät vaøi baøo töû naám hoaëc vaøi vi khuaån thì chæ sau vaøi ngaøy hoaëc vaøi tuaàn toaøn boä beà maët cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy moâ seõ bò naám hoaëc vi khuaån phuû ñaày, laøm cho maãu moâ caáy khoâng theå tieáp tuïc sinh tröôûng vaø cheát daàn. Thoâng thöôøng moät chu kyø nuoâi caáy moâ thöïc vaät keùo daøi töø 1 ñeán 5 thaùng, khaùc vôùi thí nghieäm vi sinh vaät, coù theå keát thuùc trong vaøi ngaøy. Nhö vaäy, möùc ñoä voâ truøng trong thí nghieäm nuoâi caáy moâ thöïc vaät ñoøi hoûi raát nghieâm khaéc. 2. Nguoàn nhieãm taïp. Coù ba nguoàn nhieãm taïp chính laø: - Duïng cuï thuûy tinh, moâi tröôøng vaø nuùt ñaäy khoâng ñöôïc voâ truøng tuyeät ñoái; - Treân beà maët hoaëc beân trong moâ caáy toàn taïi caùc sôïi naám, baøo töû naám hoaëc vi khuaån; - Trong khi thao taùc laøm rôi naám hoaëc vi khuaån theo buïi leân beà maët moâi tröôøng. 3. Voâ truøng duïng cu ïthuûy tinh, nuùt ñaäy vaø moâi tröôøng. Duïng cuï thuûy tinh duøng trong nuoâi caáy moâ thöïc vaät caàn phaûi chòu ñöôïc nhieät ñoä 160-180oC khi voâ truøng khoâ vaø 120oC khi voâ truøng öôùt. Tröôùc khi söû duïng, duïng cuï thuûy tinh caàn ñöôïc röûa saïch, ñeå raùo nöôùc vaø khöû truøng khoâ trong tuû saáy ôû 160oC trong 1 giôø. Sau khi ñeå nguoäi ñöôïc laáy ra ñeå vaøo caùc hoäp giaáy kín caát vaøo choã ít buïi. Nuùt ñaäy: thöôøng duøng nhaát laø boâng khoâng thaám nöôùc. Nuùt phaûi töông ñoái chaët ñeå khoâng cho buïi ñi qua, ñoàng thôøi nöôùc töø moâi tröôøng khoâng bò boác hôi quaù deã daøng trong quaù trình nuoâi caáy. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  17. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 16 - Gaàn ñaây ngöôøi ta duøng nhieàu loaïi nuùt ñaäy khaùc thay theá nuùt boâng, nhö nuùt nhöïa (vaø caû bình caáy) chòu nhieät, nuùt cao su, nuùt kim loaïi raát thuaän tieän cho vieäc khöû truøng khoâ hay öôùt. Moâi tröôøng: Noùi chung, moâi tröôøng ñöôïc pha cheá trong ñieàu kieän khoâng voâ truøng vaø ñem haáp voâ truøng khi ñaõ phaân phoái vaøo caùc bình caáy vaø ñaõ ñaäy nuùt hoaëc naép. Thôøi gian voâ truøng töø 20 ñeán 45 phuùt ôû 120oC. Sau khi voâ truøng caàn phaûi laøm khoâ nuùt boâng hoaëc naép ñaäy. Caùc dung dòch meï duøng ñeå pha moâi tröôøng (nhö dung dòch muoái khoaùng, vitamin, phytohormone v.v khoâng neân pha nhieàu (100-200ml) vaø caàn ñöôïc baûo quaûn trong ngaên ñaù cuûa tuû laïnh. Ñoái vôùi caùc chaát khoâng chòu nhieät, coù theå bò phaân huûy ôû nhieät ñoä 120oC caàn tieán haønh loïc voâ truøng (ví duï loïc qua pheãu loïc thuûy tinh soá 5 hay qua caùc loaïi maøng loïc voâ truøng) tröôùc khi ñöôïc ñöa vaøo moâi tröôøng ñaõ haáp voâ truøng. 4. Voâ truøng moâ caáy. Moâ caáy coù theå laø taát caû caùc boä phaän khaùc nhau cuûa thöïc vaät. Tuøy theo söï tieáp xuùc vôùi moâi tröôøng, caùc boä phaän naøy ñeàu chöùa nhieàu hay ít vi khuaån vaø naám. Ñoøng luùa non khi coøn trong beï hay moâ thòt quaû thöôøng ít nhieãm vi sinh vaät, ngöôïc laïi, laù, thaân, ñaëc bieät laø reã do naèm trong ñaát neân coù ñoä nhieãm vi sinh vaät raát cao. Vì vaäy ñoái vôùi caùc loaïi moâ caáy khaùc nhau ngöôøi ta khöû truøng baèng caùc phöông phaùp khaùc nhau. Phöông phaùp voâ truøng moâ caáy thoâng duïng nhaát hieän nay laø duøng caùc chaát hoùa hoïc coù hoaït tính dieät naám dieät khuaån. Hieäu löïc dieät naám, khuaån cuûa caùc chaát naøy phuï thuoäc vaøo thôøi gian xöû lyù, noàng ñoä vaø khaû naêng xaâm nhaäp cuûa chuùng vaøo caùc keõ ngaùch loài loõm treân beà maët moâ caáy, khaû naêng ñaåy heát caùc boït khí baùm treân beà maët moâ caáy. Ñeå taêng tính linh ñoäng vaø khaû naêng xaâm nhaäp cuûa chaát dieät khuaån, thoâng thöôøng ngöôøi ta xöû lyù moâ caáy trong voøng 30 giaây trong röôïu ethylic 70%, sau ñoù môùi xöû lyù dung dòch dieät khuaån. Ñoàng thôøi, ngöôøi ta theâm caùc chaát giaûm söùc caêng beà maët nhö Tween 80, fotoflo, teepol vaøo dung dòch dieät naám khuaån. Caùc chaát dieät naám khuaån thöôøng duøng vaø cho keát quaû raát toát laø calcium hypochloride 9-10% xöû lyù trong thôøi gian 5-30 phuùt, natrium hypochloride 9-10% xöû lyù trong thôøi gian 5-30 phuùt vaø nöôùc broâm 1-2% xöû lyù töø 2-10 phuùt. Ngoaøi ra, hydro peroxide 10-12% xöû lyù trong 5-10 phuùt vaø chlorua thuûy ngaân 0,1-1,0% xöû lyù trong 2-10 phuùt cuõng cho keát quaû toát ñoái vôùi töøng loaïi moâ caáy. Trong thôøi gian xöû lyù moâ caáy phaûi ngaäp hoaøn toaøn trong dung dòch dieät khuaån. Caùc boä phaän coù nhieàu buïi ñaát, tröôùc khi xöû lyù caàn ñöôïc röûa saïch baèng nöôùc maùy. Khi xöû lyù xong, maãu caáy caàn ñöôïc röûa saïch (ít nhaát 3 laàn) baèng nöôùc caát voâ truøng. Nhöõng phaàn treân moâ caáy bò dung dòch khöû truøng laøm cho traéng ra caàn ñöôïc caét boû tröôùc khi ñaët moâ caáy leân moâi tröôøng. Voâ truøng moâ caáy laø moät thao taùc khoù, ít khi thaønh coâng ngay laàn ñaàu tieân. Vì vaäy, caàn phaûi kieân trì tìm cho ñöôïc noàng ñoä vaø thôøi gian voâ truøng thích hôïp cho töøng loaïi moâ caáy. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  18. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 17 - 5. Voâ truøng nôi thao taùc caáy vaø tuû caáy voâ truøng. Moät trong nhöõng nguoàn nhieãm taïp quan troïng vaø thöôøng xuyeân nhaát laø buïi rôi vaøo duïng cuï nuoâi caáy chöùa moâi tröôøng trong khi môû naép hoaëc nuùt boâng trong khi thao taùc caáy. Caàn aùp duïng nhieàu bieän phaùp khaùc nhau ñeå traùnh söï nhieãm taïp naøy. Buoàng caáy: thöôøng laø caùc buoàng coù dieän tích heïp, roäng töø 10-15 m2, coù hai lôùp cöûa ñeå traùnh khoâng khí chuyeån ñoäng töø beân ngoaøi tröïc tieáp ñöa buïi vaøo. Buoàng caáy caàn coù saøn laùt gaïch traùng men, töôøng sôn ñeå coù theå lau röûa thöôøng xuyeân. Maët baøn laøm vieäc cuõng caàn laùt gaïch traùng men hay phuû kính ñeå tieän laøm veä sinh haøng ngaøy. Tröôùc khi laøm vieäc phaûi lau maët baøn baèng coàn 90%. Tröôùc khi ñöa vaøo söû duïng, buoàng caáy caàn ñöôïc xöû lyù hôi formol baèng caùch roùt formol 40% ra moät soá naép ñóa petri ñeå raõi raùc vaøi nôi trong phoøng cho bay hôi töï do. Ñoùng kín cöûa phoøng caáy trong 24 giôø, sau ñoù boû formol ñi vaø khöû hôi formol thöøa baèng dung dòch ammoniac 25% cuõng trong 24 giôø. Caùc duïng cuï mang vaøo buoàng caáy ñeàu phaûi ñöôïc khöû truøng tröôùc: töø quaàn aùo choaøng, muõ vaûi, khaåu trang cuûa ngöôøi caáy ñeán dao keùo, keïp, giaáy boïc, boâng, oáng nghieäm, bình ñöøng nöôùc caát v.v Treân baøn caáy thöôøng xuyeân coù moät ñeøn coàn ñeå söû duïng trong khi caáy vaø moät soá coác ñöïng coàn 90% ñeå nhuùng caùc duïng cuï laøm vieäc. Tröôùc khi caáy, ngöôøi caáy caàn lau tay kyõ ñeán khuyûu tay baèng coàn 90%. Ñeå ñaûm baûo möùc ñoä voâ truøng cao, trong phoøng caáy caàn coù moät ñeøn töû ngoaïi 40W treo treân traàn. Chæ baät saùng ñeøn naøy khi khoâng coù ngöôøi trong phoøng caáy. Caàn giaûm söï chuyeån ñoäng khoâng khí ôû trong buoàng caáy ñeán möùc toái thieåu, vì vaäy caàn traùnh ra vaøo buoàng caáy nhieàu laàn. Ñeå traùnh söï ngoät ngaït trong buoàng caáy, coù theå quaït khoâng khí qua caùc lôùp boâng thuûy tinh ngaên buïi vôùi toác ñoä nhoû vaøo buoàng caáy. Tuû caáy: Trong moät soá tröôøng hôïp ngöôøi ta söû duïng caùc tuû caáy ñoùng baèng goã hoaëc gheùp baèng kính. Tuy nhieân, ngaøy nay caùc loaïi tuû caáy voâ truøng lamine (laminar-aie-flow cabinet) ñöôïc duøng khaù phoå bieán. Ñoù laø loaïi tuû caáy coù thieát bò thoåi khoâng khí ñaõ loïc voâ truøng vaøo choã thao taùc caáy. Nhôø coù heä thoáng maøng loïc, tuû caáy lamine loaïi tröø moät caùch coù hieäu quaû nguoàn nhieãm taïp töø beân ngoaøi vaø taïo ñieàu kieän thoaûi maùi cho ngöôøi caáy. II. CHUAÅN BÒ MOÂI TRÖÔØNG. Thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy moâ thöïc vaät thay ñoåi tuyø thuoäc loaøi, boä phaän nuoâi caáy, muïc ñích nuoâi caáy vaø nhieàu yeáu toá khaùc. Tuy vaäy, taát caû caùc moâi tröôøng nuoâi caáy bao giôø cuõng goàm 3 thaønh phaàn: - Ñöôøng laøm nguoàn carbon, - Caùc muoái khoaùng ña löôïng, - Caùc muoái khoaùng vi löôïng - Caùc vitamin, GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  19. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 18 - - Caùc phytohormone. Ngoaøi ra, ngöôøi ta coøn thöôøng theâm vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy moät soá chaát höõu cô thaønh phaàn hoùa hoïc xaùc ñònh (aminoacid, EDTA ) hoaëc khoâng xaùc ñònh (nöôùc döøa, nöôùc chieát naám men ) 1. Ñöôøng. Trong nuoâi caáy moâ, nguoàn carbon ñeå moâ, teá baøo thöïc vaät toång hôïp neân caùc chaát höõu cô giuùp teá baøo phaân chia, taêng sinh khoái cuûa moâ khoâng phaûi do quang hôïp cung caáp maø do ñöôøng trong moâi tröôøng. Hai daïng ñöôøng thöôøng söû duïng nhaát laø saccharose vaø gucose, nhöng saccharose ñöôïc duøng phoå bieán hôn. Tuøy theo muïc ñích nuoâi caáy, noàng ñoä saccharose bieán ñoåi töø 1-6% (w/v), thoâng duïng nhaát laø 2%, töông öùng vôùi 58,4mM. Trong tröôøng hôïp nuoâi caáy teá baøo quang hôïp noàng ñoä ñöôøng coù theå giaûm xuoáng hoaëc boûhaün. 2. Caùc muoái khoaùng ña löôïng. Nhu caàu muoái khoaùng cuûa moâ teá baøo taùch rôøi khoâng khaùc nhieàu so vôùi caây troàng trong ñieàu kieän töï nhieân. Caùc nguyeân toá ña löôïng caàn phaûi cung caáp laø nitô, phospho, kali, magieâ, saét. Nguoàn nitô: Moâ teá baøo thöïc vaät trong nuoâi caáy coù theå söû duïng caùc daïng nitô khoaùng nhö amoân vaø nitrat, ñoàng thôøi coù theå söû duïng caùc daïng nitô höõu cô nhö aminoacid. Tyû leä giuõa nitô daïng amoân vaø nitrat thích hôïp tuøy theo loaøi caây vaø traïng thaùi phaùt trieån cuûa moâ. Nitrat ñöôïc cung caáp döôùi daïng muoái canxi nitrat (Ca(NO3)2,4H2O), kali nitrat (KNO3), natri nitrat (NaNO3) hoaëc amoân nitrat (NH4NO3). Amoân cung caáp döôùi daïng muoái amoân sulphat (NH4)2SO4 hoaëc amoân nitrat NH4NO3. Trong moät soá ít - + tröôøng hôïp coù theå ñöôïc cung caáp ôû daïng ureâ. Toång noàng ñoä cuûa NO3 vaø NH4 trong moâi tröôøng thay ñoåi töø 3 ñeán 6mM, thoâng thöôøng khoaûng 2mM. Nguoàn phospho: Hai daïng phospho thöôøng duøng nhaát laø NaH2PO4.7H2O vaø KH2PO4. Noàng ñoä phospho trong moâi tröôøng bieán thieân töø 0,15 ñeán 4,00mM, thöôøng duøng khoaûng 1,00mM. Nguoàn kali: Ngöôøi ta thöôøng cung caáp kali cho moâ nuoâi caáy döôùi daïng kali + nitrat KNO3, kali chlorua KCl,kali phosphat KH2PO4. Noàng ñoä K trong moâi tröôøng bieán thieân töø 2 ñeán 25 mM, trung bình khoaûng 10mM. Nguoàn canxi: Canxi ñöôïc cung caáp döôùi daïng muoái canxi nitrat 2+ Ca(NO3)2.4H2O), canxi chlorua CaCl2.6H2O hoaëc CaCl2.2H2O. Noàng ñoä Ca trong moâi tröôøng töù 1,0 ñeán 3,5mM, trung bình laø 2,0mM. Nguoàn magieâ: Magieâ ñöôïc cung caáp döôùi daïng magieâ sunphat MgSO4.7H2O, vôùi noàng ñoä trong moâi tröôøng khoaûng 0,5 – 3,0mM. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  20. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 19 - Nguoàn saét: Nhöõng moâi tröôøng coå ñieån duøng saét ôû daïng chlorua saét FeCl2.FeCl3.6H2O, sulphat saét FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3, citrat saét Fe(C4H4O6). Hieän nay haàu heát caùc phoøng thí nghieäm ñeàu duøng saét ôû daïng chelat keát hôïp vôùi Na2- ethylen diamintetraacetat (EDTA). ÔÛ daïng naøy saét khoâng bò keát tuûa vaø giaûi phoùng daàn ra moâi tröôøng theo nhu caàu cuûa moâ thöïc vaät. 3. Caùc muoái khoaùng vi löôïng. Nhu caàu muoái khoaùng vi löôïng cuûa moâ thöïc vaät trong nuoâi caáy moâ laø lónh vöïc coøn ít ñöôïc nghieân cöùu. Ñeå an toaøn, ngöôøi ta cung caáp haàu heát caùc nguyeân toá vi löôïng caàn thieát ñoái vôùi caây cho moâ nuoâi caáy trong moâi tröôøng nhaân taïo, vì vaäy söï cung caáp naøy coù tính chaát kinh nghieäm chuû nghóa, trong nhöõng tröôøng hôïp cuï theå coù theå laø khoâng caàn thieát. Caùc vi löôïng thoâng duïng ñöôïc giôùi thieäu trong baûng 1. Baûng 1. Caùc vi löôïng thoâng duïng Teân vi löôïng Daïng söû duïng Noàng ñoä µM Mangan (Mn) MnSO4.4H2O 15 – 100 Bo (B) H3BO3 6 – 100 Keõm (Zn) ZnSO4.7H2O 15 – 30 Ñoàng (Cu) CuSO4.5H2O 0,04 – 0,08 Molypden (Mo) (NH4)6Mo7O24.4H2O, NaMoO4.2H2O 0,007 – 1,0 Coban (Co) CoCl2.6H2O 0,1 – 0,4 Ioát (I) KI 2,5 – 20,0 4.Caùc vitamin. Caùc vitamin sau ñaây thöôøng ñöôïc duøng trong caùc moâi tröôøng nuoâi caáy (baûng 2). Baûng 2. Caùc vitamin thöôøng ñöôïc duøng trong caùc moâi tröôøng nuoâi caáy moâ. Teân vitamin Noàng ñoä söû duïng (mg/l) Myo-inozitol 100 Acid nicotinic (Niacin, vitamin PP) 0,5 – 1,0 Pyridoxine HCl (vitamin B6) 0,05 – 0,5 Thiamine HCl (vitamin B1) 10 - 50 Panthotenat canxi 1 – 5 GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  21. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 20 - Riboflavine (vitamin B2) 1 – 5 Biotin 0,1 – 1,0 Acid folic 0,1 – 1,0 Caùc vitamin thöôøng duøng ñöôïc pha trong hoãn hôïp caùc dung dòch meï coù noàng ñoä cao gaáp 500 hoaëc 1000 laàn dung dòch laøm vieäc vaø ñöôïc baûo quaûn ôû nhieät ñoä döôùi 0oC. Neân chia saün dung dòch meï vitamin ra nhieàu loï nhoû, moãi loï ñuû duøng cho moät hoaëc vaøi lít moâi tröôøng vaø baûo quaûn trong ngaên ñaù tuû laïnh. 5. Caùc chaát kích thích sinh tröôûng (phytohormone). Caùc phytohormone thöôøng duøng trong nuoâi caáy moâ ñöôïc trình baøy trong baûng 3. Teân phytohormone Noàng ñoä söû duïng (mg/l) 2,4D (Dichlorophenoxyacetic acid 0,2 – 5,0 α- NAA (α- Naphtylacetic acid) 0,1 - 5,0 β-IAA (β-Indolacetic acid) 5 – 20 IBA (Indolbutyric acid) 1 – 5 Kinetin (6-Furfurylaminopurine) 0,1 – 2,0 BA (6-BAP) (6-Benzylaminopurine) 0,1 – 2,0 2-iP (N6γ,γ-Dimethylallylaminopurine) 0,1 – 2,0 GA3 (Gibberellic acid) 0,1 – 2,0 Thöôøng ngöôøi ta pha caùc dung dòch meï phytohormone coù noàng ñoä cao gaáp 1000 laàn dung dòch laøm vieäc. Do moät soá phytohormone ít tan trong nöôùc neân caàn phaûi pha nhö sau: Caân löôïng phytohormone ñuû pha 100 ml dung dòch meï vaøo moät ly khoâ. Ñoái vôùi 2,4D, NAA, IAA, IBA, GA, tröôùc heát theâm 2 – 3 ml röôïu ethylic 90% vaø laéc ñeán khi tan heát, sau ñoù theâm nöôùc caát ñeán 100 ml. Ñoái vôùi BA vaø 2-iP tröôùc heát theâm 2 – 3 ml nöôùc caát vaø vaøi gioït HCl 1N, laéc cho tan, sau ñoù leân theå tích ñeán 100ml. Baûo quaûn dung dòch meï phytohormone trong loï kín (rieâng IAA trong loï maøu naâu), caát giöõ trong tuû laïnh, 2,4D, NAA töông ñoái beàn, coù theå baûo quaûn nhö vaäy trong moät naêm. 2-iP, IBA, kinetin, GA baûo quaûn ñöôïc töø 2 ñeán 3 thaùng. IAA caàn pha laïi haøng thaùng ñeå ñaûm baûo hoaït tính. Caàn chuù yù, phytohormone coù theå taùc ñoäng leân moâ nuoâi caáy ôû noàng ñoä raát thaáp, vì vaäy caàn duøng pipet rieâng cho töøng loaïi phytohormone vaø chuù yù röûa caån thaän caùc duïng cuï thuûy tinh ñaõ duøng ñeå ñöïng vaø pha cheá caùc phytohormone ôû noàng ñoä cao. Tröø IAA vaø GA, caùc phytohormone coøn laïi ñöôïc coi laø beàn vöõng trong quaù trình haáp voâ truøng. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  22. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 21 - 6. Caùc chaát höõu cô khaùc. Nöôùc döøa: chaát coù hoaït tính trong nöôùc döøa ñaõ ñöôïc chöùng minh laø myo- inozitol vaø moät soá aminoacid. Löôïng nöôùc döøa duøng trong moâi tröôøng nuoâi caáy thöôøng khaù lôùn, töø 15 ñeán 20% theå tích moâi tröôøng. Laáy nöôùc döøa ôû traùi döøa giaø, loïc trong vaø baûo quaûn trong laïnh saâu cho ñeán khi duøng. Thôøi gian baûo quaûn khoâng quaù vaøi thaùng, toát nhaát laø söû duïng töôi. Nöôùc chieát naám men: laø caùc cheá phaåm thöôøng duøng trong nuoâi caáy vi sinh vaät, moâ teá baøo ñoäng vaät, ñaõ ñöôïc tieâu chuaån hoùa vaø baùn döôùi daïng thöông phaåm. Thaønh phaàn hoùa hoïc khoâng roõ, tröø moät soá aminoacid. Löôïng thöôøng duøng laø 1 gam cho 1 lít moâi tröôøng. 7. Chuaån bò caùc dung dòch ñaäm ñaëc vaø dung dòch laøm vieäc. Ñeå thuaän tieän cho vieäc pha caùc moâi tröôøng nuoâi caáy (moâi tröôøng laøm vieäc) ngöôøi ta pha tröôùc caùc dung dòch ñaäm ñaëc, sau ñoù chæ caàn pha loaõng khi söû duïng. Caùc dung dòch ñaäm ñaëc ñöôïc baûo quaûn daøi ngaøy trong tuû laïnh thöôøng hoaëc tuû laïnh saâu. Hieän nay moät soá haõng saûn xuaát hoùa chaát ñaõ coù baùn loaïi moâi tröôøng chuaån bò saün thaønh goùi goàm ñuû caùc thaønh phaàn thích hôïp vôùi moät muïc ñích nhaát ñònh, ví duï, moâi tröôøng MS ñeå nhaân gioáng moät soá caây caûnh. Khi duøng chæ caàn hoøa moät goùi vaøo moät lít nöôùc caát, ñun soâi laø coù ngay moät moâi tröôøng laøm vieäc. Sau ñaây chuùng ta seõ laøm quen vôùi coâng vieäc pha cheá moâi tröôøng qua ví duï vôùi caùc moâi tröôøng MS vaø White. Tröôùc heát chuùng ta pha caùc dung dòch ñaäm ñaëc (thöôøng goïi laø dung dòch meï) A, B, C, D, E, F, G vaø H vôùi thaønh phaàn vaø noàng ñoä theo baûng 1 (moâi tröôøng MS) hoaëc baûng 2 (moâi tröôøng White). Baûng 1. Thaønh phaàn caùc dung dòch meï MS. Dung Soá ml dung dòch meï dòch caàn cho 1000ml Hoùa chaát Noàng ñoä (g/l) meï dung dòch laøm vieäc A EDTA 0,8 28 Fe2(SO4)3 0,38 B NH4NO3 82,5 20 KNO3 95,0 H3PO3 1,24 KH2PO4 34,00 C KI 0,166 5 Na2MoO4.2H2O 0,050 GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  23. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 22 - CoCl2.6H2O 0,005 MgSO4.7H2O 74,00 D MnSO4.4H2O 4,46 5 ZnSO4.7H2O 1,72 CuSO4.5H2O 0,005 E CaCl2.2H2O 88,00 5 F Thiamine.HCl 0,02 5 G NAA 0,10 1 H Kinetin 0,40 0,5 Sau ñoù, ñeå pha 1 lít moâi tröôøng laøm vieäc caàn thöïc hieän caùc ñoäng taùc sau: - Cho khoaûng 800ml nöôùc caát vaøo moät caùi bình coù dunh tích 2 lít; - Duøng pipet cho 28ml dung dòch meï A, 20ml dung dòch meï B, 5ml moãi dung dòch meï C, D,E, F, 1 ml dung dòch meï G vaø 0,5ml dung dòch meï H. Trong khi troän laãn caùc dung dòch caàn luoân luoân khuaáy ñeàu; - Theâm 100 ml mezo-inozitol; - Ño pH vaø duøng HCl 0,1N vaø NaOH 0,1N ñeå chænh pH ñeán 6,5; - Theâm 20g saccharose vaø khuaáy cho tan - Theâm 6-8g aga-aga; - Ñun soâi cho ñeán khi tan heát thaïch, vöøa ñun vöøa khuaáy ñeàu ñeå aga-aga khoâng bò chaùy; - Chia hoãn hôïp dung dòch naøy vaøo caùc oáng nghieäm hay bình noùn khi coøn ñang noùng trong khi aga-aga chöa ñoâng laïi. Baûng 2. Thaønh phaàn caùc dung dòch meï White. Dung Soá ml dung dòch meï dòch caàn cho 1000ml meï Hoùa chaát Noàng ñoä (g/l) dung dòch laøm vieäc Ca(NO3)2.4H2O 3,0 Na2SO4 2,0 A KNO3 0,80 100 KCl 0,65 NaH2PO4.2H2O 0,19 B MgSO4.7 H2O 75,0 10 MnSO4.4H2O 0,50 GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  24. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 23 - ZnSO4.7H2O 0,30 C H3PO3 0,15 10 KI 0,075 CuSO4.5H2O 0,001 Na2MoO4.2H2O 0,025 D Fe2(SO4)3 0.25 10 E Thiamine.HCl 0,01 10 Pyridoxine.HCl 0,01 8. Vaán ñeà löïa choïn moâi tröôøng. Trong nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät coù haøng traêm loaïi moâi tröôøng khaùc nhau. Tuy nhieân coù theå chia chuùng thaønh 3 nhoùm: - Moâi tröôøng ngheøo dinh döôõng: ñieån hình laø moâi tröôøng Knop, moâi tröôøng Knudson C; - Moâi tröôøng trung bình: ñieån hình laø moâi tröôøng moâi tröôøng White; moâi tröôønng B5 cuûa Gamborg; - Moâi tröôøng giaøu dinh döôõng: ñieån hình laø moâi tröôøng Murashige – Skoog (moâi tröôøng MS). Vì vaäy khi baét ñaàu nghieân cöùu nuoâi caáy moâ moät ñoái töôïng naøo ñoù maø chöa coù taøi lieäu tham khaûo veà moâi tröôøng ñeå nuoâi caáy ñoái töôïng ñoù thì tröôùc heát caàn tieán haønh thí nghieäm thaêm doø moät trong 3 loaïi moâi tröôøng noùi treân ñeå tìm moâi tröôøng thích hôïp. Sau khi ñaõ tìm thaáy moâi tröôøng thích hôïp chuùng ta coù theå töøng böôùc caûi tieán ñeå töï tìm cho mình moâi tröôøng thích hôïp nhaát cho muïc ñích, ñoái töôïng vaø noäi - + dung nghieân cöùu. Ví duï, chuùng ta coù theå thöû tìm tyû leä NO3 /NH4 cho töøng loaïi ñoái + töôïng. Vôùi caùc caây troàng treân caïn ngöôøi ta thöôøng khoâng duøng NH4 nhöng ñoái vôùi + moät soá caây khaùc coù khaû naêng haáp thu maïnh NH4 nhö caây luùa thì söû duïng ion naøy trong nuoâi caáy moâ chaéc chaén seõ ñem laïi keát quaû toát. Do moâi tröôøng MS ñöôïc xem laø moâi tröôøng giaøu vaø caân baèng veà chaát dung dòch, thích hôïp cho nhieàu loaïi caây neân nhöõng ngöôøi taäp söï laøm nuoâi caáy moâ thöôøng baét ñaàu baèng moâi tröôøng naøy tröôùc khi tìm ra moâi tröôøng rieâng cuûa mình. III. CHOÏN VAØ XÖÛ LYÙ MOÂ CAÁY. Veà nguyeân taéc, tröø nhöõng moâ ñaõ hoùa goã caùc moâ khaùc ttrong cô theå thöïc vaät ñeàu coù theå duøng laøm moâ caáy. Tuy vaäy, caùc moâ coøn non nhö moâ phaân sinh ngoïn, töôïng taàng, choùp reã, phoâi ñang phaùt trieån, thòt quaû non, laù non, cuoáng hoa, ñeá hoa, moâ phaân sinh ñoát khi nuoâi caáy trong moâi tröôøng chöùa moät löôïng phytohormone thích hôïp ñeàu coù khaû naêng taïo moâ seïo hoaëc taùi sinh caây con. Thoâng thöôøng, ñeå baét GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  25. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 24 - ñaàu nghieân cöùu nhaân gioáng voâ tính moät caây naøo ñoù ngöôøi ta thöôøng duøng choài naùch hoaëc moâ phaân sinh ngoïn. Caàn chuù yù raèng tuy mang moät löôïng thoâng tin di truyeàn nhö nhau, caùc moâ khaùc nhau treân cuøng moät caây coù theå cho caùc moâ seïo phaùt trieån hoaøn toaøn khaùc nhau vôùi khaû naêng taùi sinh choài, reã hay toaøn caây raát khaùc nhau. Vì vaäy, khi baét ñaàu moät chöông trình söû duïng phöông phaùp nuoâi caáy moâ ñeå choïn gioáng vaø nhaân gioáng moät caây naøo ñoù, tröôùc heát caàn thí nghieäm tìm hieåu phaûn öùng cuûa caùc boä phaän khaùc nhau cuûa caây trong nuoâi caáy ôû caùc noàng ñoä phytohormone khaùc nhau. Ví duï, ñoái vôùi caây mía, keát quaû nghieân cöùu cuûa nhieàu taùc giaû cho thaáy laù non ñang coøn boïc trong beï vaø ñoøng hoa non laø moâ caáy thích hôïp hôn caû cho vieäc taïo moâ seïo vaø taùi sinh caây hoaøn chænh. Sau khi caáy, moâ caáy caàn ñöôïc ñaët trong caùc ñieàu kieän nhieät ñoä vaø aùnh saùng oån ñònh phuø hôïp vôùi nhu caàu cuûa töøng loaïi moâ caáy nhôø caùc maùy ñieàu hoaø töï ñoäng. IV. PHOØNG THÍ NGHIEÄM NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT. Nuoâi caáy moâ thöïc vaät khoâng caàn nhieàu maùy moùc ñaéc tieàn Coù theå baét ñaàu hoaït ñoäng nuoâi caáy vôùi caùc thieát bò toái thieåu goàm noài haáp voâ truøng vaø buoàng caáy voâ truøng hoaëc tuû caáy baèng goã coù trang bò ñeøn töû ngoaïi. 1.Caùch boá trí phoøng thí nghieäm nuoâi caáy moâ. Moät phoøng thí nghieäm nuoâi caáy moâ hieän ñaïi ñöôïc thieát keá phuø hôïp vôùi tính chaát daây chuyeàn cuûa coâng vieäc nhö moâ taû trong hình 1. 1 2 3 4 5 6 10 9 8 7 Hình 1. Sô ñoà moät phoøng thí nghieäm nuoâi caáy moâ hoaøn chænh: 1: Phoøng röûa vaø saûn xuaát nöôùc caát; 2: phoøng saáy, haáp, kho thuûy tinh saïch; 3: phoøng chuaån bò moâi tröôøng; 4: phoøng chuaån bò maãu; 5: phoøng caáy voâ truøng; 6: phoøng aûnh; 7: phoøng kính hieån vi; 8,9: phoøng saùng; 10: phoøng sinh hoùa. Beân caïnh phoøng thí nghieäm phaûi coù heä thoáng nhaø kính, vöôøm öôm ñeå troàng caây laáy nguyeân lieäu nuoâi caáy vaø caây taùi sinh trong oáng nghieäm. 2. Caùc thieát bò chuû yeáu cuûa phoøng thí nghieäm nuoâi caáy moâ thöïc vaät. Moät phoøng thí nghieäm nuoâi caáy moâ thöïc vaät caàn coù caùc trang thieát bò chuû yeáu sau ñaây: GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  26. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 25 - Raát caàn Tuøy theo nhu caàu PHOØNG RÖÛA VAØ NÖÔÙC CAÁT: + Maùy caát nöôùc moät laàn 12-20l/h + Maùy caát nöôùc hai laàn 5l/h + Maùy saûn xuaát nöôùc khöû ion PHOØNG SAÁY HAÁP + Tuû saáy 60 – 600oC +Noài haáp loaïi nhoû 20-30-lít + Noài haáp dung tích 70 -100 lít PHOØNG CHUAÅN BÒ MOÂI TRÖÔØNG + Maùy ño pH chính xaùc 0,1 ñôn vò +Giaáy ño pH + Caân phaân tích ñoä chính xaùc 0,1mg + Maùy khuaáy töø + Caân kyõ thuaät + Maùy roùt moâi tröôøng + Beáp ñieän, beáp gas hoaëc beáp daàu hoûa + Tuû laïnh saâu (-20oC) + Tuû laïnh thöôøng dung tích 200-400 lít BUOÀNG CAÁY VOÂ TRUØNG + Ñeøn töû ngoaïi treo traàn hoaëc treo töôøng + Thieát bò loïc khoâng khí + Tuû caáy lamine hoaëc tuû caáy ñoùng baèng goã PHOØNG AÛNH + Maùy aûnh vaø thieát bò chuïp gaàn + Caùc duïng cuï in aûnh ñen traéng hoaëc maøu + Maùy chieáu PHOØNG KÍNH HIEÅN VI + Kính hieån vi hai maét + Thieát bò chuïp aûnh treân kính hieån vi + Kính luùp hai maét + Microtome vaø caùc duïng cuï ñeå quan saùt teá baøo hoïc PHOØNG SAÙNG + caùc giaøn ñeøn huyønh quang 3000-4000 + Maùy laéc ngang khoaûng 100 voøng/phuùt lux + Caùc duïng cuï nuoâi caáy teá baøo ñôn + Maùy ñieàu hoøa nhieät ñoä GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  27. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 26 - CHÖÔNG III. CAÙC PHÖÔNG PHAÙP NUOÂI CAÁY MOÂ I. NUOÂI CAÁY ÑÆNH SINH TRÖÔÛNG Moâ phaân sinh ñænh chöùa nhöõng teá baøo ñænh sinh tröôûng vaø ñöôïc bao boïc bôûi moät lôùp voû coù caáu taïo cutin haïn cheá thaáp nhaát quaù trình maát nöôùc. ÔÛ thöïc vaät söï hình thaønh môùi caùc cô quan baét ñaàu trong caùc moâ phaân sinh ñænh. Caùc moâ maøy phaân hoùa ngay töø nhöõng giai ñoaïn phaùt trieån ñaàu cuûa phoâi vaø giöõ laïi trong suoát ñôøi soáng cuûa caây. Ñieàu naøy xaûy ra laø do trong moâ phaân sinh coù söï phaân hoùa cuûa caùc teá baøo khôûi sinh. Taát caû caùc teá baøo coøn laïi ñeàu xuaát phaùt töø nhöõng teá baøo khôûi sinh naøy. Vì moâ phaân sinh coù theå tích töông ñoái oån ñònh neân caùc teá baøo sinh ra töø caùc teá baøo khôûi sinh sau moät vaøi laàn phaân chia seõ rôøi khoûi moâ phaân sinh (hình 2). Hình 2. Ñænh sinh tröôûng. Quaù trình sinh tröôûng cuûa cô quan dieãn ra theo 3 giai ñoaïn. Trong giai ñoaïn thöù nhaát, thöôøng ñöôïc goïi laø giai ñoaïn phoâi sinh, trong caùc ñieåm sinh tröôûng (trong caùc moâ phaân sinh ñænh) xaûy ra söï hình thaønh maàm cô quan vaø söï phaân chia ñaàu tieân cuûa noù thaønh caùc moâ rieâng bieät. Trong giai ñoaïn thöù hai do söï sinh tröôûng nhanh choùng, maàm cô quan ñaït ñeán kích thöôùc toái ña vaø trôû neân coù hình daïng xaùc ñònh. Cuoái cuøng, trong giai ñoaïn thöù ba keát thuùc söï phaân hoùa teá baøo, baét ñaàu söï hoùa goã caùc vaùch teá baøo, keát quaû laø teá baøo khoâng coøn khaû naêng tieáp tuïc sinh tröôûng. Tröôùc heát caùc u laù xuaát hieän. Theå tích cuûa u laù taêng raát nhanh vaø keùo theo noù moät phaàn lôùn cuûa ñænh sinh tröôûng. Daàn daàn u laù chuyeån thaønh maàm laù (theå nguyeân thuûy). Maàm laù sinh tröôûng nhanh theo chieàu daøi. Do söï sinh tröôûng xaûy ra khoâng ñeàu neân laù maàm töï cong leân phía ñænh. Sau khi laù ñöôïc taùch ra laïi xaûy ra söï phaân phoái laïi söï phaân chia teá baøo, keát quaû laø theå tích cuûa ñænh sinh tröôûng ñöôïc khoâi phuïc nhanh choùng vaø söï hình thaønh laù môùi laïi baét ñaàu. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  28. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 27 - ÔÛ moãi naùch laù ñeàu coù choài naùch. Choài naùch thöïc chaát coù caáu taïo khoâng khaùc ñænh sinh tröôûng cuûa thaân. Do hieän töôïng öùc cheá öu theá ngoïn neân choài naùch khoâng phaùt trieån, nhöng khi ñöôïc ñaùnh thöùc vaø baét ñaàu sinh tröôûng chuùng coù caáu taïo gioáng nhö ñænh sinh tröôûng ngoïn. Quaù trình toång hôïp ADN cuûa virus thöïc vaät khoâng xaûy ra trong ñænh sinh tröôûng do moät cô cheá hieän nay khoâng roõ. Vì vaäy moâ ñænh sinh tröôûng laø moâ duy nhaát saïch virus trong moät caây nhieãm virus. Do ñoù trong kyõ thuaät nuoâi caáy moâ teá baøo ñænh sinh tröôûng ñöôïc söû duïng ñeå taùi sinh nhöõng caây con saïch virus. Do vuøng moâ phaân sinh quaù nhoû, kyõ thuaät taùch ñænh sinh tröôûng ñöôïc thöïc hieän döôùi kính luùp. Caùc ñænh sinh tröôûng kích thöôùc 0,1 – 0,15 mm seõ taïo ra ñöôïc 100% soá caây con saïch beänh vaø tæ leä naøy giaûm daàn ñeán kích thöôùc 1 mm. Maët khaùc, maãu caáy caøng nhoû caøng khoù taùi sinh caây con vaø khaû naêng soáng soùt cuûa maãu caáy caøng giaûm. Vì vaäy, noùi chung, kích thöôùc töông ñoái thöôøng söû duïng laø daøi töø 0,25 ñeán 1,0 mm. Xöû lyù nhieät (Thermotherapy) caùc caây tröôùc khi töø ñoù laáy ñænh sinh tröôûng coù theå laøm taêng khaû naêng loaïi tröø virus. Moät soá hoùa chaát loaïi tröø virus, nhö ribavirein, ñöôïc boå sung vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy seõ laøm taêng khaû naêng taùi sinh caây con saïch virus. Khi ñaõ taïo ñöôïc caây con coù ñuû reã, noù coù theå ñöôïc söû duïng laøm nguyeân lieäu ñeå taïo doøng saïch beänh phuïc vuï saûn xuaát. Caây con nhaân gioáng töø ñænh sinh tröôûng ñöôïc söû duïng raát coù hieäu quaû ñoái vôùi nhieàu loaïi caây thaûo moäc. Caùc vaät lieäu thu ñöôïc töø chöông trình naøy ñaõ trôû thaønh höôùng saûn xuaát caây gioáng raát quan troïng ñoái vôùi nhieàu loaïi caây thöông phaåm nhö caåm chöôùng, cuùc, hoa lan, phong löõ, khoai taây, khoai lang, saén, chuoái vaø nhieàu caây khaùc. Chöông trình naøy phöùc taïp hôn ñoái vôùi caùc loaøi caây goã. Ñoái vôùi nhoùm caây naøy phöông phaùp vi gheùp laø moät giaûi phaùp thay theá. Caûi thieän caùc phöông phaùp vi nhaân gioáng caây goã coù theå laøm môû roäng tính hieäu quaû cuûa vieäc nhaân gioáng nhoùm caây naøy. Chuùng ta haõy laøm quen vôùi kyõ thuaät nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng qua vieäc nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng caây khoai taây vaø caây ñòa lan Cymbidium. 1/ Nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng caây khoai taây. Morel vaø Martin (1955) laø nhöõng ngöôøi ñaàu tieân duøng phöông phaùp nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng ñeå thu ñöôïc caây khoai taây khoâng chöùa virus. Ngaøy nay phöông phaùp naøy ñaõ vaø ñang ñöôïc söû duïng ôû nhieàu nöôùc treân theá giôùi. Phöông phaùp naøy bao goàm nhöõng noäi dung cô baûn sau ñaây: Laáy moät cuû khoai taây troàng vaøo moät chaäu ñaát trong ñieàu kieän nhieät ñoä vaø aùnh saùng bình thöôøng. Khi maàm cao 15cm, laáy phaàn ngoïn daøi 6-8 , caét boû 2 laù döôùi, caém vaøo moät caùi ly ñöïng ñaát muøn ñaõ voâ truøng, ñaäy moät ly khaùc ñeå traùnh bò heùo trong voøng 10 ngaøy cho ra reã. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  29. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 28 - Sau 3-4 tuaàn chuyeån ly coù caây vaøo ñieàu kieän chieáu saùng 3000-4000 lux vôùi cheá ñoä chieáu saùng 16h/ngaøy, nhieät ñoä khoâng khí 36oC ban ngaøy vaø 33oC ban ñeâm. Sau ñoù 2 tuaàn caét boû ngoïn maàm ñeå thuùc caùc choài naùch phaùt trieån. Sau khi xöû lyù nhieät 6 tuaàn, laáy phaàn ngoïn choài naùch ñeå taùch ñænh sinh tröôûng. Caét boû bôùt laù vaø ñaët choài treân moät tôø giaáy loïc aåm trong moät hoäp loàng ñeå traùnh bò heùo. Khoâng caàn thieát phaûi voâ truøng choài naùch tröôùc khi laøm thao taùc taùch ñænh sinh tröôûng, nhöng caàn taùch trong ñieàu kieän voâ truøng vaø duïng cuï taùch phaûi ñöôïc voâ truøng baèng coàn vaø nöôùc caát voâ truøng. Döôùi kính luùp coù ñoä phoùng ñaïi X 25 duøng kim nhoïn ñeå gaït boû caùc laù ngoaøi, ñeå loä ñænh sinh tröôûng vôùi hai laù nguyeân thuûy. Duøng moät maûnh dao caïo gaén leân ñaàu moät que saét ñeå caét laáy moâ ñænh sinh tröôûng coù chieàu daøi khoaûng 0,6mm. Duøng kim nhoïn ñöa ñænh sinh tröôûng leân maët moâi tröôøng thaïch, giöõ ôû 23oC trong ñieàu kieän chieáu saùng16 giôù/ngaøy ñeâm. Sau vaøi tuaàn, khi caây ñaõ lôùn ñöôïc 3 cm vaø coù reã, coù theå chuyeån qua moâi tröôøng môùi. Khi caây coù nhieàu laù, caét ñoaïn vaø nhaân leân nhieàu caây, ñoàng thôøi ñöa chaån ñoaùn virus treân caùc caây chæ thò nhö Gompherena globa (virus X), Chenopodium amaraticolor (virus S vaø X), Solanum demisum (virus Y). Moâi tröôøng duøng ñeå caáy ñænh sinh tröôûng cuûa khoai taây laø moâi tröôøng MS coù boå sung 0,5mg/l IAA, 0,1mg/l GA vaø 100mg/l inozitol. Neáu thaáy caây khoai taây khoù ra reã, caàn theâm 10mg than hoaït tính vaøo moät oáng nghieäm tröôùc khi voâ truøng. Duøng oáng nghieäm nhoû 12 x 100mm, moãi oáng nghieäm 3,5ml moâi tröôøng. Sau khi ñaõ chaéc chaén khoâng coøn virus trong caây khoai taây, caùc oáng nghieäm ñöôïc ñöa vaøo nhaân gioáng vaø baûo quaûn. Khi ñaõ coù ñöôïc caùc doøng khoai taây khoâng chöùa virus, vaán ñeà ñaët ra laø phaûi duy trì, baûo veä ñöôïc caùc doøng naøy khoâng bò taùi nhieãm. Phöông phaùp duy nhaát coù theå duy trì ñöôïc gioáng khoai taây saïch beänh trong ñieàu kieän ôû nöôùc ta laø baûo quaûn trong oáng nghieäm baèng phöông phaùp nuoâi caáy moâ. Hôn theá nöõa, nhaân gioáng khoai taây baèng phöông phaùp nuoâi caáy moâ laø phöông phaùp nhaân gioáng cöïc nhanh. Toaøn boä quy trình nhaân gioáng khoai taây baèng phöông phaùp nuoâi caáy moâ phuïc vuï saûn xuaát bao goàm caùc böôùc sau ñaây: Böôùc 1: Nhaân gioáng trong oáng nghieäm; Tuøy theo dieän tích gieo troàng, moãi ha cbæ caàn 50 oáng nghieäm. Böôùc 2: Khay meï: caét vaø caém caùc ñoaïn thaân caây khoai taây töø oáng nghieäm treân caùt aåm trong moät khay goã 40 x 60 cm.Moãi ñoaïn thaân coù moät laù, moät choài naùch. Khoaûng caùch caém 3 x 3 cm. Che naéng, giöõ aåm 7 ngaøy ñaàu. Khi ñoaïn thaân ra reã töôùi dung dòch NPK loaõng moãi ngaøy moät laàn. Thöôøng xuyeân phun thuoác phoøng tröø saâu, beänh. Sau moät thaùng caét ngoïn ñeå nhaân tieáp ôû treân ñaát nhö moâ taû ôû böôùc 3. Sau khi caét ngoïn 5-7 ngaøy, caùc choài naùch baät leân cuõng ñöôïc caét tieáp ñeå nhaân treân ñaát. Khay meï ñöôïc söû duïng lieân tieáp treân 12 thaùng ñeå caét choài ngoïn. Böôùc 3: Nhaân treân luoáng maï: Ngoïn chính vaø caùc choài thu treân luoáng caùt ñöôïc caém vaøo ñaát aåm giaøu dinh döôõng (tyû leä 3 phaàn ñaát, 1 phaàn phaân ñaõ hoai) goïi laø luoáng maï khoai taây. Hoãn hôïp ñaát phaân caàn ñöôïc voâ truøng sô boä ñeå tröø saâu beänh vaø GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  30. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 29 - ñöôïc traûi thaønh luoáng roäng 80 cm, daøi 5 – 10 m. Beà daøy lôùp ñaát 6 – 8 cm. Khoaûng caùch caém ngoïn 5 x 5 cm. sau khoaûng 20 ngaøy laïi tieáp tuïc caét ngoïn ñeå tieáp tuïc nhaân sang luoáng maï khaùc. Cöù nhö vaäy caùc luoáng maï khoai taây coù theå khai thaùc lieân tuïc trong voøng 6 – 7 thaùng. Böôùc 4: Nhaân gioáng trong baàu ñaát: Baàu ñaát laøm baèng laù chuoái cuoän troøn, kích thöôùc khoaûng 3 x 8 cm, beân trong chöùa ñaát giaøu muøn nhö ñoái vôùi khay maï ôû böôùc 3. Ngoïn vaø choài thu haùi ôû böôùc ba ñöôïc caém vaøo baàu ñaát, moãi baàu ñaát moät ngoïn. Che naéng vaø giöõ aåm 4 – 5 ngaøy ñaàu. Khi caây ñaõ ra reã vaø vöôn ngoïn thì thì boû che vaø töôùi haøng ngaøy baèng dung dòch NPK loaõng. 15 – 20 ngaøy sau khi caáy caây khoai taây coù boä reã phaùt trieån maïnh, thaân maäp, ngoïn vöôn cao treân 10 cm, coù theâm nhieàu laù môùi. Luùc naøy coù theå ñem troàng ngoaøi ñoàng ruoäng. Böôùc 5: Caây khoai taây baàu ñaát ñöôïc troàng vôùi maät ñoä cao (100 ngaøn caây/ha) ñeå haïn cheá hình thaønh cuû lôùn, taïo nhieàu cuû nhoû 15-50 gam. Böôùc 6: Troàng cuû nhoû ñaõ naåy maàm vôùi maät ñoä 30.000 caây/ha ñeå saûn xuaát cuû gioáng. Khi thu hoaïch, sau khi loaïi boû cuû lôùn ñeå laøm khoai thöông phaåm, cuû nhoû vaø trung bình dung laøm gioáng cho theá heä tieáp theo. 2/ Nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng caây ñòa lan. Naêm 1962 George Morel laàn ñaàu tieân thaønh coâng trong vieäc nuoâi caáy moâ ñòa lan Cymbidium. Ngaøy nay, kyõ thuaät nhaân gioáng Cymbidium baèng phöông phaùp nuoâi caáy moâ ñaõ ñöôïc phoå bieán roäng raõi. ÔÛ nhieàu nöôùc beân caïnh vieäc saûn xuaát caây gioáng treân qui moâ coâng nghieäp coøn saûn xuaát caây gioáng ôû qui moâ gia ñình. Kyõ thuaät nhaân gioáng Cymbidium baèng phöông phaùp nuoâi caáy moâ ñöôïc thöïc hieän qua caùc böôùc cô baûn nhö sau: + Choïn caây gioáng vaø moâ phaân sinh: - Choïn caây lan coù nhieàu ñaëc ñieåm toát ñaùp öùng ñöôïc muïc tieâu kinh doanh; - Laáy teá baøo phaân sinh töø caùc ñoït caây, choài nguû vaø nhöõng choài phaùt hoa coøn non. Nhöng ñoït caây laø toát nhaát cho vieäc nhaân gioáng. + Chuaån bò moâ ñeå nuoâi caáy. - Caét caùc ñænh sinh tröôûng, boùc caùc laù bao, röûa saïch phaàn thaân coøn laïi; - Khöû truøng baèng caùc chaát dieät naám khuaån thöôøng duøng nhö calcium hypochloride 9-10%, natrium hypochloride 9-10% trong 5-30 phuùt vaø nöôùc broâm 1- 2% töø 2-10 phuùt. Ngoaøi ra, hydro peroxide 10-12% trong 5-10 phuùt vaø chlorua thuûy ngaân 0,1-1,0% trong 2-10 phuùt cuõng cho keát quaû toát ñoái vôùi töøng loaïi moâ caáy. - Boùc nheï nhaøng caùc laù non ñeán khi nhìn thaáy maàm nhoû beân trong; - Duøng dao nhoïn laáy maàm ñöa vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy. Taát caû caùc thao taùc treân ñeàu phaûi tieán haønh trong ñieàu kieän voâ truøng. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  31. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 30 - + Moâi tröôøng nuoâi caáy: Moâi tröôøng thöôøng duøng laø moâi tröôøng MS, Vacin-Went hoaëc Knudson C. Sau khoaûng 30 ngaøy töø ñænh sinh tröôûng hình thaønh caùc theå choài (protocorm) nhoû li ti. Chia nhoû caùc theå choài naøy ñeå caáy chuyeàn seõ taïo ra ñöôïc moät soá löôïng lôùn theå choài. Khi caáy chuyeàn sang moâi tröôøng thích hôïp töø nhöõng theå choài naøy seõ hình thaønh caùc caây con hoaøn chænh. Nhaân gioáng hoa lan baèng phöông phaùp caáy moâ trong moät thôøi gian ngaén coù theå taïo ra moät soá löôïng caây gioáng lôùn cung caáp cho caùc cô sôû nuoâi troàng taïo nguoàn haøng xuaát khaåu. Nuoâi troàng, chaêm soùc caây gioáng sau oáng nghieäm. Caây con trong caùc bình caáy khi moïc ñöôïc 2 reã toát coù theå chuyeån ra ngoaøi troàng vaøo chaäu chung hoaëc troàng thaønh luoáng. Tröôùc khi troàng caây lan con töø trong bình laáy ra caàn ñöôïc boû vaøo chaäu nöôùc ñeå röûa saïch agar vaø veát tích moâi tröôøng baùm vaøo reã. Chaäu troàng lan vaø caùc duïng cuï ñeå troàng lan con phaûi ñöôïc khöû truøng, sau ñoù cho than cuûi hoaëc gaïch vuïn vaøo khoaûng nöûa chaäu roài tuyø thuoäc loaïi lan caàn troàng maø theâm vaøo moät lôùp than, gaïch nhuyeãn hoaëc dôùn, xô döøa cho gaàn ñaày chaäu. Ñaët caùc caây lan con vaøo chaäu ñeå reã xen keõ vaøo caùc lôùp than, gaïch vaø coïng dôùn. Moãi chaäu chung troàng khoaûng 30-40 caây con. Duøng voû thoâng ñaët chung quanh chaäu vaø giöõa caùc caây ñeå baûo veä boä reã, khoâng cho chuùng lay ñoäng khi gioù maïnh hoaëc khi töôùi nöôùc. Sau khi troàng lan vaøo chaäu chung, caàn phaûi phun thuoác phoøng tröø beänh haïi nhö dung dòch captan hoaëc thiuran pha moät thìa caø pheâ trong ¼ lít nöôùc. Caùc chaäu chung phaûi ñeå ôû nôi coù maùi che traùnh nöôùc möa vaø aùnh saùng maët trôøi tröïc tieáp chieáu vaøo caây con. Caây lan con nuoâi troàng trong chaäu chung 4 thaùng thì baét ñaàu chuyeån sang chaäu rieâng kích thöôùc nhoû 8cm. Ngaâm chaäu chung vaøo nöôùc 1 giôø ñeå gôõ lan con ra khoûi chaát troàng, traùnh toån thöông reã cuûa caây. Moâi tröôøng troàng caây lan ôû giai ñoaïn naøy cuõng gioáng nhö giai ñoaïn chaäu chung. Khi caây lan ñaõ coù 4-6 laù thì chuyeån sang chaäu côõ 11-12cm. Troàng vaø chaêm, soùc lan con trong chaäu vöøa cho ñeán khi reã phaùt trieån ra ngoaøi chaäu; caây coù khoaûng 6-8 laù thì chuyeån sang chaäu côõ lôùn 15-17cm vaø chaêm ssoùc cho ñeán khi ra hoa. Toaøn boä lan con troàng trong chaäu chung, chaäu rieâng, chaäu vöøa ñöôïc ñaët leân saïp cao 50cm, treân saïp coù giaøn che naéng baèng löôùi polyethylen maøu xanh hoaëc maøu ñen cao 2,5-3m so vôùi maët ñaát. Töôùi nöôùc vaø boùn phaân theo yeâu caàu ñoái vôùi töøng loaïi lan. Ñeå taïo ñieàu kieän cho caây lan sinh tröôûng vaø phaùt trieån toát caàn phaûi söû duïng cheá ñoä boùn phaân hôïp lyù. Caây lan con sau khi ra khoûi bình caáy töø giai ñoaïn luùc troàng ôû chaäu chung caàn thieát phaûi taêng cöôøng dinh döôõng cho caây. Giai ñoaïn naøy caàn giuùp cho caây sinh GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  32. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 31 - tröôûng maïnh neân caàn boùn phaân ñaïm vôùi tyû leä cao hôn laân vaø kali. Toát nhaát laø boùn phaân NPK vôùi tyû leä 30-10-10 naêm ngaøy moät laàn vaøo muøa naéng vaø 10-15 ngaøy moät laàn vaøo muøa möa. ÔÛ giai ñoaïn caây lôùn caàn phaûi cung caáp dinh döôõng ñaûm baûo cho caây sinh tröôûng vaø phaùt trieån maïnh. Neáu cheá ñoä dinh döôõng vaø chaêm soùc khoâng toát seõ aûnh höôûng lôùn ñeán söï ra hoa vaø chaát löôïng hoa. Moãi gioáng lan, moãi loaøi lan coù nhöõng yeâu caàu chaêm soùc khaùc nhau. Nhöng ñoái vôùi giai ñoaïn naøy coù theå aùp duïng cheá ñoä phaân boùn nhö sau: Cöù 5 ngaøy töôùi phaân moät laàn: Laàn 1 duøng loaïi phaân 20-20-20 vaø vi löôïng hoaëc pha cheá NPK theo tyû leä treân; Laàn 2 duøng nöôùc tieåu ngöôøi hoaëc phaân heo, phaân boø, boät caù. - Nöôùc tieåu: pha 1 pnaàn nöôùc tieåu + 30 phaàn nöôùc; - Phaân heo: pha 1 phaàn phaân + 100 phaàn nöôùc; - Phaân boø: pha 1 phaàn phaân + 30 phaàn nöôùc. Laàn 3 duøng loaïi phaân töông töï nhö laàn 1. Sau ñoù laàn 4 laëp laïi nhö laàn 2, laàn 5 laëp laïi nhö laàn 1, laàn 6 laëp laïi nhö laàn 2 Giai ñoaïn ra hoa laø giai ñoaïn cuoái cuøng cuûa quaù trình nuoâi troàng vaø coù yù nghóa quyeát ñònh ñeán keát quaû thu hoaïch saûn phaåm. Veà cheá ñoä dinh döôõng, khi vöôøn lan gaàn ñeán thôøi kyø ra hoa phaûi taêng cöôøng töôùi boùn tæ leä laân cao cho caây. Phaân hoãn hôïp duøng töôùi boùn trong giai ñoaïn naøy laø loaïi phaân: - 6-30-30 vaø vi löôïng; - 6-30-20 vaø vi löôïng; - Hoaëc pha cheá caùc loaïi phaân N-P-K theo caùc tæ leä treân. Treân cô sôû nghieân cöùu sinh hoïc phaùt trieån cuûa Cymbidium ngöôøi ta ñaõ ghi nhaän ñöôïc raèng töø thaùng 6 ñeán thaùng 8 baét ñaàu hình thaønh cô quan sinh saûn. Ñeå thuùc ñaåy söï phaùt trieån cuûa cô quan naøy caàn boùn nhieàu caùc loaïi phaân phospho vaø keõm, ñoàng thôøi caàn naâng cao nhieät ñoä cuûa moâi tröôøng. Moät phaùt hieän lyù thuù khaùc laø ñeå taêng soá löôïng hoa caàn taïo ra pH-stress vaøo 10 ngaøy thöù hai cuûa thaùng baûy baèng caùch trong voøng moät tuaàn caàn thay ñoåi pH moâi tröôøng 1,5-2,0 ñôn vò baèng caùch boùn cacbonat canxi 0,8%. Sau ñoù giaûm töø töø pH cuûa moâi tröôøng cuøng vôùi taêng cöôøng ñoät ngoät vieäc boùn phospho cho caây. Vieäc taïo pH-stress ñeå kích thích caây ra nhieàu hoa chæ ñem laïi keát quaû toát neáu ñaûm baûo cheá ñoâ dinh döôõng cho caây nhö ñaõ giôùi thieäu ôû treân. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  33. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 32 - II. NHAÂN GIOÁNG BAÈNG CON ÑÖÔØNG PHAÙT SINH PHOÂI VOÂ TÍNH ÔÛ thöïc vaät baäc cao phoâi laø saûn phaåm töï nhieân cuûa quaù trình thuï tinh trong sinh saûn höõu tính. Tuy nhieân, phoâi cuõng coù theå hình thaønh töø caùc teá baøo soma qua quaù trình nuoâi caáy in vitro. Phoâi loaïi naøy ñöôïc goïi laø phoâi voâ tính (somatic embryos). Phaùt sinh phoâi voâ tính laø söï phaùt trieån phoâi töø caùc teá baøo vaø moâ soma trong caùc heä thoáng nuoâi caáy in vitro. Ñaàu tieân, trong nghieân cöùu caùc heä thoáng huyeàn phuø Steward ñaõ phaùt hieän ñöôïc raèng caùc teá baøo caø roát khi xöû lyù baèng söõa döøa seõ ngöøng phaân chia vaø phaân hoùa thaønh caùc caáu truùc töông töï nhö phoâi coù teân goïi laø embryoid. Cuõng vaøo thôøi gian naøy Reinert ñoäc laäp phaùt hieän hieän töôïng nhö vaäy ôû caø roát nuoâi treân thaïch coù söû duïng caùc noàng ñoä auxin nhö yeáu toá gaây caûm öùng. Töø ñoù caùc moâ ñaëc tröng thuoäc caùc loaøi khaùc nhau ñöôïc tìm thaáy coù khaû naêng taïo phoâi voâ tính trong caùc heä thoáng nuoâi caáy hoaëc coù theå ñöôïc caûm öùng taïo phoâi voâ tính baèng caùch xöû lyù ñaëc bieät ñoái vôùi moâi tröôøng. Phoâi voâ tính phaùt trieån thoâng qua caùc giai ñoaïn töông töï nhö phoâi hình thaønh töø hôïp töû. Tuy nhieân, kích thöôùc cuoái cuøng cuûa laù maàm thöôøng nhoû vaø khoâng coù söï phaùt trieån cuûa phoâi nhuõ hoaëc voû haït. Caùc gen keùo theo khaû naêng taïo phoâi voâ tính vaø söï ñieàu hoøa hoaït ñoäng cuûa caùc gen laø nhö nhau ôû phoâi voâ tính vaø phoâi höõu tính. Phoâi voâ tính taïo ra tieàm naêng saûn xuaát haøng loaït caây con nhö nhöõng caây sinh ra töø haït gioáng. Caây gioáng ñöôïc taïo ra baèng phöông phaùp naøy bao goàm caùc loaïi caây troàng ngoaøi ñoàng (luùa, coû linh laêng, ñaäu töông, caây aên quaû), caùc loaïi rau (caø roát, caàn taây, xaø laùch), Caây troàng treân ñoàn ñieàn (coï daàu, caø pheâ) vaø caùc loaïi caây röøng. Ñeå bieán khaû naêng naøy thaønh hieän thöïc phaûi giaûi quyeát toaøn boä caùc vaán ñeà kyõ thuaät vaø cheá taïo caùc phöông tieän nuoâi troàng. Vaán ñeà bieán ñoåi tính di truyeàn trong soá caây con taïo ra caàn phaûi coù söï hieåu bieát saâu saéc vaø coù bieän phaùp kieåm tra caån thaän. Duø sao, söû duïng quy trình naøy laø raát höùa heïn ñoái vôùi nhieàu loaïi caây troàng. Phaùt sinh phoâi voâ tính coù theå höõu ích ñoái vôùi vieäc taùch caùc bieán ñoåi tính di truyeàn cuûa caùc doøng voâ tính beân trong taäp ñoaøn caùc teá baøo nhaèm muïc ñính hoaøn thieän tính di truyeàn cuûa caây gioáng. Coâng vieäc naøy coù theå thöïc hieän ñöôïc do nguoàn goác teá baøo ñôn cuûa phoâi voâ tính. Tính bieán ñoåi cuûa caùc doøng voâ tính ñoâi khi ñöôïc di truyeàn beân trong caây nguoàn xuaát phaùt töø caùc heä thoáng sinh callus, ñöôïc caûm öùng bôûi caùc mutagent hoaëc ñöôïc taïo ra baèng coâng ngheä gen. Phoâi voâ tính phaùt trieån töø moät soá teá baøo. Ñieàu naøy laøm cho chuùng trôû thaønh muïc tieâu haáp daãn ñeå thöïc hieän bieán ñoåi tính di truyeàn. Moät trong nhöõng phöông phaùp bieán ñoåi tính di truyeàn cuûa nhöõng teá baøo naøy laø phöông phaùp söû duïng suùng baén gen. Söï taùi sinh caùc phoâi voâ tính töø nhöõng teá baøo naøy seõ taïo ra ñöôïc nhöõng caây coù tính di truyeàn ñaõ bieán ñoåi. Quy trình taïo phoâi voâ tính ñöôïc xaùc laäp ñoái vôùi töøng kieåu gen. Thoâng thöôøng, quy trình naøy bao goàm caùc giai ñoaïn sau ñaây: GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  34. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 33 - + Giai ñoaïn 1: Choïn caây gioáng coù vaät lieäu nuoâi caáy thích hôïp: Vieäc choïn nguoàn vaät lieäu nuoâi caáy laø quyeát ñònh quan troïng nhaát vaø ñoøi hoûi söï phaân tích chu ñaùo khaû naêng taïo phoâi cuûa caùc nguoàn maãu caáy khaùc nhau trong caây laøm gioáng. Giai ñoaïn naøy bao goàm caùc coâng vieäc taïo callus, taïo huyeàn phuø teá baøo hoaëc taïo protoplast baèng caùc phöông phaùp moâ taû trong giaùo trình naøy. + Giai ñoaïn 2: Caûm öùng khaû naêng taïo phoâi trong caùc teá baøo nuoâi caáy. Vieäc caûm öùng laø raát caàn thieát ñoái vôùi nhoùm teá baøo vaø maãu caáy khoâng coù khaû naêng taïo phoâi. Söï caûm öùng ñöôïc thöïc hieän baèng caùch chuyeån caùc teá baøo caàn caûm öùng sang moâi tröôøng cô baûn coù noàng ñoä auxin cao. Loaïi auxin coù hieäu quaû nhaát laø 2,4-D hoaëc hoãn hôïp söõa döøa vôùi noàng ñoä thaáp cuûa NAA. Sau moät hoaëc hai tuaàn moät soá teá baøo tieàn phoâi coù theå xuaát hieän. Nhöõng khoái teá baøo vaø tieàn phoâi lôùn coù theå ñöôïc taùch ra döïa vaøo söï khaùc bieät veà kích thöôùc ñeå chuyeån sang moâi tröôøng phaân hoùa. Nhöõng teá baøo nhoû hôn coù theå ñöôïc caáy chuyeàn ñeå tieáp tuïc saûn xuaát phoâi voâ tính. + Giai ñoaïn 3:Phaân hoùa vaø söï thaønh thuïc cuûa phoâi voâ tính. Sau khi caûm öùng khaû naêng taïo phoâi voâ tính trong moâi tröôøng chöùa auxin, khoái teá baøo tieàn phoâi ñöôïc chuyeån sang moâi tröôøng cô baûn coù haøm löôïng nitô cao vaø khoâng chöùa auxin. Phoâi voâ tính xuaát hieän töø caùc teá baøo ñôn trong khoái teá baøo nuoâi caáy, phaùt trieån tính phaân cöïc vaø tieáp theo laø quaù trình gioáng nhö taïo phoâi bình thöôøng. Söï phaùt trieån coù theå thay ñoåi veà toác ñoä vaø möùc ñoä xuaát hieän caùc bieåu hieän khoâng bình thöôøng vôùi caùc phoâi thöù caáp hình thaønh treân phoâi sô caáp. Tính ñoàng boä vaø söï phaùt trieån bình thöôøng coù theå ñaït ñöôïc baèng caùch ly taâm theo tyû troïng ñeå taùch caùc khoái tieàn phoâi theo caùc kích thöôùc khaùc nhau. Boå sung acid abscisic vaøo moâi tröôøng seõ laøm taêng tính ñoàng nhaát vaø ñaåy maïnh söï phaùt trieån bình thöôøng cuûa phoâi. + Giai ñoaïn 4: Taïo caây con. Caùc phoâi voâ tính thaønh thuïc coù kích thöôùc bình thöôøng coù theå ñöôïc ñaët leân moâi tröôøng thaïch khoâng coù baát kyø loaïi auxin naøo nhöng chöùa cytokinin noàng ñoâï thaáp ñeå taùi sinh caây con hoaøn chænh. + Giai ñoaïn 5:Ñöa caây con ra vöôøn öôm. Sau khi laù vaø reã ñaõ hình thaønh caây con caàn ñöôïc ñöa ra vöôøn öôm vaø chaêm soùc nhö moïi caây con khaùc. Moät söï tieán boä ñaùng keå ñaõ ñöôïc thöïc hieän nhôø saùng cheá vaø söû duïng caùc bình phaûn öùng kích thöôùc lôùn ñeå taùi sinh phoâi töông töï nhö caùc thieát bò leân men hoaëc thieát bò nuoâi caáy soá löôïng lôùn vi sinh vaät vaø teá baøo ñeå taïo ra caùc saûn phaåm coâng nghieäp hoaëc döôïc lieäu Chuùng ta seõ laøm quen vôùi phöông phaùp nhaân gioáng baèng caùch taïo phoâi voâ tính trong oáng nghieäm qua ví duï ñoái vôùi caây caø pheâ. Caùc phoâi voâ tính caø pheâ coù maøu traéng, ban ñaàu hình caàu nhoû, sau ñoù bieán ñoåi thaønh daïng tim, thuûy loâi, vaø cuoái cuøng laø söï xuaát hieän hai laù soø xanh vaø heä reã. Söï phaùt trieån cuûa phoâi voâ tính caø pheâ raát gioáng vôùi söï phaùt trieån cuûa phoâi höõu tính töø haït. Phöông phaùp nhaân gioáng caø pheâ baèng caùch taïo phoâi voâ tính trong oáng nghieäm ñöôïc thöïc hieän nhö sau: GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  35. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 34 - Laù caø pheâ töø caùc caây nuoâi caáy in vitro ñöôïc caét thaønh caùc maûnh coù kích thöôùc 1cm2, khoâng chöùa gaân chính. Ñaët nhöõng maãu laù naøy leân treân moâi tröôøng MS, vitamin Morel, 30g/l saccharose, 10% nöôùc döøa, 10mg/l BA ,0,1mg/l IBA vaø 40 mg/l adenine. Sau 50 – 60 ngaøy ôû meùp caét xung quanh caùc maûnh laù xuaát hieän caùc ñoám traéng hình caàu nhoû li ti. Caùc laùt caét cuûa caùc khoái caàu naøy vôùi 200-300 teá baøo nhìn döôùi kính hieån vi coù theå thaáy roõ chuùng goàm caùc teá baøo ñaëc tröng cho phoâi (teá baøo chaát ñaäm ñaëc, khoâng coù khoâng baøo,nhaân to). Caùc phoâi hình caàu coù kích thöôùc töø 1 – 2 mm ñöôïc caáy vaøo moâi tröôøng nhaân phoâi vôùi 5mg/l BA, 0,1mg/l IBA vaø 40ng/l adenine. Neáu nhaân phoâi treân moâi tröôøng raén vôùi 8g/l aga, soá löôïng phoâi taêng leân khoaûng 2,5 laàn sau moät thaùng nuoâi caáy. Neáu nhaân phoâi trong moâi tröôøng loûng treân maùy laéc 50 voøng/phuùt soá löôïng phoâi taêng 7 – 8 laàn sau moät thaùng nuoâi caáy. Caùc phoâi phaùt trieån reã vaø laù soø seõ ñöôïc caáy chuyeàn sang moâi tröôøng nhaân gioáng khoâng coù chaát sinh tröôûng. Sau 50 – 60 ngaøy, khi caây coù 5 – 6 caëp laù coù theå ñöa ra vöôøn öôm. Do söï phaùt trieån cuûa phoâi voâ tính gioáng heät nhö phoâi höõu tính neân ñaõ coù nhieàu coâng trình nghieân cöùu taïo haït nhaân taïo töø phoâi voâ tính. Thaønh töïu cuûa coâng ngheä naøy seõ cung caáp cho saûn xuaát noâng nghieäp moät soá löôïng haït gioáng thuaàn chuûng voâ cuøng to lôùn trong moät thôøi gian ngaén, ñoàng thôøi seõ cho pheùp nhaø noâng gieo thaúng haït trong vöôøn öôm hay treân ñoàng ruoäng, giaûm nheï ñöôïc chi phí nhaân gioáng trong oáng nghieäm vaø chi phí vaän chuyeån. Cho ñeán nay moät soá coâng ty ña quoác gia ñaõ ñöa thaønh coâng haït nhaân taïo cuûa moät soá gioáng rau lai ra thò tröôøng. Ñoái vôùi caây caø pheâ, caùc nhaø khoa hoïc taïi Trung taâm Coâng ngheä sinh hoïc TP. Hoà Chí Minh ñaõ thaønh coâng böôùc ñaàu trong vieäc taïo haït nhaân taïo töø phoâi voâ tính cuûa caø pheâ lai Arabusta baèng caùch boïc phoâi baèng alginate trong dung dòch CaCl2.2H2O. Moät tính chaát quyù giaù cuûa alginate laø deã daøng taïo gen. Tuy nhieân vì gel alginate coù tính öa nöôùc neân sau khi duøng noù laøm voû boïc thì caàn phaûi boïc tieáp beân ngoaøi moät lôùp voû kî nöôøc ñeå haït deã baûo quaûn. Lôùp kî nöôùc naøy ñöôïc phuû baèng chitosan voán cuõng coù tính töông hôïp sinh hoïc nhö alginate. Vôùi ñieän tích döông cuûa mình, chitosan khi ñöôïc söû duïng laøm lôùp voû ngoaøi seõ laøm cho voû boïc meàm khi coù maët cuûa nöôùc. Tính beàn vöõng cuûa lôùp voû boïc coù theå ñöôïc taêng cöôøng baèng caùch trung hoøa soá ñieän tích döông dö thöøa cuûa chitosan. III. NHAÂN GIOÁNG BAÈNG CAÙCH TAÏO MOÂ SEÏO (CALLUS). Callus ñöôïc taïo ra treân maãu caáy in vitro ñeå ñaùp laïi taùc duïng cuûa caùc chaát taïo veát thöông vaø caùc chaát kích thích sinh tröôûng noäi sinh hoaëc ñöôïc boå sung vaøo moâi tröôøng. Caùc maãu caáy töø haàu nhö taát caû caùc caáu truùc hoaëc boä phaän cuûa thöïc vaät: caønh, reã, laù, caùc cô quan döï tröõ hoaëc quaû ñeàu ñöôïc söû duïng ñeå taïo callus. Caáy GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  36. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 35 - chuyeàn lieân tuïc vôùi khoaûng caùch ba hoaëc boán tuaàn töø caùc ñaùm teá baøo nhoû laáy töø khoái callus naøy coù theå duy trì callus trong thôøi gian daøi. Moâi tröôøng nuoâi caáy phoå bieán laø moâi tröôøng MS chöùa moät toå hôïp caân baèng caùc hôïp chaát voâ cô ñöôïc pha boå sung vôùi moâi tröôøng Linsmaier vaø Skoog coù thaønh phaàn höõu cô caân ñoái. Caû hai moâi tröôøng naøy ñeàu giaøu nguyeân toá ña löôïng, ñaëc bieät - + laø nitô, bao goàm caùc ion nitrate NO3 vaø ion ammon NH4 , saccharose vaø caùc vitamin. Ñeå baét ñaàu phaân chia teá baøo vaø taïo callus tieáp theo ñoøi hoûi phaûi cung caáp cytokinin vaø auxin cho moâi tröôøng vôùi tæ leä thích hôïp. Auxin vôùi noàng ñoä trung bình vaø cao laø yeáu toá sinh tröôûng ñaàu tieân ñöôïc söû duïng ñeå taïo callus. Caùc auxin chuû yeáu ñöôïc söû duïng laø IAA, NAA vaø 2,4-D theo traät töï taêng daàn tính hieäu quaû. Cytokinin (nhö kinetin hoaëc benzyladenine) ñöôïc cung caáp vôùi noàng ñoä thaáp hôn neáu chuùng coù quaù ít trong maãu caáy. Maëc duø khoái callus coù beà ngoaøi nhö moät khoái teá baøo ñoàng nhaát, nhöng treân thöïc teá caáu truùc cuûa chuùng töông ñoái phöùc taïp veà caùc baûn chaát hình thaùi, sinh lyù vaø di truyeàn. Sinh tröôûng cuûa chuùng tuaân thuû ñöôøng cong logarit ñieån hình: - Toác ñoä phaân chia teá baøo ban ñaàu raát chaäm, ñoøi hoûi phaûi coù auxin; - Phase phaân chia teá baøo raát nhanh cuøng vôùi sinh toång hôïp nhanh choùng ADN, ARN vaø protein; - Tieáp theo laø söï ngöøng töø töø toác ñoä phaân chia teá baøo ; - Cuoái cuøng laø phase phaân hoùa thaønh caùc nhoùm teá baøo nhu moâ vaø teá baøo moâ daãn. Phaân chia teá baøo khoâng xaûy ra vôùi toaøn boä khoái teá baøo nuoâi caáy maø chæ xaûy ra ban ñaàu ôû khoái teá baøo sinh tröôûng naèm taïi lôùp teá baøo maët ngoaøi. Boä phaän beân trong cuûa callus vaãn duy trì traïng thaùi khoâng phaân chia vaø duy trì ñaëc ñieåm sinh lyù, di truyeàn khaùc vôùi khoái teá baøo maët ngoaøi. Toác ñoä phaân chia cuûa lôùp teá baøo beân ngoaøi giaûm xuoáng vaø treân khoái callus xuaát hieän caùc u nhoû do söï phaân chia teá baøo bò haïn cheá ôû nhöõng khu vöïc teá baøo nhaát ñònh. Nhö vaäy, söï bieán ñoäng veà tuoåi vaø kieåu teá baøo coù theå xaûy ra beân trong khoái callus nuoâi caáy. Caùc teá baøo beân trong giaø hôn, caùc teá baøo beân ngoaøi treû hôn vaø vaãn duy trì khaû naêng sinh tröôûng. Söï taùi sinh caây con töø callus phuï thuoäc nhieàu vaøo tæ leä cytokinin/auxin boå sung vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy. Neáu tæ leä naøy cao seõ taïo choài laø chính, neáu ngöôïc laïi reã seõ hình thaønh, neáu tæ leä naøy caân baèng seõ vöøa taïo choài vöøa taïo reã. Treân cô sôû nguyeân taéc chung naøy caàn phaûi choïn tæ leä hai nhoùm phytohormon naøy thích hôïp cho töøng loaïi caây troàng. Callus coù tieàm naêng boå ích ñoái vôùi caùc phöông phaùp nhaân gioáng thöông maïi do coù toác ñoä taùi sinh caây con cao ôû quy moâ coâng nghieäp. Tuy nhieân, trong thöïc teá caùc phöông phaùp naøy chöa ñöôïc söû duïng moät caùch tröïc tieáp do trong quaù trình nhaân gioáng raát thöôøng xaûy ra hieän töôïng sai leäch di truyeàn vaø bieán ñoåi kieåu hình. Vì vaäy, kieåu heä thoáng nuoâi caáy naøy chuû yeáu ñöôïc söû duïng ñeå taïo ra caùc genotype môùi. Söï GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  37. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 36 - bieán ñoåi tính di truyeàn xaûy ra trong thöïc vaät ñöôïc taïo ra töø khoái teá baøo hoaëc callus ñöôïc goïi laø söï bieán ñoåi doøng voâ tính (somaclonal variation). Nhöõng bieán ñoåi naøy coù theå xaûy ra moät caùch töï nhieân hoaëc ñöôïc taïo ra baèng caùch xöû lyù caùc taùc nhaân gaây ñoät bieán hoaêïc baèng caùc kyõ thuaät coâng ngheä gen ñaëc bieät. Tuy nhieân, ñoái vôùi haøng loaït caây troàng vieäc nhaân gioáng thoâng qua taïo moâ seïo ñem laïi keát quaû raát toát. Coù theå tìm hieåu kyõ thuaät naøy qua ví duï ñoái vôùi caây mía ñöôøng. Laáy phaàn ngoïn mía 3 – 4 thaùng tuoåi, boùc boû caùc beï giaø vaø xöû lyù voâ truøng maãu baèng hypochlorit canxi 5% trong 20 phuùt. Caét phaàn laù non thaønh töøng maûnh coù kích thöôùc 0,5 x 2 cm vaø caáy vaøo moâi tröôøng MS coù boå sung 2,4D. Sau 2 tuaàn moâ seïo seõ hình thaønh. Khi ñaõ coù moâ seïo, ñem caáy chuyeàn ñeå moâ seïo ñaït kích thöôùc 15 – 16 mm. Choïn caùc moâ seïo khoâ vaø chaët chuyeån sang moâi tröôøng MS coù boå sung IBA vaø BA, ñaët döôùi aùnh saùng huyønh quang 2000-3000 lux. Sau 1 tuaàn caùc ñieåm xanh xuaát hieän vaø sau 3 – 4 tuaàn caây mía con hình thaønh, cao 2 – 3 cm, ñeû nhaùnh raát maïnh taïo thaønh cuïm choài. Khi ñaõ coù cuïm choài, caáy chuyeàn nhieàu laàn vaøo moâi tröôøng MS coù boå sung phoái hôïp giöõa BA vôùi IBA hoaëc NAA vôùi kinetin. Choài mía tieáp tuïc ñeû nhaùnh maïnh; moät soá choài vöôn cao thaønh caây mía con. Taùch nhöõng caây naøy caáy sang moâi tröôøng taïo reã vaø tieáp tuïc chia caùc cuïm choài ñeå caáy chuyeàn nhieàu laàn. IV. NHAÂN GIOÁNG BAÈNG NUOÂI CAÁY LAÙT MOÛNG Ñoái vôùi nhieàu laïi caây troàng ñeå nhaân gioáng ngöôøi ta söû duïng nhöõng laùt moûng caét töø nhöõng moâ coøn non nhö ñoaïn thaân non, thòt quaû non, cuû v.v Thí nghieäm cho thaáy trong nhieàu tröôøng hôïp phöông phaùp naøy cho keát quaû raát toát. Moät trong nhöõng tröôøng hôïp nhö vaäy laø ñoái vôùi vaûy haønh cuûa caây Hueä taây, hay caây Lys (Lilium longiflorum). Chuùng ta haõy laøm quen vôùi phöông phaùp naøy. Vaät lieäu nuoâi caáy laø nhöõng cuû lys ñaõ thaønh thuïc thu töø nhöõng caây khoûe maïnh khoâng coù caùc trieäu chöùng nhieãm virus. Sau khi röûa saïch cuû, taùch caùc vaûy lôùp ngoaøi vaø khöû truøng baèng chloramin 5%, HgCl2 0,1% hay moät chaát khöû truøng baát kyø thöôøng ñöôïc duøng trong kyõ thuaät nuoâi caáy moâ. Sau ñoù röûa laïi nhieàu laàn baèng nöôùc caát voâ truøng. Moãi vaûy ñöôïc ñaët vaøo moät ñóa Petri voâ truøng trong tuû caáy ñang hoaït ñoäng vaø caét theo chieàu ngang thaønh nhieàu laùt daøy 1 – 3 mm vaø caáy vaøo moâi tröôøng vôùi tö theá vaûy naèm ngöûa (maët trong cuûa vaûy höôùng leân treân). Caàn löu yù raèng tö theá cuûa maãu caáy aûnh höôûng raát lôùn ñeán khaû naêng taùi sinh caây con cuûa laùt caét. Thí nghieäm cho thaáy caùc tö theá khaùc cuûa maãu caáy coù khaû naêng taùi sinh caây con thaáp hôn nhieàu. Moãi maãu ñöôïc caáy vaøo moät oáng nghieäm. Neáu duøng bình tam giaùc 250ml thì moãi bình coù theå caáy 10 – 15 maãu. Coù theå duøng caùc moâi tröôøng ña löôïng vôùi möùc ñoä dinh döôõng khaùc nhau nhö MS, White, B5, Knuson C, thaäm chí caû moâi tröôøng Knop, nhöng toát nhaát laø moâi GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  38. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 37 - tröôøng MS. Taát caû caùc moâi tröôøng ña löôïng naøy ñeàu caàn ñöôïc boå sung vi löôïng Heller, vitamin Morel, 100mg/l inositol, 20g/l saccharose vaø 10g/l agar. Ñieàu kieän thuaän lôïi nhaát cho taùi sinh vaø sinh tröôûng cuûa caây Lys trong oáng nghieäm laø nhieät ñoä 18 – 20oC vaø cheá ñoä chieáu saùng 2500 – 3000 lux 16 giôø moãi ngaøy. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  39. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 38 - Sau khi caáy khoaûng 15 ngaøy maãu caáy chuyeån daàn sang maøu luïc vaø treân maãu caáy baét ñaàu xuaát hieän caùc khoái u. Nhöõng khoái u naøy lôùn daàn, sau khoaûng 30 ngaøy töø chuùng hình thaønh caùc cuû daïng haønh li ti vaø cuoái cuøng nhöõng cuû naøy phaùt trieån thaønh caây hoaøn chænh. Trong nhieàu tröôøng hôïp caùc teá baøo cuûa khoái u phaùt trieån thaønh caùc cuïm choài. Coù theå taùch vaø caáy chuyeàn nhieàu laàn nhöõng cuïm choài naøy ñeå taïo ra moät soá löôïng lôùn caây con. Trong tröôøng hôïp naøy ñeå taêng khaû naêng nhaân cuïm choài caàn boå sung vaøo moâi tröôøng dinh döôõng 2,0mg/l 2,4D hoaëc moät trong caùc toå hôïp phytohormone sau ñaây: 1/ 1,0mg/l 2,4D + 15% V dòch chieát chuoái xanh; 2/ 1,0mg/l 2,4D + 0,5mg/l BAP; 3/ 2,0mg/l NAA + 0,5mg/l BAP. Hình 3.Sô ñoà quy trình nhaân gioáng Lys trong oáng nghieäm Ñeå thuùc ñaåy sinh tröôûng caây con, caùc cuïm choài neân ñöôïc caáy chuyeàn sang moâi tröôøng ña löôïng MS + vi löôïng Heller + vitamin Morel vaø moät trong 4 loaïi phytohormone sau ñaây: 1/ 0,1mg/l 2,4D; 2/ 0,5mg/l NAA; 3/ 1,0mg/l BAP; 4/ 5% V dòch chieát chuoái xanh. Vieäc caáy chuyeàn cuõng coù theå thöïc hieän vôùi caùc vaûy haønh laáy töø caùc caây con taùi sinh trong oáng nghieäm. Sau khoaûng 2 thaùng coù theå thu ñöôïc caùc caây con hoaøn chænh ñeå ñem ra troàng ngoaøi vöôøn öôm treân moâi tröôøng giaøu muøn ñeå laáy cuû gioáng caáp moät. Nhöõng caây con naøy caàn ñöôïc troàng trong ñieàu kieän che naéng 50%, haøng ngaøy töôùi dung dòch Knop 50% vaø aùp duïng cheá ñoä phoøng tröø saâu beänh thích hôïp. Sau moät soá theá heä troàng ngoaøi ñoàng seõ thu ñöôïc caùc cuû ñuû lôùn duøng ñeå saûn xuaát hoa thöông phaåm. Sô ñoà quy trình nhaân gioáng Lys trong oáng nghieäm ñöôïc trình baøy trong hình 3. V. ÖÙNG DUÏNG KYÕ THUAÄT VI GHEÙP TRONG NHAÂN GIOÁNG. Ñoái vôùi nhieàu loaïi caây aên quaû, ñaëc bieät laø caùc loaïi caây coù muùi, kyõ thuaät gheùp chieám vò trí haøng ñaàu trong nhaân gioáng vì keát hôïp ñöôïc khaû naêng choáng chòu cuûa GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  40. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 39 - goác caây hoang daõ vôùi öu ñieåm naêng suaát vaø phaåm chaát cuûa caønh gheùp. Tuy nhieân,trong khi gheùp theo kyõ thuaät truyeàn thoáng do thôøi gian troàng goác gheùp keùo daøi vaø kích thöôùc maét gheùp quaù lôùn neân caùc beänh virus raát deã laây truyeàn. Ñeå khaéc phuïc nhöôïc ñieåm treân,kyõ thuaät gheùp ñænh sinh tröôûng (shoot apex grafting), hay goïi taét laø vi gheùp (micrografting) ñöôïc thöû nghieäm vaø mang laïi keát quaû toát. Veà nguyeân taéc, vi gheùp laø nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng nhöng thoâng qua dinh döôõng töï nhieân cuûa goác gheùp. Ñænh sinh tröôûng laøm maét gheùp coù kích thöôùc 0,2 – 0,5 mm ñöôïc taùch töø buùp non ñang sinh tröôûng maïnh cuûa caây meï tröôûng thaønh; goác gheùp laø maàm giaù môùi naûy töø haït cuûa gioáng hoang daïi. Toaøn boä caây gheùp ñöôïc nuoâi döôõng trong ñieàu kieän oáng nghieäm voâ truøng. Nhöõng caây gheùp thu ñöôïc baèng phöông phaùp naøy hoaøn toaøn saïch beänh vaø mang ñaëc ñieåm di truyeàn cuûa caây meï cho maét gheùp. Phöông phaùp vi gheùp ñoái vôùi caùc loaïi caây coù muoái (böôûi, cam, chanh, quyùt ) ñöôïc tieán haønh nhö sau: a/ Gieo haït laáy caây maàm laøm goác gheùp: Taùch haït töø quaû chín, röûa saïch vaø ñeå khoâ trong phoøng 24 giôø. Caát giöõ trong tuû laïnh ôû 4oC ñeå duøng daàn. Khi gieo boùc voû traáu, voû luïa, khöû truøng 5-10 phuùt baèng dung dòch HgCl2 0,1%, gieo treân moâi tröôøng khoaùng MS chöùa 2% saccharose,0,8% aga; ñeå maãu caáy trong toái ôû 25oC . Sau 10 ngaøy caây maàm daøi 5-8 cm ñöôïc choïn laøm goác gheùp. b/ Taùch ñænh sinh tröôûng laøm maét gheùp: Choïn caây meï tröôûng thaønh coù naêng suaát vaø phaåm chaát toát. Haùi buùp non daøi 1,5 – 3,0 cm, cho vaøo loï hoaëc tuùi nilon kín ñem veà phoøng thí nghieäm. Caét boû bôùt laù, khöû truøng baèng hypochlorit natri 0,5% trong 5 phuùt. Duøng kim nhoïn gaït boû nhöõng laù non, sau ñoù duøng löôõi dao caïo beû nhoïn ñeå taùch ñænh sinh tröôûng kích thöôùc khoaûng 0,5mm, ñeå nguyeân treân löôõi dao ñeå chuyeån vaøo vò trí gheùp. c/ Tieán haønh gheùp: Duøng dao caïo caét boû ñaàu reã, thaân truï treân laù maàm, ñeå laïi ôû phaàn reã chöøng 2- 3cm vaø ôû phaàn thaân chöøng 2cm. Coù 3 caùch gheùp: - Gheùp leân maët caét: Ñaët maét gheùp tröïc tieáp leân beà maët laùt caét, treân voøng töôïng taàng; - Gheùp chöõ T ngöôïc: Duøng ñaàu nhoïn löôõi dao caét loã gheùp hình chöõ T ngöôïc, chaân chöõ T laø maët caét ñeå deã boäc loä vuøng töôïng taàng; Ñaët maét gheùp sao cho maët caét cuûa noù tieáp xuùc vôùi töôïng taàng; GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc
  41. Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 40 - - Gheùp haøm eách: Khoeùt treân thaân maàm caùch maët caét 5mm moät veát loõm hình haøm eách, chieàu saâu veát loõm baèng beà daøy lôùp voû. Ñaët maét gheùp vaøo ñaùy haøm eách (hình 4). Hình 4. Vò trí maét gheùp trong 3 kieåu vi gheùp d/ Nuoâi caây gheùp: Caây gheùp ñöôïc ñaët vaøo oáng nghieäm lôùn (25 x 200 mm) chöùa 6ml moâi tröôøng MS loûng coù chöùa 7,5% ñöôøng. Ñeå caây khoâng chaïm vaøo thaønh oáng nghieäm, duøng moät maûnh giaáy saéc kyù 4,5 x 4,4 cm gaáp thaønh hình löôïn soùng ñeå laøm giaù ñôõ cho maãu. Nuoâi maãu ôû 25oC, chieáu saùng 16 giôø/ngaøy. Trong moät tuaàn maét gheùp ñaõ ñaït kích thöôùc 1,5 – 2,0 mm vaø sau 4 tuaàn choài gheùp ñaõ coù kích thöôùc 15 – 20 mm; reã cuûa goác gheùp cuõng moïc theâm reã phuï. Caây gheùp coù theå ñem troàng ra ñaát trong vöôøn öôm. Ñieàu quan troïng ñoái vôùi kyõ thuaät vi gheùp laø taïo ñöôïc söï tieáp xuùc giöõa maét gheùp vaø teá baøo töôïng taàng. Chæ 2 – 3 ngaøy sau khi gheùp coù theå quan saùt thaáy moät voøng moâ seïo phaùt sinh töø töôïng taàng. Ñoù laø ñieàu kieän ñeå maét gheùp vaø goác gheùp lieân keát vôùi nhau. Thí nghieäm cho thaáy: - Kieåu gheùp T ngöôïc coù hieäu quaû nhaát; - Thích hôïp ñoái vôùi cam gheùp leân böôûi laø caùc goác gheùp 14 ngaøy tuoåi; - Maëc duø maét gheùp lôùn coù tyû leä thaønh coâng cao, song ñeå ñaûm baûo tính saïch beänh virus khoâng neân duøng maét gheùp lôùn hôn 0,5mm. Cuõng caàn chuù yù laø trong naùch laù maàm cuûa goác gheùp coù caùc choài nguõ, bình thöôøng bò öu theá ngoïn öùc cheá. Khi gheùp ta khöû ngoïn neân nhöõng choài nguû naøy ñöôïc ñaùnh thöùc raát nhanh, laøm öùc cheá söï phaùt trieån cuûa maét gheùp. Ñeå traùnh tình trang naøy caàn khöû maét nguû baèng caùch khoeùt vaøo thaân khi khöû laù maàm ñeå loaïi tröø maét nguû. Choài phuï cuõng coù theå phaùt sinh töø töôïng taàng cuûa maët caét treân goác gheùp. Caàn loaïi boû chuùng ngay khi phaùt hieän ñeå taïo ñieàu kieän cho choài gheùp phaùt trieån nhanh. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc