›
›

Giáo trình Công nghệ DNA tái tổ hợp - Lê Việt Dũng

pdf 178 trang ngocly 3690
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Công nghệ DNA tái tổ hợp - Lê Việt Dũng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfgiao_trinh_cong_nghe_dna_tai_to_hop_le_viet_dung.pdf

Nội dung text: Giáo trình Công nghệ DNA tái tổ hợp - Lê Việt Dũng

  1. Simpo PDFPGS. Merge TS. and Nguyễn Split Unregistered Hoàng Lộc Version (chủ - TS. Lê Việt Dũng - TS. Trần Quốc Dung Giáo trình Công nghệ DNA tái tổ hợp NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 2007
  2. PSimpohụ lục PDF Merge and Split Unregistered Version - Một số thuật ngữ cơ bản Adapter. Một oligodeoxyribo tương tự linker, nhưng có một đầu bằng và một đầu lồi 5’ tương ứng với một vị trí cắt hạn chế vector có đầu tương đồng (xem thêm linker). Adenosine diphosphate (ADP). Một ribonucleoside 5’-diphosphate được cấu tạo từ adenine, đường ribose (5C) và hai gốc phosphate. ADP có tác dụng nhận phosphate trong chu trình năng lượng của tế bào. Adenosine triphosphate (ATP). Một ribonucleoside 5’-triphosphate được cấu tạo từ adenine, đường ribose (5C) và ba gốc phosphate. ATP là phân tử chứa năng lượng hóa học chính của tế bào, (mitochondria) (chloroplast). Các gốc phosphate của ATP có mang các liên kết khi bị thủy phân sẽ phóng thích một năng lượng tự do lớn. của , ADP thích hóa sinh nội . Đôi khi thủy p (adenosine monophosphate) để phóng thích nhiều hơn. Amino acid. Là một phân tử nhỏ mang một gốc amine (-NH3) và một gốc carboxyl (-COOH) liên kết với cùng một nguyên tử carbon. Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ sở của chuỗi polypeptide. Có 20 amino acid khác nhau trên các chuỗi polypeptide amino acid trên chuỗi polypeptide polypeptide . Ampicillin (Amp). đ (tái tổ hợp) được tạo . Công nghệ DNA tái tổ hợp 176
  3. SimpoBAC PDF (bacteria Merge artificialand Split chromosome). Unregistered VersionNhiễm sắc - thể nhân tạo của vi khuẩn, dựa trên cơ sở plasmid F-factor, được sử dụng làm vector tạo dòng. BAC có thể tái bản trong E. coli với các đoạn chèn DNA có kích thước lên đến 300 kb. Bản đồ cắt hạn chế (restriction map). Trình tự các vị trí nhận biết (recognition sites) của tất cả các enzyme hạn chế (restriction enzyme hay restriction endonuclease, RE) trên một phân tử DNA. Bazơ (analog base). hóa base nitrogen base một , base bắt base . Ví dụ: base adenine (A) 2-aminopurine gắn của adenine bắt e (G) ặp - -C. Bazơ nitơ (nitrogen base). cấu n nucleic acid (DNA và RNA) nitrogen base nucleic acid là adenine, guanine, cytosine và thymine (DNA) hoặc uracil (RNA). acid đã của cơ thể sinh vật. Bắt cặp bổ sung (complementary base pairing). Sự kết hợp thành từng đôi giữa các nitrogen base nằm trên hai mạch đơn của chuỗi xoắn kép DNA-DNA, DNA-RNA hoặc RNA-RNA thông qua các mối liên kết hydrogen. Sự bắt cặp đó mang tính đặc hiệu: guanine bắt cặp với cytosine, còn adenine bắt cặp với thymine trên DNA hoặc uracil trên RNA. Biến nạp (transformation). Là quá trình truyền DNA ngoại lai vào một tế bào nhận, chẳng hạn sphaeroplast hoặc protoplast, và có thể hợp nhất trong nhiễm sắc thể nhờ sự tái tổ hợp tương đồng hoặc được biến đổi trong một đơn vị sao chép tự trị (autonomous replicon). Sự biến nạp có thể xuất hiện trong các điều kiện tự nhiên ở một số vi khuẩn (ví dụ: Bacillus, Haemophilus, Neisseria và Streptococcus), nhưng ở nhiều vi khuẩn (ví dụ: E. coli) và các cơ thể sinh vật eukaryote sự biến nạp chỉ có thể xuất hiện ở những tế bào “thấm” được DNA bằng các phương pháp nhân tạo như: hóa biến nạp, điện biến nạp Công nghệ DNA tái tổ hợp 177
  4. SimpoBiế PDFn nạp Merge bằng điandện Split(electroporation). Unregistered K Versionỹ thuật dùng- xung điện tạo ra các lỗ thủng tạm thời trên màng sinh chất để đưa DNA ngoại lai vào bên trong tế bào vật chủ. Biến tính (denaturation). Là hiện tượng chuyển từ dạng mạch kép sang dạng mạch đơn của DNA và RNA thường do nhiệt gây nên. Biến tính của protein là hiện tượng chuyển từ cấu hình hoạt động thành dạng không hoạt động. Biểu hiện của gen (gene expression). Là các quá trình phiên mã (transcription) và dịch mã (translation) của một gen để tạo ra sản phẩm protein của nó. Cặp base (base pair, bp). Là liên kết A-T hoặc C-G trên một phân tử DNA mạch kép, và là đơn vị đo chiều dài của một phân tử DNA. Chromosome walking. Kỹ thuật này dùng để lập bản đồ nhiễm sắc thể từ tập hợp các đoạn DNA cắt hạn chế chồng lên nhau (overlapping). Bắt đầu từ một thư viện trong đó chứa các đoạn DNA nói trên đã được tạo dòng. Một đoạn DNA mang một gen đã biết được lựa chọn và sử dụng như một mẫu dò để nhận dạng (ví dụ: bằng cách lai khuẩn lạc) các đoạn khác, là các đoạn chồng lên nhau chứa cùng một gen. Sau đó, trình tự nucleotide của các đoạn này sẽ được phân tích và nhờ vậy có thể xác định được toàn bộ các đoạn của nhiễm sắc thể. Từ đó, bản đồ của một vùng đặc biệt sẽ được xây dựng dần dần. Chu trình sinh tan (lylic cycle). Một kiểu chu trình sống của thực khuẩn thể (bacteriophage) khi nó xâm nhiễm vi khuẩn, điều khiển các hoạt động sinh sản và sinh trưởng bằng các gen của nó và sinh ra các bacteriophage thế hệ con . C (lysogenic cycle). Là hiện tượng hệ gen của bacteriophage hiện diện ở trạng thái ổn định và không sinh tan trong tế bào vật chủ sống của nó. Các tế bào vật chủ có thể tiếp tục sinh trưởng và phân chia, và sự sao chép của hệ gen bacteriophage (prophage) được phối hợp với nhiễm sắc thể của vật chủ sao cho khi tế bào phân chia thì prophage cũng được chuyển vào trong cả hai tế bào con. Prophage được duy trì bằng cách hoặc hợp nhất trong nhiễm sắc thể vật chủ (ví dụ: bacteriophage λ, bacteriophage Φ105) hoặc như là một plasmid bên ngoài nhiễm sắc thể (ví Công nghệ DNA tái tổ hợp 178
  5. dụ:Simpo bacteriophage PDF Merge P1 vàand bacteriophage Split Unregistered F116). VersionTế bào vật - chủ có thể hoặc không thể biểu hiện ra một kiểu hình biến đổi. Chuỗi contig (contiguous sequence). M trình tự d ên nhau (overlapping). Chu (concatemer). . Chuỗi mã hóa (coding sequence). Đoạn phân tử DNA mang mã di truyền xác định để phiên mã thành mRNA và sau đó dịch mã thành chuỗi polypeptide. Ch (transgenic). Quá trình chuyển một ngoại lai (foreign DNA) bằng các kỹ thuật khác nhau (Agrobacterium, vi tiêm, bắn gen, xung điện ) vào một cơ thể vật chủ (vi sinh vật, động vật hoặc thực vật). Chuyển nhiễm (transfection). Kỹ thuật đưa DNA phage hoặc DNA virus vào các tế bào vật chủ. Cosmid. Vector lai (hybrid vector) của vị trí cos ( h) λ. Công nghệ DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology). Hệ thống các phương pháp phòng thí nghiệm cho phép cắt đoạn DNA từ một sinh vật để ghép nối vào DNA của một sinh vật khác tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp. Phân tử này được đưa vào các sinh vật khác nhau để tạo ra những giống chủng vi sinh vật, thực vật và động vật mới có những phẩm chất đặc biệt, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của sản xuất và đời sống con người. Công nghệ này có ứng dụng rộng rãi trong y học, dược học, nông nghiệp và nhiều ngành công nghiệp khác. Công nghệ sinh học (biotechnology). Theo nghĩa rộng là các quá trình công nghiệp có sử dụng vi sinh vật hoặc các tế bào động vật và thực vật (công nghệ sinh học ). Theo nghĩa phổ biến hiện nay đó là những quá trình sản xuất sử dụng các giống sinh vật mới, được tạo ra bởi công nghệ DNA tái tổ hợp (công nghệ sinh học ). Trong công nghệ sinh học ( , bia, , chăn nuôi ) trước tiên con thích hợp và Công nghệ DNA tái tổ hợp 179
  6. Simpo) PDF Merge and Split Unregistered Version - pháp như , gen công nghệ DNA ta thích hợp hơn, có thể bằng công nghệ sinh học trước đây vị trí cao hơn công nghệ sinh học. Deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP). triphosphoryl hóa ( DNA. N được ký hiệu cho một nitrogen base (A, G, ). Deoxyribonuclease (DNase). phân (phân hủy) DNA sợi đôi hoặc DNA sợi đơn. Deoxyribonucleic acid (DNA). , t nucleotide gốc phosphate nitrogen base . DNA khô hóa. . (T) (U) kép như DNA. ợ phiên mã là mRNA (messenger RNA). mRNA một ribosome dịch gọi . Năm 1962, Watson (Mỹ) và Crick (Anh) đã chia sẻ Giải Nobel với Wilkins (Anh) về phát minh ra cấu trúc không gian của DNA và ý nghĩa của nó trong việc truyền thông tin di truyền. Điều đáng tiếc là Franklin, người Công nghệ DNA tái tổ hợp 180
  7. đãSimpo có những PDF đóng Merge góp andđáng Split kể cho Unregistered phát minh này Version đã mất - trước đó. Theo qui định thì Giải Nobel không dược phép tặng cho người đã mất. đứt (nick translation). Phư [ -32P]dCTP nhờ enzyme DNA polymerase I của E. coli. (translation). . Quá trình chuyển thông tin di truyền trong trình tự base của mRNA sang trình tự amino acid của chuỗi polypeptide trong tế bào còn gọi là quá trình sinh tổng hợp protein. Dịch mã ngược (reverse translation). Là kỹ thuật phân lập các gen nhờ khả năng của chúng trong việc lai với một đoạn mã oligonucleotide nào đó, đoạn này được chuẩn bị bằng cách dự đoán đoạn mã nucleic acid từ những đoạn mã hóa của protein biết trước. Dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP). đồng phân một DNA gen (sequencing). Dimer. nhưng khối thủy. (complementary DNA, cDNA). trên khuôn mẫu mRNA nhờ quá trình (reverse transcription) m : trên m tương ứng là . V nhân tạo xây dựng thư viện cDNA (cDNA library). DNA khuôn mẫu (template DNA). (sao chép) hoặc khuếch đại DNA (PCR) . DNA polymerase. mẫu . Công nghệ DNA tái tổ hợp 181
  8. SimpoNăm PDF 1959, Merge hai nhà and khoa Split học Unregistered người Mỹ là VersionKornberg - và Ochoa đã được nhận Giải Nobel về những nghiên cứu đã làm sáng tỏ cơ chế cơ bản của quá trình sao chép DNA liên quan đến DNA polymerase I. DNA siêu xoắn (supercoiled DNA). DNA xoắn lại trên bản thân nó, thường là kết quả của sự gấp khúc, mở xoắn hoặc xoắn lại của chuỗi xoắn kép DNA. DNA (satellite DNA). Là những đoạn DNA mang các trình tự lặp lại nối tiếp có thành phần khác với trị số trung bình của DNA hệ gen. DNA vệ tinh heo và NA v DNA vệ tinh . Dòng (clone). Tập hợp các tế bào hoặc phân tử giống hệt nhau cùng bắt nguồn từ một tế bào hay phân tử ban đầu. Dot blot. Là k đoạn mồi DNA có đánh dấu đồng vị phóng xạ. cắt chế (restriction fragment length polymorphism, RFLP). Tính đa hình chiều dài các đoạn cắt hạn chế để chỉ các sai biệt di truyền ở vị trí nhận biết của các enzyme hạn chế (chẳng hạn như do sự thay đổi một nucleotide) dẫn đến sự sai biệt trong chiều dài của các đoạn hình thành từ phản ứng cắt hạn chế DNA với cùng một enzyme. RFLP thường được dùng để thiết lập bản đồ di truyền với một số marker di truyền biết trước. (end labelling). e nhờ enzyme T4 polynucleotide kinase. (blunt end). sợi đôi 3 5’ lồi ra (protruding ends). (cohesive ends hoặc sticky ends). . Đầu tận cùng C (C terminus). Gốc carboxyl (COOH) tự do ở vị trí tận cùng phân tử protein hoặc chuỗi polypeptide. Công nghệ DNA tái tổ hợp 182
  9. SimpoĐầu PDF tận Mergecùng N and(N terminus). Split Unregistered Gốc amin eVersion (NH2) ở - vị trí tận cùng của một phân tử protein hoặc chuỗi polypeptide. Tất cả các polypeptide đều được tổng hợp từ đầu tận cùng N đến đầu tận cùng C. đứt (nick). đứt gãy ở một sợi đơn trên DNA sợi đôi. Điện di trên gel (gel electrophoresis). Kỹ thuật dùng để phân tách các phân tử nucleic acid hoặc protein dựa vào sự dịch chuyển của chúng trên giá thể dạng gel (agarose hoặc polyacrylamide) dưới ảnh hưởng của điện trường. Sự dịch chuyển của các phân tử này phụ thuộc vào điện tích, cấu hình, kích thước và khối lượng phân tử của nucleic acid hoặc protein cũng như dung môi và nồng độ của chất dùng làm giá thể. Đoạn cắt hạn chế (restriction fragment). Các đoạn DNA nhỏ được sinh ra sau khi xử lý đoạn DNA lớn bằng enzyme hạn chế. Đoạn kết thúc phiên mã (terminator hay transcription terminator). Trình tự nucleotide nằm ở cuối gen hoạt động như một tín hiệu kết thúc sự phiên mã. Nó ra hiệu cho RNA polymerase giải phóng phân tử RNA mới được tạo thành ra khỏi gen. Lưu ý không được nhầm với các bộ ba kết thúc (terminator codons hay stop codons: UAG, UAA và UGA), xuất hiện trong mRNA, là tín hiệu dừng của sự dịch mã (xem mã vô nghĩa). Có hai loại terminator phổ biến: Rho-independent terminator (thường là một cấu trúc thân-quai (stem-loop structure) trong RNA được phiên mã) nằm ở đầu của các operons, và Rho-dependent terminator (vùng không có cấu trúc đặc trưng của RNA, khi không được dịch mã, nó được xem như là yếu tố Rho) là nguyên nhân gây ra chiều phân cực của sự dịch mã (translational polarity). (Klenow fragment). polymerase I (khối 76.000) của E. coli 5’ 3’. Đoạn mồi (primer). Một trình tự DNA hay RNA ngắn, bắt cặp với một mạch của DNA khuôn mẫu và có mang một đầu 3’-OH tự do giúp DNA polymerase bắt đầu tổng hợp một chuỗi DNA mới. Đoạn nhồi (stuffer fragment). Còn gọi là vùng đệm hay vùng trung tâm. Là một phần của phage λ có thể được loại bỏ và thay thế bằng đoạn chèn DNA (insert DNA) mà không ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của phage trong tế bào vật chủ. Công nghệ DNA tái tổ hợp 183
  10. Simpo PDF Merge and Split Unregistered(palindrome). Version Đoạn -DNA mạch kép có trình tự sắp xếp các base trên hai mạch đơn giống hệt nhau nếu cùng được đọc theo một chiều (chẳng hạn 5’ 3’). Ví dụ: các đoạn nhận biết của enzyme hạn chế. Đóng dấu (replica plating). Phương pháp chuyển nguyên mẫu các khuẩn lạc hoặc vết tan từ một đĩa thạch gốc sang đĩa thạch mới bằng cách dùng màng nylon (ví dụ: màng Hybond-N+) vừa khít áp lên mặt thạch của đĩa gốc để dính lấy các tế bào trong các khuẩn lạc (colony) hoặc vết tan (plaque) của đĩa gốc, rồi đưa màng này áp lên mặt thạch mới. hóa cho phân t kết thúc , nó có thể dài hơn một gen. Đơn vị sao chép (replicon). Đoạn DNA bắt đầu từ điểm khởi đầu sao chép kéo dài về hai phía tới hai điểm kết thúc sao chép. Đơn vị tái tổ hợp (recon). Đoạn DNA của gen có chiều dài đủ ngắn để sự trao đổi chéo không thể diễn ra ở bên trong nó được nữa. Hiện nay, được biết đó là một cặp nucleotide. Đuôi polyA (polyA tail). Đoạn trình tự dài 50-200 nucleotide adenine được bổ sung vào đầu 3’ của hầu hết các mRNA eukaryote sau khi phiên mã. E. coli (Escherichia coli). Vi khuẩn thường có trong ruột non của động vật có xương sống. E. coli được coi như sinh vật mẫu cho việc nghiên cứu hoạt động của tế bào. Đây là vi khuẩn Gram âm có kích thước genome khoản 4×106 base-pair. Các quá trình biểu hiện gen (phiên mã và dịch mã) đi đôi với nhau, sinh ra sợi mRNA được tổng hợp mới và được sử dụng ngay cho quá trình dịch mã. Không có hiện tượng biến đổi sau dịch mã (post-translation). Vì thế, E. coli được xem là một trong những tế bào vật chủ đơn giản nhất. Rất nhiều thí nghiệm tạo dòng gen đang được thực hiện hàng ngày tại các phòng thí nghiệm đều sử dụng E. coli làm vật chủ với nhiều chủng khác nhau về mặt di truyền và cho những ứng dụng đặc biệt. Endonuclease. Là enzyme nuclease acid đầu . Nuclease thủy phân những liên kết phosphodiester giữa các Công nghệ DNA tái tổ hợp 184
  11. nucleotideSimpo PDF của Mergemột phân and tử Split nucleic Unregistered acid. Các nuclease Version có- thể đặc hiệu đối với DNA (deoxyribonuclease) hoặc đặc hiệu đối với RNA (ribonuclease). Enzyme. . Enzyme gắn DNA (DNA ligase). 5’- phosphate 3’-hydroxyl tái bản . (restriction enzyme, RE). nhất định mà . Enzyme hạn chế được phát hiện vào năm 1970, chúng tồn tại trong tế bào vi khuẩn, có tác dụng cắt DNA ngoại lai (ví dụ: DNA của phage) tại những điểm xác định, để tiêu diệt DNA này. Cho đến nay hơn 900 enzyme hạn chế đã được tìm thấy. Các enzyme hạn chế được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm thao tác gen như những “chiếc kéo” cắt DNA tại những điểm đặc hiệu. Vị trí cắt phụ thuộc vào loại enzyme hạn chế được lựa chọn. Năm 1978, Arber (Thụy Sĩ), Nathans (Mỹ) và Smith (Mỹ) đã được nhận Giải Nobel nhờ phát hiện ra enzyme hạn chế và những ứng dụng của chúng để giải quyết nhiều vấn đề quan trọng của sinh học phân tử. Các enzyme này là những “chiếc kéo phân tử” có thể cắt DNA thành những đoạn xác định, đã mở ra một thời kỳ phát triển mới của sinh học hiện đại- Thời kỳ thao tác gen. Enzyme (reverse transcriptase). (RNA-dependent DNA polymerase) RNA virus (retrovirus) trong điều kiện in vitro. Exon. Các đoạn DNA trong gen có chức năng phiên mã. Exon tồn tại ở cả sinh vật prokaryote và eukaryote. Riêng ở sinh vật eukaryote các exon nằm xen kẽ với các đoạn intron. Các intron chiếm tới 90% tổng số DNA của tế bào eukaryote và không có chức năng phiên mã. Eukaryote. Sinh vật có tế bào mang nhân điển hình (nhân thật) nghĩa là nhân được bao bọc bởi màng nhân và tham gia vào hai cơ chế phân bào quan trọng là nguyên phân và giảm phân. Exonuclease. Loại enzyme nuclease chỉ tác động vào đầu tận cùng của phân tử nucleic acid, cắt ra từng nucleotide một theo thời gian. Chúng có thể chuyển hóa theo đầu 5’ hoặc 3’ của sợi DNA. Công nghệ DNA tái tổ hợp 185
  12. SimpoEx PDFvivo. MergeThuật ngữ and d Splitùng để Unregistered chỉ các thí nghiệm Version thực - hiện trên tế bào nuôi cấy, các tế bào này sau đó sẽ được đưa vào một cơ thể sống. -galactosidase. Enzyme được mã hóa bởi gen lacZ. Enzyme này thủy phân lactose thành glucose và galactose. Gen (gene). Là đơn vị di truyền, yếu tố quyết định một tính trạng cơ thể. Thông tin di truyền của các gen được mã hóa trong DNA quyết định tính biến dị của loài và của cá thể. DNA là một chuỗi bao gồm các đơn vị nucleotide, có bốn loại nucleotide mang bốn nitrogen base khác nhau là adenine (A), guanine (G), cytosine (C), và thymine (T). Trình tự các nucleotide của một gen xác định một polypeptide hoặc một RNA. Gen có khả năng bị đột biến. Các gen chủ yếu nằm dọc theo nhiễm sắc thể ở trong nhân tế bào. Mỗi gen chiếm một vị trí xác định trên nhiễm sắc thể gọi là locus. Gen có thể tồn tại ở nhiều dạng gọi là các allele. Các gen biểu hiện thông qua các phân tử do chúng sinh ra là RNA (trong quá trình phiên mã) và protein (trong quá trình dịch mã). Gen chỉ thị (reporter gene). Là một gen mã hóa mà sản phẩm của nó được trắc nghiệm một cách dễ dàng (ví dụ chloramphenicol acetyltranferase). Gen chỉ thị có thể được gắn với bất kỳ một promoter nào sao cho sự biểu hiện của nó có thể được dùng để thử nghiệm chức năng của promoter. Gen lacZ. Gen của E. coli mã hóa -galactosidase thích hợp cho chọn lọc thể biến nạp bằng khuẩn lạc xanh ( -galactosidase sẽ kết hợp với IPTG và X-gal được bổ sung trong môi trường nuôi cấy) và khuẩn lạc trắng (đoạn DNA ngoại lai xen vào giữa gen lacZ làm cho gen này mất hoạt tính vì thế không sản xuất được -galactosidase). Ghép đôi lệch (mismatch). Sự ghép đôi không đúng với quy luật bổ sung giữa các nucleotide thuộc hai sợi đơn DNA trong mạch kép. Ghép exon hay splicing (RNA). Quá trình cắt bỏ những intron và nối các exon của sản phẩm phiên mã ban đầu (tiền thân mRNA) để tạo thành mRNA hoàn chỉnh (mature mRNA). Quá trình biến đổi này xảy ra trong nhân tế bào. Gốc tái bản (origin, ori). Trình tự nucleotide hoặc vị trí trên DNA mà ở đó bắt đầu sự tái bản (sao chép). Công nghệ DNA tái tổ hợp 186
  13. SimpoGradient. PDF Merge Biến thiênand Splitcủa một Unregistered đại lượng theo Version một hướng- nào đó. Một gradient mật độ được xác lập trong một số trường hợp ly tâm. Một gradient proton hoặc ion được tạo ra qua một màng nhờ sự vận chuyển tích cực đòi hỏi năng lượng. Hệ gen (genome). Là tập hợp các gen có trong một tế bào đơn bội eukaryote, trong một tế bào prokaryote hoặc trong một virus. H , v : hệ gen 1,6 . , (chromosome), - , nhưng 3 tỷ . Hoạt tính phóng xạ đặc hiệu (specific radioactivity). Là hoạt độ phóng xạ trên một đơn vị nguyên liệu, chẳng hạn: một mẫu dò đánh dấu phóng xạ có thể có hoạt tính đặc hiệu 106 lần đếm/phút trên microgram. Hoạt tính đặc hiệu cũng được dùng để xác định hoạt độ của enzyme. Huỳnh quang (fluorescence). Hiện tượng phát một sóng ánh sáng có bước sóng khác với bước sóng đã được hấp thụ trước đó. Một số phân tử được gọi là thể huỳnh quang (ví dụ: enzyme luciferase ở con đom đóm) do có đặc tính này. In dấu DNA (DNA fingerprinting) hay in dấu di truyền (genetic fingerprinting). Là phương pháp dùng các mẫu dò phóng xạ hoặc dùng kỹ thuật PCR để nhận dạng các băng DNA có các đoạn lặp lại với tần số cao. Bản mẫu hình các băng DNA là duy nhất đối với mỗi cá thể, và do vậy có thể dùng để xác định đặc trưng cá thể hoặc quan hệ huyết thống. In dấu chân DNA (DNA footprinting). Phương pháp nhận dạng các vùng DNA mà các protein điều hòa bám vào. Intron. Những đoạn DNA nhỏ ở sinh vật eukaryote không mang thông tin mã hóa amino acid, phân bố rải rác dọc theo phân tử DNA. Sau khi thông tin từ DNA được phiên mã sang mRNA thì các intron trên mRNA bị cắt bỏ, các đoạn mRNA còn lại gồm toàn các exon được nối lại với nhau Công nghệ DNA tái tổ hợp 187
  14. vàSimpo chuyể nPDF đến Merge ribosom ande đ ểSplit dùng Unregistered làm khuôn mVersionẫu cho - quá trình dịch mã. Intron không thấy có ở sinh vật prokaryote. In vitro và in vivo. thuật ngữ (in vitro (in vivo với phát triển nay computer in silico. Kéo dài đoạn mồi (primer extension). Sự tổng hợp một bản sao nucleic acid bắt đầu từ đoạn mồi. Được sử dụng để đánh dấu phóng xạ đoạn DNA làm mẫu dò hoặc khuếch đại một đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR. Kháng nguyên (antigen). Phân tử thường tìm thấy trên bề mặt tế bào, có tác dụng kích thích sự tạo thành kháng thể. Do vậy, nó được dùng để gây nên một phản ứng miễn dịch. Kháng thể (antiboby). Một protein (immunoglobulin) do bạch cầu lympho B của hệ thống miễn dịch sản sinh, có tác dụng nhận biết một kháng nguyên ngoại nhập đặc hiệu và gắn với nó, nếu kháng nguyên nằm trên bề mặt tế bào thì việc gắn kết này sẽ dẫn tới sự kết cụm tế bào và làm bất hoạt kháng nguyên. Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody). (antigen) , của loại . Tuy nhiên, . Khuếch đại (amplification.) Sự sản xuất nhiều bản sao của một trình tự DNA nhờ kỹ thuật PCR. Khung đọc mở (open reading frame, ORF). Là một trình tự mã hóa chuỗi polypeptide được bắt đầu với mã khởi đầu (initiation codon) và kết thúc bằng một mã dừng (stop codon). Một khung đọc mở bị ngăn chận nếu một stop codon được định vị gần với mã khởi đầu. Mặc dù về lý thuyết , do đó sẽ , tuy nhiên trong thực tế khung đọc chính xác được xác định bởi một điểm bắt đầu cố định. Công nghệ DNA tái tổ hợp 188
  15. SimpoKhuyết PDF đoạnMerge (deletion, and Split deficiency) Unregistered. Đột Versionbiến nhiễm - sắc thể dẫn đến làm mất một đoạn vật chất di truyền và thông tin di truyền chứa trong nó rời khỏi nhiễm sắc thể. Kiểu hoang dại (wild type). Dạng thường thấy nhất của một gen trong quần thể hoang dại. Allele kiểu hoang dại được ký hiệu bằng một chữ in hoa hoặc thêm dấu cộng sau chữ viết thường, ví dụ: A hay a+. Allele kiểu hoang dại thường là trội và cho kiểu hình bình thường. Kilobase (kb). 1000 base (hoặc cặp base), được dùng như đơn vị để đo hoặc xác định chiều dài của các phân tử DNA hoặc RNA. Kinase. Các enzyme xúc tác phản ứng phosphoryl hóa một phân tử nhận nhờ ATP. Kỹ thuật di truyền (genetic engineering). Còn gọi là công nghệ DNA tái tổ hợp. Bao gồm hệ thống các phương pháp di truyền phân tử dùng để thao tác vật chất di truyền, với ba bước chính gồm ba khâu chính. 1) Tách chiết DNA từ những sinh vật khác nhau; 2) Cắt và nối DNA ở những điểm đặc hiệu để tạo ra DNA tái tổ hợp (DNA mang các gen có nguồn gốc khác nhau), ví dụ: DNA plasmid có mang gen của người; 3) Đưa DNA tái tổ hợp vào hoạt động trong các tế bào hoặc cơ thể sống để sinh ra những sản phẩm đặc biệt cần thiết cho con người, ví dụ: DNA plasmid mang gen tạo insulin của người được đưa vào vi khuẩn E. coli để sản xuất. Lai khuẩn lạc (colony hybridization). K in situ vector khảm (chimeric vector) vector một hóa . Lai phân tử (molecular hybridization). Quá trình trong đó hai mạch nucleic acid bổ sung (A-T, G-C) bắt cặp hình thành nên một mạch kép. Đây là một kỹ thuật hữu ích để phát hiện một trình tự nucleotide chuyên biệt. Lai tại chỗ (in situ hybridization). Quá trình bắt cặp giữa mẫu dò (là một trình tự DNA sợi đơn hay RNA) với DNA của tế bào được cố định trên lam kính. Lập bản đồ hạn chế (restriction mapping). Kỹ thuật dùng để xác định vị trí các điểm cắt hạn chế trên phân tử DNA. Linker. Một oligonucleotide tổng hợp có hai đầu bằng, Công nghệ DNA tái tổ hợp 189
  16. Simpo PDF Merge and Split Unregisteredtrước Version đó - E. coli để tạo đầu bằng. Các linker sau khi gắn với hai đầu bằng của đoạn cDNA nhờ DNA ligase sẽ được cắt hạn chế để tạo ra đầu so le tương đồng với hai đầu của vector. Phản ứng gắn giữa đoạn cDNA có mang linker ở hai đầu với vector cũng được xúc tác nhờ DNA ligase. Lysosome. Một bào quan có màng bao bọc ở trong tế bào chất của những tế bào eukaryote. Lysosome chứa nhiều enzyme thủy phân. Ly tâm theo gradient mật độ (density gradient centrifugation). Kỹ thuật tách các hợp chất dựa vào sự khác nhau về mật độ của chúng được thực hiện bằng phương pháp ly tâm để làm lắng các chất qua một gradient nồng độ của saccharose hoặc CsCl. Mã di truyền (codon). Nhóm ba nucleotide nằm kề nhau (bộ ba) trên phân tử mRNA xác định một amino acid trên chuỗi polypeptide, hoặc là tín hiệu kết thúc việc tổng hợp polypeptide. Mã thoái biến (degenerate codon). Mã di truyền mà ở đó một amino acid được quy định bởi một số bộ ba nitrogen base, chứ không phải chỉ bởi một bộ ba. Thoái biến là đặc điểm vốn có của mã di truyền tồn tại phổ biến ở sinh giới. (nonsense codon) hay mã dừng (stop codon). Là codon polypeptide ba codon (UGA) Maturation. Quá trình trong đó các mRNA vừa được phiên mã trải qua một số biến đổi hóa học để trở thành mRNA hoàn chỉnh sẵn sàng làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp protein. Máy đếm nhấp nháy (scintillation counter). Máy dùng để xác định hoạt tính phóng xạ trong một mẫu thí nghiệm. Mẫu dò (probe). Một đoạn RNA hay DNA chuyên biệt được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hay bằng hóa chất (chất phát huỳnh quang hoặc enzyme), dùng để định vị một trình tự nucleic acid nhất định thông qua kỹ thuật lai phân tử (xem Northern blot, Southern blot ) Công nghệ DNA tái tổ hợp 190
  17. SimpoMậ PDFt độ quangMerge (opticaland Split density). Unregistered Thông Versionsố cho phép - đo độ hấp thụ ánh sáng ở một bước sóng nào đó của một môi trường hoặc dung dịch. Monomer. Là các phân tử đơn vị nhỏ, có thể liên kết với các phân tử đơn vị giống nó để hình thành những phân tử lớn hơn (polymer). Ví dụ: các nucleotide là các monomer của nucleic acid và các amino acid là monomer của protein. Nấm men Saccharomyces cerevisiae. Là một vi sinh vật nhân thật được sử dụng nhiều trong công nghệ DNA tái tổ hợp. Genome của nấm men S. cerevisiae khoảng 1,35×107 base-pair nhiều hơn E. coli khoảng 3,5 lần. Nấm men thường được dùng làm tế bào vật chủ để biểu hiện những protein có cấu trúc phức tạp cần quá trình hậu dịch mã mà vi khuẩn E. coli không thể đáp ứng. Nhân tố kiểm soát phiên mã (transcription control element). Đoạn nucleotide nằm xung quanh điểm bắt đầu và kết thúc của mỗi gen, tham gia vào sự điều hòa hoạt động biểu hiện của gen. Nhiệt độ nóng chảy (melting temperature, Tm). Là nhiệt độ mà ở đó có một nửa số phân tử của một trình tự DNA bị biến tính. Northern blot. Kỹ thuật chuyển và cố định RNA từ formaldehyde agarose gel (sau khi được phân đoạn bằng điện di) lên màng lai bằng nylon hoặc nitrocellulose để lai với mẫu dò được đánh dấu đồng vị phóng xạ [ - 32P]dCTP hoặc digoxigenin-dUTP. Nucleic acids. Những polynucleotide sinh học thiên nhiên, trong đó những đơn vị nucleotide được kết hợp với nhau bởi những liên kết phosphodieste thành trình tự DNA hoặc RNA riêng biệt. Nucleoside. Một hợp chất gồm một base purine hoặc pyrimidine kết hợp đồng hóa trị với một phân tử đường pentose. Nucleotide. Một nucleoside phosphoryl hóa với một trong những hydroxyl của pentose. Phân tử đóng vai trò cấu trúc cơ sở của DNA và RNA, gồm ba phần: đường pentose (ribose trong RNA, deoxyribose trong DNA), nitrogen base và gốc phosphate. Nucleolytic. P thủy nucleic acid. Công nghệ DNA tái tổ hợp 191
  18. SimpoNuclease PDF Merge Bal 31. and Mộ Splitt loạ iUnregistered enzyme exonuclease Version th -ủ phân cả hai sợi của phân tử DNA cùng một lúc. Oligo. Tiếp đầu ngữ có nghĩa là “ít”, ví dụ: oligonucleotide (polynucleotide) có ít nucleotide hoặc oligopeptide (polypeptide) có ít peptide. Oligo(dT)-cellulose. Một đoạn ngắn gồm các gốc deoxy-thymidine liên kết với cơ chất cellulose, được sử dụng để tinh sạch mRNA eukaryote bằng phương pháp sắc ký cột. Oligomer. Thuật ngữ chung để chỉ một đoạn ngắn các monomer. Oligonucleotide. Một đoạn ngắn các monomer là nucleotide, thường từ 20-30 nucleotide. Ôn hòa (temperate). Trạng thái tiềm tan của các bacteriophage tế bào vật chủ. -peptide. Một phần của protein -galactosidase, được mã hóa bởi đoạn gen lacZ. Phage. Viết tắt của bacteriophage (thực khuẩn thể), là loại virus xâm nhiễm và sinh sản bên trong vi khuẩn. Phage thường có vỏ bọc protein, phức hợp bao gồm phần đầu có hình đa diện chứa nucleic acid và đuôi mà qua đó nucleic acid xâm nhập vào vi khuẩn chủ. Sau quá trình nhân lên của nucleic acid của phage, tế bào vi khuẩn chủ thường bị tan biến. Loại phage luôn luôn làm tan tế bào vi khuẩn khi chúng xâm nhiễm vi khuẩn gọi là phage độc. Ví dụ: phage T4. Ngược lại, còn có phage ôn hòa, khi xâm nhiễm vi khuẩn nó gây nên phản ứng tiềm tan, nghĩa là hệ gen của phage gắn vào nhiễm sắc thể vi khuẩn và được sao chép cùng với nhiễm sắc thể đó. Hệ gen của phage ở trạng thái gắn như vậy với nhiễm sắc thể vi khuẩn gọi là prophage. Phagemid. Là một loại plasmid vector có mang các đoạn trình tự của phage. Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction, PCR). Phương pháp dùng trong phòng thí nghiệm để khuếch đại các đoạn DNA đặc biệt lên hàng triệu lần trong vòng vài giờ thông qua 20-30 chu kỳ nhiệt, mỗi chu kỳ bao gồm ba mức nhiệt độ: biến tính ở 90-95oC, bắt cặp với mồi Công nghệ DNA tái tổ hợp 192
  19. ở Simpo40-65o CPDF hoặc Merge hơn và and tổng Split hợp Unregisteredmạch mới nhờ VersionDNA polymerase - chịu nhiệt (Taq polymerase) ở 70-72oC. PCR có ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán y học, phân tích sự đa dạng sinh học, chọn giống và trong nhiều lĩnh vực khác. Nhà khoa học Mỹ (Tiến sĩ Mullis) người phát minh ra kỹ thuật PCR đã nhận giải Nobel năm 1993. Cùng chia sẻ Giải Nobel với Mullis là Smith (Canada) do có những đóng góp mang tính nền tảng cho việc gây đột biến điểm định hướng, dựa trên các oligonucleotide và việc phát triển chúng trong các nghiên cứu protein. Phân tích trình tự gen (gene sequencing). Là kỹ thuật xác định trình tự theo cấu trúc bậc một của chuỗi các nucleotide trong một phân tử nucleic acid. Phân tích trình tự của DNA có các phương pháp hóa học của Maxam- Gilbert và phương pháp enzyme của Sanger. Trong những năm gần đây, một số phương pháp xác định trình tự mới nhờ sự hỗ trợ của máy tính đã xuất hiện. Bên cạnh kỹ thuật thông thường sử dụng các polyacrylamide gel để phân ly các phân tử DNA có độ dài khác nhau, các kỹ thuật mới liên quan đến phát hiện huỳnh quang của các nucleotide được đánh dấu, phân tích trình tự DNA bằng khối phổ, điện di mao dẫn hoặc lai với các đoạn oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo cũng đã ra đời. Năm 1980, Sanger (Anh) và Gilbert (Mỹ) đã được trao giải Nobel do đã có những đóng góp quan trọng về phương pháp xác định trình tự các nucleotide trong phân tử DNA. Đóng góp này là mốc lịch sử to lớn trong sinh học phân tử, là nguyên lý của tất cả các máy xác định trình tự DNA tự động đang sử dụng hiện nay trên khắp thế giới. Phần cuối (telomere). Đoạn cuối, phần cuối của một nhiễm sắc thể thẳng của eukaryote, bao gồm những trình tự DNA ngắn được lặp lại nhiều lần. Phần tâm (centromere). Phần co thắt được thấy trên nhiễm sắc thể ở kỳ giữa, đó là nơi hai nhiễm sắc tử đính với nhau. Phiên mã (transcription). Là quá trình được xúc tác bởi enzyme phiên mã RNA polymerase để tổng hợp mRNA từ khuôn mẫu DNA. Phiên mã ngược (reverse transcription). Quá trình tổng hợp DNA từ khuôn mẫu mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase). Công nghệ DNA tái tổ hợp 193
  20. SimpoPhóng PDF xạ Merge tự ghi and (autoradiography). Split Unregistered Kỹ Versionthuật phát - hiện các phân tử có đánh dấu phóng xạ thông qua hiệu ứng tạo ảnh của các phân tử này trên phim X-quang. Phosphatase kiềm (alkaline phosphatase). Enzyme loại bỏ các nhóm 5’-phosphate từ đầu của các phân tử DNA và để lại các nhóm 5’- hydroxyl. Plasmid. có cấu trúc mạch vòng kép, nằm trong tế bào chất và ngoài nhân, có khả năng sao chép độc lập đối với nhiễm sắc thể của tế bào. Tồn tại cả ở sinh vật prokaryote và eukaryote. Ngày nay, các plasmid thiết kế nhân tạo được sử dụng rộng rãi như là các vector dùng trong các kỹ thuật tạo dòng và biểu hiện gen. Plasmid không tiếp hợp (non-conjugative plasmid). Ví dụ: plasmid ColE1, là loại plasmid không dùng sự tiếp hợp cho quá trình sống, thông thường là các plasmid có kích thước bé, tồn tại với một số lượng nhiều. Cơ chế nhân lên (nhiều bản sao) của chúng cũng khác hoàn toàn với plasmid tiếp hợp. Plasmid không tương hợp (incompatible plasmid). Là những plasmid có thể cùng tồn tại với nhau trong một vài thế hệ ở tế bào vật chủ, sau đó trong quá trình phân chia của tế bào, một số trong chúng sẽ bị thải loại. Muốn tương hợp trong cùng một tế bào vật chủ, các plasmid khác nhau phải có chung một số đặc điểm trong quá trình tồn tại. Plasmid tiếp hợp (conjugative plasmid) hay plasmid F (fertility (F) plasmid). Là các plasmid chuyển giao những bản sao DNA của chúng từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác nhờ phương thức tiếp hợp (do chúng có tổ hợp gen để sản xuất các ống protein hay còn gọi là lông giới tính (sex pile) làm cầu nối giữa hai tế bào vi khuẩn với nhau). DNA của plasmid, thậm chí cả DNA của hệ gen vi khuẩn, thông qua các ống protein này để chuyển từ tế bào vi khuẩn “cho” sang tế bào vi khuẩn “nhận”. Các plasmid, ngoài việc chuyển giao DNA của riêng chúng, còn có khả năng chuyển giao một phần hay nhiều phần hệ gen của tế bào vi khuẩn vật chủ đến tế bào vi khuẩn “nhận” khác. Do vậy, chúng được gọi là các nhân tố giới tính (sex factor) của vi khuẩn vật chủ, có vai trò quan trọng trong bảo tồn di truyền của vi khuẩn theo phương thức này. Công nghệ DNA tái tổ hợp 194
  21. SimpoPlasmid PDF Mergetương hợpand (compatibleSplit Unregistered plasmid). Version Là những - loại plasmid có trong cùng một tế bào vật chủ nhưng không ảnh hưởng lẫn nhau. Khi tế bào vật chủ phân chia, chúng cùng đồng thời phân chia và tồn tại vĩnh viễn. Polyacrylamide. Là polymer của acrylamide và bisacrylamide có cấu trúc gồm các liên kết chéo tạo ra một mảng xốp (giống bọt biển). Các chất phải chui vào lỗ gel mới ra được, vì vậy những chất nào có khối lượng phân tử nhỏ sẽ ra trước và ngược lại. Polynucleotide. Trình tự những nucleotide nối đồng hóa trị với nhau, trong đó vị trí 3’ của pentose của một trong những nucleotide được nối với một liên kết phosphodieste ở vị trí 5’ của pentose của nucleotide tiếp theo. Polypeptide. Một chuỗi dài những amino acid nối với nhau bởi những liên kết peptide. Prokaryote. Sinh vật đơn bào không có nhân tế bào điển hình, DNA nằm trong tế bào chất không có màng bao bọc, không có nguyên phân và giảm phân; đại diện điển hình là vi khuẩn. Prophage. Phage ôn hòa đã xen vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn tiềm tan. Nó sao chép đồng thời với nhiễm sắc thể của tế bào vi khuẩn chủ. Protein. Một phân tử lớn gồm một hoặc nhiều chuỗi polypeptide, mỗi chuỗi có một trình tự amino acid và một khối lượng phân tử đặc trưng. Protein là hợp chất quan trọng bậc nhất đối với cơ thể sống. Về cấu trúc, protein là phân tử mạch dài gồm các đơn vị cấu trúc nhỏ là các amino acid nối với nhau qua mối liên kết peptide. Khối lượng phân tử của protein từ vài nghìn đến vài triệu. Có khoảng 20 loại amino acid. Các loại protein phức tạp hơn có liên kết thêm với các nhóm bổ sung. Protein dung hợp (fusion protein). Là một protein tái tổ hợp lai được mã hóa bởi một gen lai (fusion gene) do sự dung hợp in vitro các đoạn gen khác nhau trên plasmid vector và sau đó biến nạp vào vi sinh vật chủ (chẳng hạn E. coli). Vì vậy, protein dung hợp sẽ mang trình tự amino acid của hai protein khác biệt được tổng hợp từ đầu N của vector biểu hiện. Protein nguyên thể (native protein). Là một protein tái tổ hợp được mã hóa bởi một gen ngoại lai (foreign gene) trong vi sinh vật chủ. Khác với protein dung hợp, protein nguyên thể được tổng hợp từ đầu N của nó chứ không phải từ đầu N của vector. Công nghệ DNA tái tổ hợp 195
  22. SimpoPurine. PDF MộtMerge hợp and chất Split dị vòng, Unregistered kiềm, có Versionnitrogen ,- là thành phần của những nucleotide và nucleic acid. Purine chứa một nhân pyrimidine kết hợp với một nhân imidazol. Pyrimidine. Một nitrogen base dị vòng có ở trong các nucleotide và nucleic acid. Retrovirus. Là loại virus RNA chứa enzyme reverse transcriptase và sinh sản dưới dạng DNA mạch kép. Chúng có khả năng xâm nhiễm tế bào vật chủ cao. Khi xâm nhiễm nó có khả năng gắn hệ gen của virus với hệ gen của tế bào vật chủ, là cơ sở để thiết kế các vector liệu pháp gen hiệu quả. Ribonuclease. Enzyme xúc tác đặc hiệu việc phân hủy RNA bằng cách cắt các mối liên kết phosphodiester trên RNA. Ribonucleic acid (RNA). Thường là phân tử đa phân mạch đơn gồm các đơn vị cấu trúc cơ sở là ribonucleotide. Về mặt hóa học RNA rất giống với DNA. RNA là v óa trong DNA. Ribonucleotide. Đơn vị cấu trúc cơ sở của RNA, gồm ba thành phần: đường ribose, nitrogen base và nhóm phosphate. Ribosome. . Người ta cũng thấy ribosome trong ty thể, ở đó có sự tổng hợp một số protein ty thể. RNA bổ sung (complementary RNA). . RNA ligase. mRNA (pre-mRNA) eukaryote mRNA hoàn chỉnh e. RNA polymerase. polymerase (DNA-dependent RNA polymerase), x mẫu . Công nghệ DNA tái tổ hợp 196
  23. SimpoRNA PDF ribosome Merge (ribosomaland Split Unregistered RNA, rRNA). Version L - E. coli . RNA thông tin (messenger RNA, mRNA). Một loại RNA được phiên mã từ một trình tự DNA. mRNA truyền thông tin di truyền từ nhiễm sắc thể tới ribosome để mẫu, các nucleotide m sung polynucleotide mẫu ngoại hymine l và p m được ribosome. (transfer RNA, tRNA) amino acid ribosome m amino acid e phân tử pro amino acid một và amino acid của nitrogen base trên mRNA . RNA kích thước nhỏ của nhân (small nuclear RNA, snRNA). . Sàng lọc (screening). Kỹ thuật nhận dạng một dòng DNA trong một thư viện hệ gen (genomic library) hoặc thư viện cDNA (cDNA library) bằng một phương pháp lai mẫu dò có đánh dấu [ -32P]dCTP với các vết tan (trường hợp dùng bacteriophage λ làm vector tạo dòng và cho xâm nhiễm vào vi khuẩn E. coli) hoặc khuẩn lạc (dùng plasmid làm vector tạo dòng) của các thư viện đó trên màng nylon hoặc nitrocellulose. Tín hiệu lai được phát hiện bằng phóng xạ tự ghi trên phim X-quang. Công nghệ DNA tái tổ hợp 197
  24. SimpoSinh PDF họ cMerge phân and tử (molecular Split Unregistered biology). Version Khoa h ọ- c nghiên cứu các hiện tượng sống ở mức độ phân tử. Lĩnh vực khoa học trẻ tuổi này là điểm gặp nhau của các khoa học kinh điển như di truyền học, hóa sinh học, tế bào học, vật lý học, hóa học hữu cơ và hóa lý. Theo cách hiểu phổ biến hiện nay, sinh học phân tử là khoa học nghiên cứu các gen và hoạt động của chúng ở mức độ phân tử, bao gồm phiên mã, dịch mã, sao chép, điều hòa biểu hiện gen, tái tổ hợp và chuyển gen Sinh tổng hợp protein (protein synthesis). Phản ứng hóa học diễn ra trên ribosome tạo nên các phân tử protein từ các amino acid trên cơ sở thông tin di truyền nhận được từ trong nhân tế bào thông qua mRNA. Southern blot. Kỹ thuật chuyển và cố định DNA đã biến tính từ agarose gel (sau khi được phân đoạn bằng điện di) lên màng lai bằng nylon hay nitrocellulose để lai với mẫu dò được đánh dấu đồng vị phóng xạ [ - 32P]dCTP hoặc digoxigenin-dUTP. Số bản sao (copy number). (1) Số các phân tử plasmid có trong một tế bào vi khuẩn. (2) Số lượng các bản sao của một gen trong hệ gen của một sinh vật. Sơ đồ phóng xạ tự ghi (autoradiogram). Hình ảnh sinh ra trên phim X-quang do sự phát xạ của các hạt phóng xạ. Tái tổ hợp (recombination). Quá trình mà trong đó nhiễm sắc thể hay phân tử DNA đứt ra rồi các phần đứt được nối lại theo một tổ hợp mới. Quá trình này có thể xảy ra trong tế bào sống (qua sự trao đổi chéo trong phân bào giảm nhiễm) hay trong ống nghiệm nhờ các enzyme cắt và nối DNA. Tạo dòng gen (gene cloning). Còn gọi là nhân dòng, tách dòng hay dòng hóa, là sự sản sinh nhiều bản sao của một phân tử DNA, thường là phân tử DNA tái tổ hợp trong plasmid vector, bằng cách sao chép phân tử đó trong một vật chủ thích hợp chẳng hạn vi khuẩn E. coli. Terminal transferase. Enzyme bổ sung các gốc nucleotide vào đầu 3’ của oligonucleotide hoặc polynucleotide. Tế bào khả biến (competent cell). Các tế bào vi khuẩn có khả năng tiếp nhận DNA ngoại lai trong quá trình biến nạp. Công nghệ DNA tái tổ hợp 198
  25. SimpoTh ểPDF biến Merge nạp (transformant) and Split Unregistered. Tế bào ho Versionặc sinh -v ậ nhận được gen của một sinh vật khác trong quá trình biến nạp và biểu hiện chức năng của gen đó ra kiểu hình. (polymorphism). hệ gen các kiểu cắt hạn chế (restriction patterns). Thể tái tổ hợp (recombinant). Các cá thể hoặc tế bào mang các tổ hợp gen khác với cha mẹ của chúng do các quá trình tái tổ hợp di truyền sinh ra. Thông tin di truyền (genetic information). Thông tin được lưu trữ trong các phân tử DNA của sinh vật ở dạng trình tự sắp xếp của bốn nucleotide ký hiệu là A, T, C và G đóng vai trò như những ”chữ cái” của ”ngôn ngữ” di truyền. Trong ngôn ngữ này, mỗi từ chỉ có ba chữ cái gọi là một bộ ba. Nghĩa của mỗi từ là một amino acid có mặt trên phân tử protein tương ứng. Mỗi ”câu” của ngôn ngữ di truyền là một gen chứa đựng thông tin di truyền để đảm nhiệm một chức năng trọn vẹn. Mỗi chức năng là một đặc tính sinh lý, hình thái hay cấu trúc của sự sống. Do cơ chế sao chép theo kiểu nửa bảo toàn của DNA mà thông tin di truyền được truyền chính xác từ thế hệ nọ sang thế hệ kia hầu như không thay đổi. Thư viện cDNA (cDNA library). Tập hợp các dòng DNA được tạo ra từ mRNA của một tế bào hoặc một mô cụ thể trong bacteriophage vector, đại diện cho thông tin di truyền mà các tế bào đó biểu hiện. Thư viện hệ gen (genomic library). Tập hợp tất cả các đoạn DNA được tạo ra từ phản ứng cắt hạn chế genome trong bacteriophage vector, đại diện được cho toàn bộ cho thông tin di truyền của một hệ gen. Trì hoãn gel (gel retardation). Phương pháp xác định điểm bám của protein trên các đoạn DNA, dựa vào độ di chuyển chậm của chúng so với DNA không bị protein bám trong các thí nghiệm điện di trên gel. Trình tự dẫn đầu (leader sequence). Một trong ba phần chủ yếu của một phân tử mRNA. Trình tự này nằm ở đầu 5’ của mRNA và mang thông tin để ribosome và các protein đặc hiệu nhận biết bắt đầu quá trình tổng hợp polypeptide, trình tự dẫn đầu không được dịch mã thành trình tự các amino acid. Công nghệ DNA tái tổ hợp 199
  26. SimpoTrình PDF tự Merge điều hòaand (regulatorySplit Unregistered sequence). Version Một - trình tự của DNA tham gia vào quá trình điều hòa của gen. Ví dụ: trình tự promoter hoặc operator. Trình tự khởi động (promoter). Trình tự nucleotide đặc hiệu nằm trong thành phần operon, có chức năng điều hòa hoạt động của operon, nơi RNA polymerase bám vào để bắt đầu quá trình phiên mã. Trình tự đặc trưng của promoter có khoảng 20-200 nitrogen base. Trình tự Shine-Dalgarno (Shine Dalgarno sequence, SD). Còn gọi là vùng liên kết ribosome (RBS), là một phần của trình tự nucleotide ở đầu 5’ của một mRNA prokaryote có thể kết hợp bổ sung cặp base với đầu 3’ của 16S rRNA, dùng làm tín hiệu cho sự khởi đầu dịch mã. Trình tự tăng cường (enhancer). Trình tự nucleotide dạng cis làm tăng cường độ phiên mã của promoter trong gen eukaryote. Nó có thể nằm cách promoter hàng ngàn cặp base và hoạt động theo cả hai hướng ở bất kỳ vị trí nào so với promoter. Ủ để gắn mồi (annealing). cách sử dụng các dNTP có trong môi trường để kéo dài primer nhờ sự xúc tác của enzyme Taq DNA polymerase (trong khuếch đại PCR) hoặc DNA polymerase I (trong tổng hợp cDNA). Ức chế amber (amber suppresser). codon . Vật chủ (host). Tế bào dùng để nhân các phân tử DNA lên nhiều lần. Vector. Là các phân tử DNA đ và biểu hiện gen, (E. coli hoặc nấm men). Có ba nhóm vector chính gồm: (1) Nhóm plasmid, (2) Nhóm phage/phagemid, và (3) Nhóm nhiễm sắc thể nhân tạo (artificial chromosome: BAC, YAC các . Công nghệ DNA tái tổ hợp 200
  27. SimpoVector PDF tạo Merge dòng and (cloning Split Unregistered vector). Phân Version tử DNA - mạch kép có khả năng tự sao chép trong tế bào vật chủ. Có thể gắn vào phân tử này một đoạn hoặc một vài đoạn DNA khác nguồn tạo nên phân tử DNA tái tổ hợp dùng để nhân dòng. Vector biểu hiện (expression vector). Phân tử DNA mạch kép có mang các tín hiệu cần thiết (promoter, terminator và vùng liên kết ribosome) cho sự biểu hiện của một khung đọc mở (gen) sẽ được nhân dòng và sản xuất protein tương ứng trong tế bào vật chủ. Vết tan (plaque). Vòng tròn trong suốt xuất hiện trên thảm đục của các vi khuẩn mọc trên môi trường thạch đặc, do sự tan vỡ lặp lại nhiều chu kỳ của các tế bào vi khuẩn bị bacteriophage xâm nhiễm và sinh tan. Virus. Phức hợp chứa nucleic acid (DNA hoặc RNA) nằm trong một vỏ bọc protein, có khả năng gây nhiễm và tái bản bên trong tế bào vật chủ đặc hiệu, tạo ra nhiều virus, lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác. Virus là dạng sống không có cấu trúc tế bào, có khả năng xâm nhập vào các tế bào sống xác định và chỉ sinh sản ở bên trong các tế bào đó. Giống như tất cả cá sinh vật khác, virus có bộ máy di truyền của riêng mình, mã hóa việc tổng hợp các hạt virus từ các chất có trong tế bào vật chủ. Như vậy, virus là những vật ký sinh nội bào. Virus phân bố ở khắp nơi trong tự nhiên, xâm nhập vào tất cả các nhóm sinh vật. Người ta đã biết khoảng 500 loại virus xâm nhập động vật máu nóng, 300 loại xâm nhập thực vật bậc cao. Một số khối u ung thư ở động vật và ở người có thể do virus. Virus tồn tại ở hai dạng: dạng nghỉ hay ngoại bào và dạng sinh sản hay nội bào. Kích thước của các hạt virus từ 15-350 nm, chiều dài của một số loại virus có thể đạt tới 2000 nm. Phần lớn virus chỉ nhìn thấy được qua kính hiển vi điển tử. Chất mang thông tin di truyền của virus là nucleic acid: DNA hoặc RNA. Vì vậy, có thể phân virus thành hai loại: loại mang DNA và loại mang RNA. Vị trí cos (cos site) hay đầu cos (cos end). Trình tự nucleotide được cắt ra để tạo thành các phần mở rộng sợi đơn, kết dính ở hai đầu cuối của các phân tử DNA mạch thẳng của một phage nào đó (ví dụ: phage λ). Vòng cặp tóc (hairpin loop). Vùng chuỗi đơn bổ sung tạo nếp gấp chứa các cặp base tạo thành xoắn kép, . Vùng cùng hướng (downtream). Đề cập đến vị trí của một đoạn trình tự nào đó nằm ở phía đầu 3’ của gen hoặc một đoạn gen quan tâm. Công nghệ DNA tái tổ hợp 201
  28. SimpoVùng PDF liên Merge kết ribosome and Split (ribosome Unregistered binding Version sites ,- RBS). Là trình tự nuleotide trên phân (xem trình tự Shine-Dalgarno). Vùng ngược hướng (upstream region). Vị trí của một trình tự nucleotide nào đó nằm ở phía đầu 5’ của phân tử DNA so với gen quan tâm. Vùng tạo dòng (multiple cloning sites, MCS) hay vùng đa nối (polylinker hay polycloning sites). số enzyme cắt hạn chế thông dụng, được thiết kế để chèn đoạn DNA ngoại lai vào đây. Western blot. Kỹ thuật chuyển protein tổng số đã được phân tách bằng điện di SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) lên màng nylon hoặc nitrocellulose để lai với kháng thể một đặc hiệu và sau đó là kháng thể hai có đánh dấu enzyme nhằm phát hiện protein kháng nguyên tương ứng của nó. YAC (Yeast artificial chromosome). Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men, được dùng làm vector để tạo dòng những đoạn DNA có kích thước rất lớn trong nấm men. Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Ban Từ điển-NXB Khoa học và Kỹ thuật. 2002. Từ điển Bách khoa Sinh học. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 2. Lawrence E. 1995. Henderson’s Dictionary of Biological Terms. 7th ed. Longman Group Ltd. Singapore. 3. Nill K. 2002. Glossary of Biotechnology Term. 3rd ed. CRC Press LLC, USA. 4. Old RW and Primrose SB. 1994. Principles of Gene Manipulation. Blackwell Scientific Publications, Osney Mead, Oxford, UK. 5. Singleton P and Sainsbury D. 2001. Dictionary of Microbiology and Molecular Biology. 3rd ed. John Wiley & Sons, Ltd. UK. Công nghệ DNA tái tổ hợp 202
  29. Simpo PDF Merge and SplitLời Unregistered nói đầu Version - Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật gen) là một bộ phận quan trọng và là công nghệ chìa khóa (key technology) của lĩnh vực công nghệ sinh học. Công nghệ DNA tái tổ hợp được ra đời trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử và hiện nay đang đóng vai trò cách mạng đối với sự phát triển của sinh học cũng như cải tạo sinh giới. Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã cho phép các nhà công nghệ sinh học phân lập và khuếch đại một gen đơn từ genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác. Các kỹ thuật này còn được gọi là tạo dòng gen do nó có thể sản xuất ra một số lượng lớn các gen xác định. Bên cạnh các giáo trình như: sinh học phân tử, nhập môn công nghệ sinh học, công nghệ tế bào, công nghệ chuyển gen giáo trình công nghệ DNA tái tổ hợp sẽ giúp sinh viên tiếp cận thêm một lĩnh vực khác của công nghệ sinh học thông qua việc cung cấp những kiến thức cơ bản theo hướng tạo dòng và biểu hiện gen như sau: - Các enzyme dùng trong tạo dòng phân tử. - Các hệ thống vector. - Một số kỹ thuật cơ bản trong tạo dòng gen: điện di, PCR - Tạo dòng và xây dựng các thư viện genomic DNA và cDNA. - Biểu hiện các gen được tạo dòng trong E. coli. Do giáo trình này mới được xuất bản lần đầu tiên, hơn nữa lĩnh vực công nghệ DNA tái tổ hợp lại rất phức tạp, nên khó tránh khỏi thiếu sót hoặc chưa đáp ứng được yêu cầu bạn đọc. Vì thế, chúng tôi rất mong nhận được nhiều ý kiến đóng góp để lần xuất bản sau được hoàn thiện hơn. Chúng tôi chân thành cảm ơn Quỹ Nâng cao chất lượng-Dự án Giáo dục đại học đã hỗ trợ chúng tôi biên soạn giáo trình này, PGS. TS. Lê Trần Bình đã đọc bản thảo và góp nhiều ý kiến quý báu. Các tác giả Công nghệ DNA tái tổ hợp 1
  30. ChươngSimpo PDF 1 Merge and Split Unregistered Version - Các enzyme dùng trong tạo dòng phân tử các sinh vật prokaryote, của bacteriophage để chúng ở . , người ta đã tìm thấy hơn 9 từ khoảng 250 chủng vi sinh vật. Các enzyme hạn chế có ba loại (type): I, II và III. Các enzyme được dùng phổ biến hiện nay thuộc type II, có cơ chế tác động đơn giản nhất. Đây là các nuclease cắt ở một vị trí đặc hiệu nằm bên trong sợi DNA (chứ không phân hủy DNA từ hai đầu), nên được gọi là endonuclease. Tên gọi đầy đủ của chúng là các restriction endonuclease type II, hay được gọi đơn giản là enzyme hạn chế (restriction enzyme, RE). 1. Các enzyme hạn chế type II Cách gọi tên các enzyme hạn chế dựa trên các qui ước quốc tế. Tên chi và tên loài của sinh vật, mà ở đó tìm thấy enzyme, được dùng để đặt cho phần đầu của tên enzyme (viết nghiêng) bao gồm: chữ thứ nhất của tên chi và hai chữ đầu của tên loài. Ví dụ: enzyme được tách chiết từ vi khuẩn Escherichia coli thì có tên là Eco, còn enzyme được tách chiết từ vi khuẩn Bacillus globigii thì viết là Bgl Ngoài ra, tên gọi enzyme hạn chế còn được bổ sung thêm phần sau (viết thẳng), tùy thuộc vào chủng vi khuẩn liên quan và tùy thuộc vào sự có mặt hay không của các yếu tố ngoài nhiễm sắc thể. Ví dụ: RI trong enzyme EcoRI có nghĩa như sau: R là viết tắt của chủng RY13, I là bậc xác định đầu tiên trong vi khuẩn (first identified order in bacterium). Giá trị của enzyme hạn chế là ở tính đặc hiệu của chúng. riêng biệt bao - : enzyme Eco hexanucleotide (6 nucleotide): Công nghệ DNA tái tổ hợp 2
  31. Simpo 5’ GAATTC 3’PDF Merge and Eco SplitRI Unregistered5’ G Version -AATTC 3’ + 3’ CTTAAG 5’ 3’ CTTAA G 5’ Eco (protruding) 5’ khác (ví dụ: Pst 5’. Trong khi đó, m : SmaI) lại 1.1). Stt Tên enzyme 5’ G AATTC 3’ 5’ G AATTC 3’ 1 EcoRI 3’ CTTAA G 5’ 3’ CTTAA G 5’ 5’ A AGCTT 3’ 5’ A AGCTT 3’ 2 HindIII 3’ TTCGA A 5’ 3’ TTCGA A 5’ 5’ CTGCA G 3’ 5’ CTGCA G 3’ 3 PstI 3’ G ACGTC 5’ 3’ G ACGTC 5’ 5’ GTT AAC 3’ 5’ GTT AAC 3’ 4 HpaI 3’ CAA TTG 5’ 3’ CAA TTG 5’ 5’ C CGG 3’ 5’ C CGG 3’ 5 HpaII 3’ GGC C 5’ 3’ GGC C 5’ 5’ GG CC 3’ 5’ GG CC 3’ 6 HaeIII 3’ CC GG 5’ 3’ CC GG 5’ 5’ G GATCC 3’ 5’ G GATCC 3’ 7 BamHI 3’ CCTAG G 5’ 3’ CCTAG G 5’ 5’ A GATCT 3’ 5’ A GATCT 3’ 8 BglII 3’ TCTAG A 5’ 3’ TCTAG A 5’ 5’ CCC GGG 3’ 5’ CCC GGG 3’ 9 SmaI 3’ GGG CCC 5’ 3’ GGG CCC 5’ 5’ C CCGGG 3’ 5’ C CCGGG 3’ 10 XmaI 3’ GGGCC C 5’ 3’ GGGCC C 5’ Công nghệ DNA tái tổ hợp 3
  32. SimpoVới PDF bốn Mergeloại nitrogen and Split base Unregisteredtrong phân tử VersionDNA và -giả thiết rằng trình tự sắp xếp của chúng là ngẫu nhiên, thì tần số mong đợi (kỳ vọng) của bất kỳ đoạn trình tự xác định nào, theo tính toán sẽ là 4n, n ở đây là chiều dài của đoạn nhận biết. Từ đó, có thể thấy rằng với các đoạn có bốn nucleotide thì cứ cách 256 cặp base chúng lặp lại một lần, các đoạn sáu nucleotide thì cách 4096 cặp base mới lặp lại. Tất nhiên, các giá trị này có thể dao động rất lớn, nhưng nói chung chiều dài của các đoạn sinh ra đều gần với các giá trị tính toán. Chẳng hạn, một enzyme nhận biết đoạn trình tự bốn nucleotide sẽ sản sinh ra các đoạn ngắn hơn so với đoạn sáu nucleotide. 2 được - C (cohesive ends), còn gọi là đầu lồi hay đầu so le. Ví dụ: đầu dính được tạo ra nhờ PstI 5’ CTGCAG 3’ PstI 5’ CTGCA G 3’ + 3’ GACGTC 5’ 3’ G ACGTC 5’ - C (blunt ends), còn gọi là đầu thô. Ví dụ: đầu bằng được tạo ra nhờ HaeIII 5’ GGCC 3’ HaeIII 5’ GG CC 3’ + 3’ CCGG 5’ 3’ CC GG 5’ - DNA : + G vào đầu bằng . (đoạn nối) bằng cách t trình tự o có từ 10-20 nucleotide như sau: 5’ NN GAATTC NN 3’ 3’ NN CTTAAG NN 5’ + D . (xem chương 6). Công nghệ DNA tái tổ hợp 4
  33. 3.Simpo Isochizomer PDF Merge and Split Unregistered Version - 1.1 (4 nucleotide) . : - Mbo Sau3AI cùng : 5’ GATC 3’ 3’ CTAG 5’ - Bam trình tự: 5’ GGATCC 3’ 3’ CCTAGG 5’ khác (hybrid) : Sal (G TCGAC) XhoI cắt trình tự (C TCGAG) Sal XhoI: 5’ G TCGAG 3’ 5’ GTCGAG 3’ + 3’ CAGCT C 5’ 3’ CAGCTC 5’ 4. Methyl hóa mục đích (CH3 . : Eco : GAATTC methyl hóa GAATTC* CTTAAG CTTAAG * Công nghệ DNA tái tổ hợp 5
  34. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - , những bởi RE . E. coli : dam dcm. - dam (DNA adenine methylase) 6 5’ GmeATC 3’. Nhưng DNA của 6 . - dcm (DNA cystosine methylase) 5 bên 5’ CmeCAGG 3’ 5’ CmeCTGG 3’. Enzyme chủ yếu dcm EcoRII, enzyme Bst Eco BstNI cho Eco E. coli dcm. 5 5.1. Các loại đệm dùng trong phản ứng cắt DNA : - (H). . - (M). . - (L). . Công nghệ DNA tái tổ hợp 6
  35. Simpo PDF Merge and Split Unregistered( Version - 4o - -20o . 1.2 NaCl Tris.HCl pH 7,5 MgCl2 Dithiothreitol (mM) (mM) (mM) (mM) 0 10 10 1 50 10 10 1 Cao 100 50 10 1 Riêng enzyme Sma , bao gồm: 20 mM KCl, 10 mM Tris.Cl (pH 8), 10 mM MgCl2, và 1 mM dithiothreitol. 5.2 0,2-1 g DNA/20 L phản ứng : 17 L. 2 L phản ứng ( của RE (vortex). Ví dụ: BstXI 10 (H) XbaI : 10 (H) EcoRI : 10 (H) sung 1 unit/μL . Một unit ( , ký hiệu là u) 1 20 . : BstXI : 1- /50oC Công nghệ DNA tái tổ hợp 7
  36. Simpo PDF XbaMergeI and Split/37o CUnregistered Version - EcoRI /37oC 10 mM. - 1 L ( - - . - hai một . - sẽ . - -20oC (hoặc -80oC (ice bath). II. Các enzyme trùng hợp 1. DNA polymerase (DNA-dependent DNA polymerase) DNA polymerase trong điều kiện in vitro. 1. E. coli n . enzyme . DNA polymerase I E. coli : - Hoạt tính polymerase 5’ 3’. E. coli xúc tác cho sự tổng hợp DNA theo chiều 5’ nucleoti - . Công nghệ DNA tái tổ hợp 8
  37. Simpo- Hoạt PDF tính Merge exonuclease and Split 3’ Unregistered5’. Version - coli cắt các chuỗi nucleotide ở các đầu tự do của DNA, xúc tác cho sự thoái biến bậc thang từ đầu 3’ của cả DNA sợi đôi và sợi đơn khi không có dNTPs. Trong trường hợp có dNTPs, hoạt tính exonuclease trên sợi đôi sẽ bị ức chế bởi hoạt tính polymerase. Trong quá trình tổng hợp DNA, hoạt tính exonuclease thực hiện chức năng đọc sửa (proofreading) bằng cách cắt bỏ những nucleotide lắp ráp sai. - nuclease 5’ 3’. E. coli . Cơ chất 5’ 3’ DNA enzyme DNA DNA polymerase DNAOH + ndNTP DNA-(pdN)n + nPPi 2+ Mg mang nhóm 3’-OH 3’ 5’ DNA sợi đơn hoặc sợi enzyme 5’ đôi có đầu 3’-OH Exonuclease dsDNA ho pNOH Mg2+ 5’ 3’ hoặc thể enzyme 5’ 5’ lai RNA:DNA Exonuclease dsDNA pNOH + pN(pN)npNOH + ssDNA Mg2+ - làm mẫu dò . . . 1. E. coli 3’ 5’ Công nghệ DNA tái tổ hợp 9
  38. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - ). C 5’ 3’ DNA enzyme đơn/ DNA polymerase DNAOH + ndNTP DNA-(pdN)n + nPPi 2+ Mg nhóm 3’-OH tự do 3’ 5’ DNA sợi đơn hoặc sợi enzyme 5’ đôi thoái biến từ đầu Exonuclease pNOH 2+ Mg 3’-OH tự do. exonuclease trên DNA sợi đôi polymerase 5’ 3’ - Ứng dụng chính + Làm đầy đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra. [ - 32P]dNTPs để làm đầy đầu khuyết 3’. 3’. Đầu tiên, hoạt tính exonuclease 3’ 5’ loại bỏ đầu lồi 3’ để tạo ra đầu khuyết 3’. Sau đó, nhờ sự có mặt ở nồng độ cao của một tiền chất được đánh dấu đồng vị phóng xạ, sự thoái biến bậc thang được cân bằng do sự hợp nhất của các dNTP ở đầu 3’. . + Tổng hợp DNA sợi đôi từ các khuôn mẫu sợi đơn trong phát sinh đột biến in vitro. 1. 4 (T4-infected E. coli) E. coli. nh polymerase Công nghệ DNA tái tổ hợp 10
  39. 5’Simpo 3’ PDFexo Mergenuclease and 3’Split Unregistered5’ Version - phải (primer) DNA polymerase phage T . C 5’ 3’ DNA enzyme DNA polymerase DNAOH + ndNTP DNA-(pdN)n + nPPi 2+ Mg 3’-OH 3’ 5’ Hoạt tính trên DNA sợi đơn enzyme 5’ hơn trên DNA sợi đôi một Exonuclease ssDNA pNOH 2+ Mg cách đáng kể. exonuclease polymerase 5’ 3’ - Ứng dụng chính + Làm đầy hoặc đánh dấu đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra. 3’, tương tự như ứng dụng của đoạn Klenow. + Đánh dấu các đoạn DNA để làm mẫu dò. + Biến đổi đầu sole của DNA sợi đôi thành đầu bằng. 1.4. Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus) Thermus aquaticus in vitro (PCR) (xem chương 3). Taq pol thay thế cho DNA polymerase I của E. coli do có khả năng chịu nhiệt cao phù hợp với điều kiện phản ứng của PCR, và nó có thể tổng hợp một sợi DNA dài 1 kb trong vòng 30 giây ở 72oC. Công nghệ DNA tái tổ hợp 11
  40. Simpo- Một PDF trong Merge những and hạn Split chế Unregistered của Taq pol Version là sự chính - xác không cao trong quá trình sao chép của nó do bị mất cơ chế đọc sửa (hoạt tính exonuclease 3’ 5’). Enzyme Taq pol thương mại có tỷ lệ sao chép lỗi 1/10.000 nucleotide, và có thể tạo ra 16% sản phẩm PCR dài 1 kb bị đột biến trong phản ứng khuếch đại. Mặc dù có nhược điểm trên, Taq pol vẫn có thể được dùng trong các thí nghiệm đòi hỏi một trình tự di truyền chính xác (như trong tạo dòng phân tử). Tuy nhiên, kết quả cho ra một vector mang đoạn chèn (sản phẩm PCR) cần phải được kiểm tra bằng sequencing. - Ưu điểm của Taq pol là sản xuất các đoạn gen mang hai đầu lồi A. Điều này đặc biệt hữu ích trong “TA cloning” là kỹ thuật mà vector (plasmid) được sử dụng đã có sẵn hai đầu lồi T bổ sung với hai đầu lồi A của sản phẩm PCR, nhờ đó đã làm tăng hiệu quả của phản ứng gắn. Cơ chất 5’ 3’ đơn/ enzyme DNA DNA polymerase DNAOH + ndNTP DNA-(pdN)n + nPPi 2+ Mg 3’-OH Ngoài Taq pol, nhiều DNA polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với các chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Chẳng hạn: Pfu DNA polymerase (Pfu pol) được tách chiết từ Pyrococcus furiosus, thường được dùng thay cho, hoặc kết hợp, với Taq pol. Enzyme này ổn nhiệt hơn và có khả năng đọc sửa, vì thế cho tỷ lệ sao chép lỗi thấp. Hoặc Tth DNA polymerase (Tth pol), được tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn mẫu và ion Mn2+; nhưng nếu có sự hiện diện của DNA khuôn mẫu và ion Mg2+, thì Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. Enzyme này cho phép khuếch đại khuôn mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA. 2. RNA polymerase (DNA-dependent RNA polymerase) (Bacteriophage SP6-infected Salmonella typhimurium 3-infected E. coli) Công nghệ DNA tái tổ hợp 12
  41. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - . Quá trình tổng hợp này không cần mồi. 5’ 3’ enzyme promoter của bacteriophage RNA polymerase dsDNA + nrNTP RNA + PPi 2+ Mg SP6, T3 hoặc T7 - Ứng dụng chính + Sản xuất RNA để làm mẫu dò. + Xác định trình tự của một phân tử DNA được tạo dòng trong một vector có mang promoter đặc trưng cho bacteriophage SP6, T7 hoặc T3. + Sản xuất một lượng lớn RNA từ một phân tử DNA được tạo dòng để nghiên cứu về cấu trúc, điều hòa và các mối tương tác của phiên bản RNA. 3. Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase, RNA-dependent DNA polymerase) : AMV (avian myeloblastosis virus), Mo-MLV (m (retrovirus: : - 5’ 3’. Tổng hợp DNA theo chiều 5’ (sợi đơn hoặc sợi đôi): C 5’ 3’ enzyme DNA polymerase DNAOH + ndNTP DNA-(pdN)n + nPPi 2+ Mg một enzyme nhóm 3’-OH : RNAOH + ndNTP RNA-(pdN)n + nPPi Mg2+ Công nghệ DNA tái tổ hợp 13
  42. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - - . nuclease 5’ 3’ . Cơ chất RNase H 5’ 3’ 5’ 3’ RNA:DNA (5’ 3’ 5’ RNA pUpCpCpGpUpA enzyme pUpC exoribonuclease) DNA 3’ ApGpGpCpApT 5’ 3’ ApGpGpCpApT 5’ 5’ 3’ + pCpGpUpA (xem chương 6). . 4. Terminal transferase (Tuyến ức của bê) - . Phản ứng gắn này là ngẫu nhiên, do đó thành phần nucleotide của đầu lồi phụ thuộc vào nồng độ của bốn loại nucleotide có trong phản ứng. Terminal enzyme transferase - : ssDNAOH + ndNTP DNA-(pdN)n + nPPi 2+ 2+ Mg hoặc Mn DNA 3’-OH - Ứng dụng chính Công nghệ DNA tái tổ hợp 14
  43. Simpo+ Thêm PDF đuôiMerge đồng and trùng Split hợp Unregistered (homopolymer) Version để tạo - ra đầu so le cho phân tử DNA dùng trong tạo dòng (xem chương 6). + Đánh dấu đầu 3’-OH của DNA trong kỹ thuật xác định trình tự gen theo Maxam và Gilbert. III. Các enzyme gắn Enzyme l 4 xâm nhiễm trong E. coli enzyme này . 1. Bacteriophage T4 DNA ligase (Bacteriophage T4-infected E. coli) - 5’-PO4 của một phân tử DNA khác. DNA ligase có tác dụng cho cả trường hợp đầu so le lẫn đầu bằng, tuy nhiên đối với đầu bằng enzyme đòi hỏi nồng độ cao hơn và điều kiện phản ứng cũng khác. Cơ chất 5’ 3’ Gắn các đầu dính pApCpGOH pApApTpTpCpGpT (a) Các phân tử DNA hoặc điểm đứt (nick) sợi đôi có đầu dính bổ 3’ TpGpCpTpTpApAp HOGpCpAp 5’ sung enzyme ATP, Mg2+ (b) nicked: DNA 5’ 3’ pApCpGpApApTpTpCpGpT 3’ TpGpCpTpTpApApGpCpAp 5’ 5’ 3’ Gắn các đầu bằng pCpGpAOH pCpGpTpA Nồng độ cao của các DNA sợi đôi đầu bằng 3’ GpCpTp OHGpCpApTp 5’ mang nhóm 5’-PO4 và enzyme ATP, Mg2+ 3’-OH 5’ 3’ pCpGpApCpGpTpA 3’ GpCpTpGpCpApTp 5’ Công nghệ DNA tái tổ hợp 15
  44. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - 2. Bacteriophage T4 RNA ligase (Bacteriophage T4-infected E. coli) cộng 5’-PO4 3’-OH của DNA sợi đơn hoặc RNA. Do cơ chất thích hợp cho enzyme này là các phân tử nhỏ nên nó thường được dùng để đánh dấu đầu 3’ của các phân tử RNA sử dụng làm mẫu dò. C RNA ligase DNA hoặc RNA RNA hoặc DNA DNA sợi đơn và RNA 5’ 3’ 5’ 3’ pApCpGOH pApApTpTpC OH enzyme ATP 5’ 3’ pApCpGpApApTpTpC OH 3. Bacteriophage T4 polynucleotide kinase (Bacteriophage T4-infected E. coli) Enzyme bacteriophage T4 polynucleotide kinase xúc tác chuyển nhóm γ-phosphate của ATP tới đầu 5’ của DNA hoặc RNA. Hai loại phản ứng thường có thể xảy ra là phản ứng thuận và phản ứng trao đổi. Trong phản ứng thuận, nhóm γ-phosphate được chuyển tới đầu 5’ của DNA đã được dephosphoryl hóa (mất nhóm phosphate). Trong phản ứng trao đổi, khi có một ADP thừa, enzyme sẽ chuyển nhóm 5’ phosphate từ DNA đã được phosphoryl hóa tới ADP, DNA sau đó sẽ được phosphoryl hóa trở lại bằng cách nhận một nhóm γ-phosphate đã được đánh dấu đồng vị phóng xạ từ một phân tử [γ-32P]ATP. - Ứng dụng chính + Đánh dấu phóng xạ đầu 5’ của DNA để phân tích trình tự bằng phương pháp Maxam và Gilbert (1977), dùng làm mẫu dò trong các kỹ thuật lai phân tử (xem chương 5). Công nghệ DNA tái tổ hợp 16
  45. Simpo+ Phosphoryl PDF Merge hóa and các Split đoạn Unregistered nối (linker) vàVersion các đoạn - DNA không có nhóm 5’ phosphate để chuẩn bị cho phản ứng gắn trong phương pháp tạo dòng. Phản ứng thuận enzyme 5’ 5’ sợi đơn mang đầu DNAOH hoặc RNAOH [γ-32P]ATP dithiothreitol 2+ 5’-OH, RNA mang Mg đầu 5’-OH 5’ 32 5’ 32 [ P]DNA hoặc [ P]RNA +ADP Phản ứng trao đổi DNA sợi đơn mang enzyme 5’ 3’ đầu 5’ phosphate pCpGpC + ADP thừa [γ-32P]ATP dithiothreitol Mg2+ 5’ 3’ pCpGpC + ADP + ATP 4. Alkaline phosphatase (E. coli và ruột bê) Cả hai enzyme alkaline của vi khuẩn (bacteria alkaline phosphatase, BAP) và ruột bê (calf intestinal alkaline phosphatase, CIP) đều xúc tác loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi DNA và RNA. C Phosphatase enzyme 5’ 5’ 5’ 5’ sợi đơn và RNA pDNA hoặc pRNA OHDNA hoặc OHRNA - Ứng dụng chính + Loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi DNA hoặc RNA trước khi đánh dấu đầu 5’ bằng 32P. Công nghệ DNA tái tổ hợp 17
  46. Simpo+ Loại PDF bỏ Merge nhóm and5’ phosphate Split Unregistered khỏi các đoạn Version DNA - để ngăn cản sự tự gắn. Trong kỹ thuật tạo dòng, khi một vector được mở vòng DNA bằng một RE rồi sau đó được loại bỏ nhóm 5’ phosphate thì nó không thể tự gắn lại (tự tái tạo lại vòng). Chỉ khi có đoạn DNA ngoại lai mang các đầu 5’ phosphate cần thiết được đưa vào thì phản ứng gắn giữa vector và DNA ngoại lai mới xảy ra. IV. Các enzyme phân cắt Là nhóm các enzyme xúc tác thủy phân liên kết phosphodiester trong phân tử DNA hoặc RNA, bao gồm các endonuclease (cắt bên trong phân tử nucleic acid) và exonuclease (cắt bên ngoài phân tử nucleic acid). Các RE cũng là các endonuclease, nhưng chúng có tính đặc hiệu rất cao cho từng trình tự 4 hoặc 6 nucleotide. Dưới đây là các nuclease chính thường được sử dụng: 1. Deoxyribonuclease I (DNase I) (Tụy bò) DNase I xúc tác thủy phân DNA sợi đơn hoặc sợi đôi ở các liên kết phosphodiester nằm bên cạnh các pyrimidine nucleotide, tạo ra các oligonucleotide và các oligonucleotide có đầu tận cùng 5' monophosphate. Khi có mặt Mg2+, DNase I tác dụng độc lập trên mỗi sợi DNA, và các vị trí cắt được phân bố ngẫu nhiên. 5’ p p p p p p – 3’ Mg2+ OH 3’OH – p p p p p p p 5’ Khi có mặt Mn2+, DNase I sẽ cắt cả hai sợi DNA gần như ở cùng một vị trí để tạo ra các đoạn DNA đầu bằng hoặc đầu lồi nhưng chỉ nhô ra một hoặc hai nucleotide. 5’ p p p 2+ Mn p p Công nghệ DNA tái tổ hợp 18
  47. Simpo- Ứng PDF dụng Merge chính and Split Unregistered Version - + Tạo ra các điểm đứt (nick) trên DNA sợi đôi để đánh dấu mẫu dò đồng vị phóng xạ bằng phương pháp dịch chuyển điểm đứt. + Tạo ra các dòng ngẫu nhiên để phân tích trình tự trong bacteriophage M13 vector. + Phân tích phức hợp protein:DNA (DNase footprinting). + Loại bỏ DNA trong các phân đoạn RNA hay protein. 2. Nuclease S1 (Aspergillus oryzae) 5’ mono . DNA . Cơ chất Nuclease DNA sợi đơn hoặc enzyme đặc hiệu 5’ 5’ RNA, hoạt tính trên DNA sợi đơn hoặc RNA pdN hoặc prN sợi đơn DNA lớn hơn trên RNA DNA sợi đôi bị đứt (nick) Zn2+ enzyme (pH 4,5) (một lượng vừa đủ) + - Ứng dụng chính :RNA. Công nghệ DNA tái tổ hợp 19
  48. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - . + . Một enzyme có hoạt tính tương tự nuclease S1 là mung-bean nuclease (endonuclease) được tách chiết từ mầm đậu xanh (Phaseolus aureus). 3. Exonuclease III (Exo III) (E. coli) Exo III xúc tác loại bỏ các 5’ mononucleotide từ đầu 3’ OH của DNA sợi đôi (DNA mạch thẳng hoặc mạch vòng chứa các điểm đứt hoặc lỗ hổng). Hoạt tính enzyme cho kết quả tạo thành các vùng sợi đơn dài trong DNA sợi đôi. Enzyme này có 3 hoạt tính khác nhau: endonuclease đặc hiệu cho apurinic DNA, RNase H và 3’ phosphatase (loại bỏ đầu 3’ phosphate nhưng không cắt các liên kết phosphodiester bên trong). Exo III không cắt các DNA sợi đơn hoặc DNA sợi đôi có đầu lồi 3’. Cơ chất 3’ exonuclease 5’ P 3’ OH - Đầu tận cùng 3’-OH 3’ OH 5’ P của DNA sợi đôi có 2+ Mg enzyme đầu bằng hoặc đầu 3’-OH ở điểm đứt 5’ P 3’ OH trong DNA sợi đôi 3’ OH 5’ P + 5’ pNOH 3’ phosphatase 5’ 3’ P enzyme 5’ 3’ OH DNA sợi đôi hoặc sợi 3’ P 5’ 3’ OH 5’ đơn có đầu 3’ + 2Pi phosphate - Ứng dụng chính Công nghệ DNA tái tổ hợp 20
  49. Simpo+ Tạo PDF ra Mergecác cấu and trúc Split sợi đơn Unregistered ở một số vùng Version trên phân- tử DNA dùng làm cơ chất cho đoạn Klenow của DNA polymerase I (để sản xuất mẫu dò đặc trưng cho từng sợi). + Tạo ra các đột biến khuyết đoạn (deletion) tại các trình tự tận cùng của DNA sợi đôi mạch thẳng. Phản ứng này thường phối hợp với mung- bean nuclease hoặc nuclease S1. Một exonuclease tương tự là nuclease BAL31, có hoạt tính exonuclease 5’ 3’ và 3’ 5’, có khả năng tạo các DNA sợi đôi đầu bằng mà không cần sự hiện diện của nuclease S1. 4. Ribonuclease (RNase A) (Tụy bò) Enzyme xúc tác thủy phân RNA thành các đoạn nhỏ hơn. RNase A có hoạt tính rất mạnh, hiện diện ở mọi nơi và rất bền vững (không bị mất hoạt tính khi bị xử lý ở 90 C trong 1 giờ). RNase A cắt liên kết phosphodiester nằm ngay sau một pyrimidine của một RNA sợi đơn. 5’ p Ap Gp Gp Cp Cp Gp Ap Ap Gp Up Gp Cp Ap Gp G 3’ enzyme 5’ p Ap Gp Gp Cp + Cp + Gp Ap Ap Gp Up + Gp Cp + Ap Gp G 3’ - Ứng dụng chính + Loại bỏ RNA trong các chế phẩm DNA hay protein. + Loại bỏ các vùng không bắt cặp trên RNA trong thể lai RNA:DNA. 5. RNase H Enzyme RNase H là một loại ribonuclease có khả năng cắt liên kết 3’- O-P của RNA trong sợi đôi của thể lai DNA:RNA để tạo ra các sản phẩm có đầu tận cùng 3’-OH và 5’-PO4. RNase H là một endonuclease không đặc Công nghệ DNA tái tổ hợp 21
  50. hiệuSimpo, xúc PDFtác cắt Merge RNA andthông Split qua Unregisteredcơ chế thủy phân Version nhờ một - ion kim loại hóa trị 2 liên kết với enzyme. Trong tạo dòng phân tử, RNase H xúc tác cắt đặc hiệu RNA trong thể lại RNA:DNA mà không cắt DNA hoặc RNA không ở trong thể lai, enzyme này thường được dùng để phá hủy khuôn mẫu RNA sau khi tổng hợp sợi cDNA thứ nhất bằng phiên mã ngược, để tiếp tục tổng hợp sợi cDNA thứ hai tạo thành một sợi đôi cDNA. - ; . Nhờ . - Ứng dụng chính + -loops. + protein hiệu . /đọc thêm 1. Hồ Huỳnh Thùy Dương. 1998. Sinh học phân tử. NXB Giáo dục, Hà Nội. 2. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. 2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA. Công nghệ DNA tái tổ hợp 22
  51. Simpo3. BrownPDF Merge TA. 2001 and. SplitGene Unregistered Cloning-An Introduction. Version - ed. Blackwell Science, Oxford, UK. 4. Glick BR and Pasternak JJ. 2003. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. 3rd ed. ASM Press, USA. 5. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 1989. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. Cold Spring Habor Laboratory Press, USA. 6. Ohman DE. 1989. Experiments in Gene Manipulation. Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, USA. 7. Primrose SB, Twyman R and Old RW. 2001. Principles of Gene Manipulation. 6th ed. Blackwell Science, Oxford, UK. Công nghệ DNA tái tổ hợp 23
  52. ChươngSimpo PDF 3 Merge and Split Unregistered Version - Kh in vitro chuỗi polymerase (PCR) PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bư (xem chương 1) và kỹ thuật Southern blot (xem chương 5). kéo dài in vitro hiệu trong thiết bị điều nhiệt tuần hoàn (thermocycler) còn gọi là máy PCR (Hình 3.1) - đ dạng hiệu 20 nucleotide. Hình 3.1. Thiết bị điều nhiệt tuần hoàn I. Nguyên tắc của PCR Taq polymerase (xem chương 1) là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus 49
  53. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - 3’- 5’-3 ). Nguyên tắc của PCR được trình bày trong hình 3.2 và 3.3. T DNA polymerase (gọi tắt là Taq pol) bắt đ tổng hợp (synthetic oligonucleotide) có khoảng 10-20 nucleotide hoặc hơn. Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng đ - , qua đó từ 10-6 g DNA ban đầu có thể khuếch đại (amplification) lên tới trên 1 g : - Gây biến tính (denaturation) ở 90-95oC Trong giai đoạn biến tính, phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single strands). Tất cả các phản ứng enzyme trong giai đoạn này đều bị dừng lại (ví dụ: phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trước đó). - Gắn mồi (annealing) ở 40-65oC Trong giai đoạn này các primer gắn vào các vị trí có trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu. Các primer bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion được tạo thành và bị đứt gãy liên tục giữa primer sợi đơn và DNA khuôn mẫu sợi đơn. Các liên kết ion ổn định hơ đoạn nhỏ (các primer đ ) và trên các đ đôi đó (khuôn mẫu và primer) Taq pol có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu. Ở giai đoạn này phạm vi nhiệt độ được sử dụng có thể rất rộng tùy thuộc vào trình tự nucleotide của primer, thông thường khoảng 55oC, nhưng có khi chỉ 35oC hoặc đôi lúc lên đến 68oC. - Kéo dài phân tử (extension) ở 70-72oC. 50
  54. SimpoĐây PDF là khoảng Merge nhiệt and độ Split tối Unregisteredthích cho Taq polVersion tiến hành - tổng hợp DNA bằng cách bổ sung các dNTP bắt đầu từ các vị trí có primer theo chiều 5’ 3’. Các primer mạnh hơ . Các primer ở các vị trí không bắt cặp chính xác lại bị rời ra (do nhiệt đ . Gen đích Khuếch đại theo hàm mũ Chu kỳ 35 DNA khuôn mẫu 2 3 4 36 2 = 4 2 = 8 2 = 16 2 = 68 tỷ bản sao bản sao bản sao bản sao Hình 3.2. Sơ đ phản ứng chuỗi polymerase Biến tính (~900C) o Gắn mồi (~50 C) Kéo dài phân tử (~70oC) Chu kỳ 1 Chu kỳ 2 Chu kỳ 3 Chu kỳ 35 Hình 3.3. Các chu kỳ của kỹ thuật PCR 51
  55. Simpo PDF Merge and thông Split dụngUnregistered Version - . Trong (standard PCR), DNA Taq pol 4 loại deoxyribonucleotide (Hình 3.4). PA DNA khuôn mẫu Biến tính Taq polymerase PB (PA) và (PB) là các primer đặc hiệu Hình 3.4. Sơ đồ kỹ thuật PCR chuẩn (anchored PCR), kỹ thuật này yêu cầu chỉ cần biết trình tự nucleotide ở một đầu của khuôn mẫu và gắn một đuôi đồng trùng hợp nhân tạo (ví dụ: dA) kia (chưa biết trình tự). Sau đó đoạn oligo(dT) (Hình 3.5). (inverse PCR), đ các với đoạn hạn chế nhờ enzyme DNA ligase đoạn hai p đã 3.6). II. Quy trình PCR - Phân tử DNA có chứa đoạn DNA cần khuếch đại - 2 primer (F và R) 52
  56. Simpo- Taq PDF pol Merge and Split Unregistered Version - - 4 loại dNTP - Đệm và các muối khoáng X N1 N 5’ 2 3’ 3’ 5’ DNA khuôn mẫu X: trình tự đã biết; N và N : trình tự chưa biết 1 2 X N1 N2 A Khuếch đại PCR bằng primer đặc hiệu của trình tự đã biết (PX) và primer đặc hiệu của chuỗi neo (PA) X N1 N2 PA P x A Hình 3.5. Sơ đồ kỹ thuật PCR mỏ neo 2. Thực hiện phản ứng a : eppendorf tube (E-tube) loại 0,5 mL, trộn đều các thành phần sau: Đệm 10 PCR 4,5 L Hỗn h ) 4 L Primer-F (10 pmol/ L) 2,5 L Primer-R (10 pmol/ L) 2,5 L Thêm H2 40 L 53
  57. Simpo PDF Merge and Split UnregisteredTaq pol: Version - 10 2 L Taq pol (5 units/ L) 1 L Thêm H2 20 L DNA đã biết Enzyme hạn chế Enzyme hạn chế X Y 5’ 3’ 3’ 5’ Tạo vòng bằng DNA ligase PCR X Y 3.6. Sơ đồ ược 2.3. Bổ sung 5 L DNA khuôn mẫu (100 ng) vào 40 L dung dịch của master mix tube. 2 Taq pol. 2.5. Đặt E-tube đựng dung dịch phản ứng vào heating block của máy PCR để thực hiện chế độ nhiệt theo chu kỳ như sau: 54
  58. Simpo- Start PDF program Merge and Split Unregistered Version - - 95oC/5 phút - : 95oC/30 giây, 50o 72oC/1 phút - 72oC/10 phút - 4oC - Chạy điện di để h 3.7) - -20oC - đ ư bằng thực tham khảo. - và Taq pol, sau đó chia ra từng tube rồi cho DNA và Taq pol . - Thao tác trong tủ cấy vô trùng (hoặc không). SM 1 2 3 4 5 SM Hình 3.7. Điện di các sản phẩm PCR. SM: Chuẩn kích thước DNA. 1, 2, 3, 4 5: Các khác nhau. 55
  59. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - 1 - 2 dài hơn (20-24 mer) , genomic DNA không h t . 50% GC 3’ - nhiệt độ nóng chảy (Tm) 4oC cho GC 2oC cho AT 5o (Ta) o 4-6 Tm Ta . 20 oligonucleotide: o Ta = 4 (G + C) + 2 (A + T) – 5 C (1) . 1 RAPD (random amplified polymorphic DNA): . 2 STS (sequence-tagged site): STS primer được thiết kế trên cơ sở các trình tự của RAPD markers. 56
  60. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - 3. Magnesium 2+ 2 pol 2+ - 2+ hiệu 2+ (Mg2+ - pol 2+ . ribonucleotide triphosphate (dNTPs) 10 -20o 20-200 . 5. Enzyme Taq pol pol 1-2,5 unit cho 100 . 0,5 unit/25 pol pol . pol pol - 0,1% (v/v) Triston X-100. 57
  61. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - 0,1 20-mer) trong 25 - . : gia DNA - . Thông thường, nồng độ DNA khuôn mẫu được sử dụng trong khoảng từ 10-100 ng/25 L dung dịch phản ứng. - 0,5 M (12,5 pmol/25 -dimers. 10. Khởi động nóng PCR (“host-start” PCR) . DNA k 58
  62. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - pol đ , . họa cho khởi động nóng PCR. E-tube loại 0,5 mL và trộn đều các thành phần sau: Đệm 10 PCR 4,5 L ) 4 L Primer-F (10 pmol/ L) 2,5 L Primer-R (10 pmol/ L) 2,5 L Thêm H2 40 L pol: 10 2 L Taq pol (5 units/ L) 1 L Thêm H2 20 L 10.3. Bổ sung 5 L DNA khuôn mẫu (100 ng) vào 40 L dung dịch của master mix tube. 10.4. Đặt E-tube đựng dung dịch phản ứng vào heat block của máy PCR để thực hiện chế độ nhiệt theo chu kỳ như sau: - Start program - “Hot start”: Khoảng 80oC/10 giây «pause» - sung 2 L aq pol. - Restart - 94oC/5 phút 59
  63. Simpo- PDF Merge and Split: 94o C/30Unregistered giây, 54o Version - phút. - 72oC/10 phút - 4oC - Chạy đi - -20oC Tm (non-specific). - (priming) sự . - Tm ). Primer có chiều của primer càng nhỏ. Trong khi khuếch đại, một sự cố nào đó của quá trình ủ cũng sẽ làm giảm kết quả PCR. Để tối ưu hóa PCR, người ta sử dụng primer có chiều dài tối thiểu sao o cho đảm bảo Tm khoảng 54 C hoặc hơn chút ít, điều này sẽ cung cấp những cơ hội tốt nhất đ đặc trưng của sản phẩm PCR và hiệu suất phản 60
  64. ứngSimpo cao. PDF Những Merge oligonucleotide and Split Unregistered ngắn (15 base Version hoặc ngắn- hơn) đư . Chiều dài primer tối thiểu cho hầu hết các ười ta thư đ - , tạo thành sợi đôi ổn định trong tổng hợp DNA. Thông thư 28-35 mer cần cho việc khuếch đại các trình tự có mức độ dị hợp cao. Đối với những primer ngắn hơn 20 mer, có thể sử dụng công thức tính Tm liên hệ với các base: Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T). Trong khi primer dài hơ đúng. 2. Vị trí đầu 3’ của primer nên được xác định cẩn thận, vì nó có tính chất quyết định cho sự thành công của PCR. Khi chúng ta xác định được một amino acid, hai base đầu tiên trong codon của nó hoặc ba base trong trường hợp nó được mã hóa bằng codon đơn (methionin và tryptophan) thì hai hoặc ba base đầu tiên này được dùng như đầu 3’. Những cặp base hoàn chỉnh giữa những đầu 3’ của primer và khuôn mẫu cho phép chúng ta có được kết quả mong muốn, và giảm thiểu tối đa hiện tượng bắt cặp sai (mismatch) trong khoảng 5-6 nucleotide tại đầu 3’ của primer. Thông thư đầu 5’ của primer vẫn không làm thay đổi quá trình gắn mồi. Nhiệm vụ của đầu 3’ trong primer là kiểm soát hiện tượng g ă ượng tương đồng trong cùng một cặp primer. Nếu không thận trọng trong việc xác định đ ư - một sự khuếch đại mà ta mong muốn. Trong trường hợp có nhiều cặp primer đưa vào trong cùng một phản ứng (multiplex PCR), chúng ta cần phải kiểm tra gấp đôi hiện tượng bổ sung cho nhau của tất cả primer. Tm Primer của PCR phải duy trì được hàm lượng GC đến mức có thể được. Những oligonucleotide có 20 base với 50% GC thường có giá trị Tm 61
  65. trongSimpo khoảng PDF 56 Merge-62o and Splitđiều Unregistered kiện để quá trìnhVersion ủ đ - Hàm lượng GC và Tm phải khớp với một cặp primer được thiết kế. Nếu giá trị Tm ơ hội cho hiện tượng gắn primer nhầm càng cao. Do đ ư đến hàm lượng GC. V. Kỹ thuật RT-PCR Phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu RNA theo nguyên lý của PCR, bao gồm hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất. Phiên mã ngược khuôn mẫu RNA thành sợi DNA thứ nhất, sau đó dùng sợi này làm khuôn mẫu để tổng hợp sợi DNA thứ hai (tương tự như giai đoạn thứ nhất và thứ hai của quá trình tổng hợp cDNA-xem chương 6). Giai đoạn thứ hai. Dùng DNA sợi đôi làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR như đã trình bày ở trên. RNA được cấu tạo nhờ bốn loại nucleotide (adenine, guanine, cytosine và uracil) liên kết với nhau tạo thành một chuỗi đơn. Khi chuỗi nucleotide này được biến đổi thành DNA thì uracil (U) được thay thế bằng thymine (T). Phản ứng biến đổi RNA hệ gen thành sợi DNA thứ nhất phải nhờ đến một enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) do vậy giai đoạn này được gọi là phiên mã ngược (RT), sau đó quá trình tổng hợp sợi DNA thứ hai lại nhờ một enzyme khác là DNA polymerase I (thường dùng đoạn Klenow). Khi đã có DNA sợi đôi từ khuôn mẫu RNA thì phản ứng tiếp theo sẽ là khuếch đại gen nhờ kỹ thuật PCR được thực hiện với ba mức nhiệt độ phù hợp ở mỗi chu kỳ. Toàn bộ phản ứng khuếch đại một đoạn DNA từ khuôn mẫu RNA trải qua hai giai đoạn nói trên được gọi là RT-PCR. Do trong tự nhiên một số virus có hệ gen là RNA (retrovirus) nên muốn khuếch đại một đoạn gen của nó thì người ta phải dùng kỹ thuật RT- PCR. Một số nghiên cứu khác về mRNA cũng cần đến RT-PCR để biến đổi sợi RNA thành DNA cho quá trình tạo dòng để phân tích trình tự gen (gene sequencing) hay tái tổ hợp (recombination) trong nghiên cứu biểu hiện gen. VI. Real-time PCR 1. Giới thiệu chung 62
  66. SimpoTrong PDF PCR Merge truyền and thống, Split sản Unregistered phẩm khuếch Version đại được - phát hiện nhờ sự phân tích đầu cuối (end-point) bằng cách chạy điện di DNA trên agarose gel sau khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, phương pháp real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang. Trong real-time PCR, người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang, và các probe hoặc primer đặc hiệu chuỗi (trình tự) được đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR). Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ (máy PCR) đặc biệt được gắn với một module phát hiện tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ. Real-time PCR có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phép chúng ta định lượng số copy khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao trên một phạm vi động học lớn. Các kết quả của real-time PCR có thể là chất lượng (sự có mặt hoặc không của trình tự đích) hoặc định lượng (số bản copy của DNA). Real-time PCR định lượng còn được biết như là qPCR. Số liệu của real-time PCR có thể đánh giá mà không cần điện di gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu đưa vào quá trình được tăng lên. Cuối cùng, do các phản ứng được chạy và số liệu được đánh giá trong một hệ thống tube đóng kín, nên các cơ hội nhiễm bẩn được giảm thiểu và sự cần thiết của các thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ. 2. Phân tích tổng quát một phản ứng real-time PCR Để hiểu được real-time PCR như thế nào, chúng ta bắt đầu bằng một đường cong khuếch đại mẫu (Hình 3.9). Trong hình này, số chu kỳ PCR được trình bày trên trục x, và tín hiệu huỳnh quang từ phản ứng khuếch đại, tỷ lệ với số lượng sản phẩm được khuếch đại trong tube, được trình bày ở trục y. Đường cong khuếch đại có 2 pha, một pha hàm mũ (exponential phase) được tiếp theo bởi một pha ổn định (plateau phase). Trong suốt pha hàm mũ, số lượng sản phẩm PCR xấp xỉ gấp đôi trong mỗi chu kỳ. Tuy nhiên, khi phản ứng diễn ra thành phần phản ứng sẽ bị tiêu hao, cuối cùng 63
  67. làmSimpo cho mộtPDF hoặc Merge nhiều and thành Split phần Unregistered bị hạn chế. VersionỞ điểm này- phản ứng chậm lại và đi vào pha ổn định (các chu kỳ 28-40, Hình 3.9). Pha hàm mũ 0.3 Pha ổn định 0.2 0.1 Giá trị CT Đường ngưỡng 0 0 10 20 30 40 Hình 3.9. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nền (baseline). Đầu tiên, tín hiệu huỳnh quang duy trì ở mức độ nền (background), và việc tăng tín hiệu huỳnh quang là không thể phát hiện được (các chu kỳ 1- 18, Hình 3.9) cho dù sản phẩm tích lũy theo hàm mũ. Sau đó, sản phẩm khuếch đại tích lũy đủ để đạt tới một hiệu suất cho phép phát hiện được tín hiệu huỳnh quang. Số chu kỳ để đạt được hiệu suất này gọi là chu kỳ ngưỡng (threshold cycle, CT). Do giá trị CT được đo trong pha hàm mũ khi các tác nhân phản ứng không bị hạn chế, nên real-time qPCR có thể được sử dụng để tính toán chính xác và tin cậy số lượng khởi đầu của khuôn mẫu hiện diện trong phản ứng. CT được xác định chủ yếu bởi số lượng của khuôn mẫu hiện diện ở lúc bắt đầu phản ứng khuếch đại. Khi lượng khuôn mẫu nhiều thì chỉ cần một vài chu kỳ khuếch đại để tích lũy sản phẩm đủ cho một tín hiệu huỳnh quang ở trên background. Vì vậy, phản ứng sẽ có CT thấp hơn hoặc sớm. Ngược lại, nếu lượng khuôn mẫu lúc bắt đầu phản ứng quá ít, thì số chu kỳ khuếch đại cần nhiều hơn để tín hiệu huỳnh quang tăng trên background. Vì vậy, 64
  68. phảnSimpo ứng PDF sẽ có Merge CT cao and hoặc Split muộn. Unregistered Các dạng Version quan h ệ- này là cơ sở cho hướng định lượng của real-time PCR. 3. Một số ứng dụng chính của real-time PCR - Nghiên cứu biểu hiện gen. Xác định sự hoạt động của gen và định lượng mức độ biểu hiện của nó thông qua RNA bằng kỹ thuật RT-PCR. - Chẩn đoán phân tử. Nghiên cứu mức độ nhiễm virus và vi khuẩn để chẩn đoán các bệnh viêm nhiễm. - Xét nghiệm phân biệt allele. Là phương pháp xét nghiệm đầu cuối được dùng để xác định kiểu gen của mẫu vật (đồng hợp tử: chỉ có allele 1 hoặc chỉ có allele 2, dị hợp tử: có cả hai allele 1 và 2) và phân biệt sự đa hình nucleotide đơn (single nucleotide polymorhism, SNP). VII nhiều giới thiệu : - + + + + λgt11 + Multiplex PCR - + + + + 65
  69. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - ( - này ên nhau (overlapping), do đó ra đoạn . (Hình 3.10 . Thông thư 16-30 nucleotide. : - . - . - . 66
  70. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - - . Primer C Primer A Genomic DNA Trình tự gen Primer B Primer D Sản phẩm PCR T7 promoter Taq hai giai đoạn dạng mạch RBS T7 terminator thẳng Hình 3.10. Sơ đồ minh họa một phản ứng tạo nhanh gen tổng hợp thông qua phương pháp PCR hai giai đoạn. Gen quan tâm được khuếch đại trong phản ứng PCR thứ nhất với cặp oligonucleotide đặc hiệu gen nhưng có đưa vào vùng chồng lên nhau (primer A và primer B). Trong phản ứng PCR thứ hai, các primer mở rộng C và D gắn với vùng chồng lên nhau của sản phẩm PCR lần thứ nhất và bổ sung tất cả các nhân tố điều hòa cần thiết cho sự phiên mã và dịch mã. Sản phẩm PCR lần thứ nhất được pha loãng 200 lần để làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR thứ hai. 2.1. 67
  71. hợpSimpo PDF Merge and Split Unregistered Version - chuẩn. Kỹ thuật này ặc hiệu A khuôn mẫu (dT). 2.2. ược ư ư tương ứng , tiếp theo hai . Cắt DNA bằng RE Tạo vòng Chú thích Vùng kế cận trên (upstream) Vùng kế cận dưới (downstream) PCR Vị trí cắt của các RE Vùng đã biết trình tự 3.11 ược. Hai primer đặc hiệu được gắn vào trình tự đã biết khuếch đại . 68
  72. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - 5’ 3’ i cDNA (5’ 3’ 3.11). . (restricti (simple sequence repeats, SSR), và đa hình chiều dài đoạn DNA đư (amplified fragment length polymorphism, AF , tiết kiệm thời gian và có . 4. Ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng Trước đây, kỹ thuật phân tích RFLP thường được sử dụng để xác định các đột biến dẫn tới các bệnh di truyền ở người. Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ áp dụng được trong trường hợp đột biến đó dẫn đến sự thay đổi trình tự có thể phát hiện được trên cơ sở độ dài của đoạn DNA. Ngược lại, trường hợp 69
  73. mộtSimpo số đ ộtPDF biến Merge gây ra andbệnh Split di tru Unregisteredyền nhưng không Version tạo ra - các đoạn DNA cắt hạn chế khác nhau khi phân tích RFLP thì chỉ có thể phát hiện nếu xác định được trình tự đoạn DNA chứa điểm đột biến. Như vậy, chúng ta buộc phải xây dựng thư viện hệ gen (xem chương 5) cho mỗi người, sau đó tạo dòng và xác định trình tự nucleotide của dòng gen đột biến, vì thế phương pháp này đòi hỏi tốn nhiều thời gian. Kỹ thuật PCR cho phép đưa ra một chọn lựa khác đơn giản hơn cho phép thu nhận thông tin về trình tự gen rất nhanh bằng cách khuếch đại đoạn gen chứa điểm đột biến và sau đó phân tích trực tiếp các sản phẩm PCR thu được. Khả năng nhận dạng nhanh các đột biến không chỉ quan trọng trong chẩn đoán lâm sàng, mà còn đẩy nhanh việc nghiên cứu các bệnh di truyền. Độ nhạy cao của kỹ thuật PCR cho phép ứng dụng dễ dàng trong các chẩn đoán bệnh nhiễm trùng. Ví dụ: việc khuếch đại một số lượng lớn DNA virus trong các mẫu bệnh cho khả năng chẩn đoán bệnh sớm hơn trước khi triệu chứng bệnh bắt đầu xuất hiện. Điều này giúp cho thầy thuốc có phác đồ điều trị bệnh thích hợp, đặc biệt các bệnh ung thư do virus gây ra (ví dụ: ung thư vòm họng do papillomavirus người gây ra) và thông thường có kết quả hơn nếu như bắt đầu điều trị ở giai đoạn sớm. T tham khảo/đọc thêm 1. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. 2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA. 2. Chen BY and Janes HW. 2002. PCR Cloning Protocols. 2nd ed. Humana Press Inc. New Jersey, USA. 3. Dieffenbach CW and Dveksler GS. 2003. PCR Primer: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Habor Laboratory Press, NewYork, USA. 4. Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ and White TJ. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press, New York, USA. 5. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 1989. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. Cold Spring Habor Laboratory Press, USA. 6. Rapley R and Walker JM. 1998. Molecular Biomethods Handbook. Humana Press Inc. New Jersey, USA. 70
  74. Simpo7. SurzyckiPDF Merge S. 2000 and. BasicSplit Unregistered Techniques in Version Molecular - Biology. Springer- Verlag, Berlin, Heidelberg, Germany. 71
  75. CSimpohương PDF 4 Merge and Split Unregistered Version - C nhóm vector chính tế bào vật chủ (E. coli hoặc nấm men), bao gồm: 1) Nhóm plasmid, 2) Nhóm phage/phagemid, và 3) Nhóm nhiễm sắc thể nhân tạo (artificial chromosome: BAC và YAC). : - (ori) . - - khởi đầu . - (promoter) để tiến hành lai. - . - chỉ thị thể tái tổ hợp. như là: - được . - tách goại lai. - : RBS (ribosome binding sites-vùng ). Công nghệ DNA tái tổ hợp 72
  76. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - mục đích và của năm : - ). - Nghiên . - Đưa gen - . - . - . Chương này giới thiệu sáu loại vector phổ biến (thuộc ba nhóm vector: plasmid, phage/phagemid và nhiễm sắc thể nhân tạo) dùng trong tạo dòng gen (gene cloning): plasmid, bacteriophage λ, cosmid, bacteriophage M13, BAC và YAC. I. Plasmid vector 1- . Một số kiểu hình khác nhau của plasmid như: - chất - Kháng kim loại nặng - chất - - độc tố đường ruột enterotoxin - Sản xuất chất diệt khuẩn bacteriocin Công nghệ DNA tái tổ hợp 73
  77. Simpo- PDF Merge and 1Split Unregistered Version - - Sản xuất haemolysin2 - 3 4. Một loại vi khuẩn vật chủ thường chứa hai hoặc nhiều loại plasmid cùng tồn tại. Chúng có thể là các plasmid tương hợp (compatible plasmid) hoặc không tương hợp (incompatible plasmid). Người ta có thể chia plasmid làm hai loại dựa trên đặc điểm sinh sản và phương thức sống của chúng, đó là: plasmid tiếp hợp (conjugative plasmid) và plasmid không tiếp hợp (non- conjugative plasmid). nhờ . Một trong các vector hay trước đây pBR 322 mang hai (Ampr (Tetr hai vector 3. làm mất (multiple cloning sites, MCS . Bal Ava 153). , v : 1 Colicin: . 2 Haemolysin: dung huyết tố, chất gây tan máu, chất tiêu hồng cầu. 3 (modification enzymes): là các enzyme tác động qua lại với DNA để sửa đổi cấu trúc hoặc sửa chữa các tổn thương đã xảy ra với phân tử DNA. 4 (restriction enzymes hay restriction endonuclease, RE): xem chương 1. Công nghệ DNA tái tổ hợp 74
  78. Simpo- pMK PDF 16 Merge and Split Unregistered VersionSma -Xho amycin. - pKC 7 pACYC 184 . - pCR1 pSC 101 ( . control5 6 - : - plasmid. - (selectable marker) . - . Đến nay, c , trải qua ba : - . L . - . L thường 4.1 5 Stringent control: Còn gọi là kiểm soát sao chép c . 6 Relaxed control: ể . Công nghệ DNA tái tổ hợp 75
  79. Simpo PDF Merge andColE1. Split Unregistered Version - (Ampr Tetr (ori như EcoRI, HindIII, BamHI, SalI, Ampr bốn Tetr tám . BamHI (375) Tetr chèn , vì thế E. coli - 1. . 4.1. Plasmid vector pBR 322. Apr (hay Ampr)và Tetr: gen kháng ampicillin và tetracycline, ori: trình tự khởi đầu sao chép, và một số vị trí nhận biết cho các RE. - . L . Đ Công nghệ DNA tái tổ hợp 76
  80. polylinkersSimpo PDF (vùng Merge and Split Unregistered Version - - như: + . 2.600 bp, mang gen Apr lacZ’ a gen lacZ’ 4.2 :  .  lacZ’ 7 tiện . 400 420 440 460 AGTGAATTCGAGCTCGG TACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCATAATCATGGTCAT EcoRI SacI KpnI BamHI XbaI HincII PstI SphI HindIII SmaI AccI 1 XmaI SalI lacZ’ ThrIleMetThr(Met) 4.2. Plasmid vector pUC19. Vị trí tạo dòng (từ 396-447) được gắn vào gen lacZ’, nhưng không can thiệp vào chức năng của gen. 7 Gen lacZ’: gen của E. coli mã hóa -galactosidase thích hợp cho chọn lọc thể biến nạp bằng khuẩn lạc xanh ( -galactosidase sẽ kết hợp với IPTG và X-gal được bổ sung trong môi trường nuôi cấy) và khuẩn lạc trắng (đoạn DNA ngoại lai xen vào giữa gen lacZ’ làm cho gen này mất hoạt tính vì thế không sản xuất được - galactosidase). Công nghệ DNA tái tổ hợp 77
  81. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - . + plasmid pGEM 3.000 bp, mang gen Ampr, gen lacZ . 4.3. Plasmid vector pGEM. Nhóm vector này được mở vòng sẵn mang 2 đầu T ở vùng MCS, đặc trưng cho việc gắn các sản phẩm PCR mang 2 đầu A. + N 3. ứng dụng 4.4). in vitro - Công nghệ DNA tái tổ hợp 78
  82. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - : V ùng tạo dòng MCS của pBluescript II SK (+/-) (từ vị trí 598 đến 826) ApaI Eco01091 BssHII T7 Promoter KpnI DraII XhoI SalI TTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGAC M13-20 primer binding site T7 primer binding site KS primer binding site Bsp1061 NotI ClaI HindIII EcoRV EcoRI PstI SmaI BamHI SpeI XbaI EagI BstXI SacII SacI GGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTC KS primer binding site SK primer binding site T3 Promoter BssHII β-gal α-fragment CAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGC TTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCC T3 primer binding site M13 reverse primer binding site 4.4. Plasmid vector pBluescript II SK (+/-). Vector này mang vùng tạo dòng ở vị trí từ 598-826 trên gen lacZ’, gen kháng ampicillin, các promoter T3 và T7, và các vị trí gắn cho các cặp primer khác nhau dùng trong phân tích trình tự đoạn DNA ngoại lai. (insertional inactivation) (ví dụ: Ampr, lacZ Công nghệ DNA tái tổ hợp 79
  83. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - E. coli m -galactosidase của gen lacZ ư -thiogalactoside (IPTG) cùng vớ -gal sẽ có màu trắng do đoạn DNA ngoại lai xen vào giữa gen lacZ làm gen này mất hoạt tính. Trong khi đ lacZ không bị mất hoạt tính (Hình 4.5 và 4.6). H N Br O CH2OH Cl HO X-gal OH OH β-galactosidase Galactose Cl OH H N Br Indoxyl Br N H OH Cl Nhị trùng hóa và oxy hóa Cl H H N O Br Kết tủa màu xanh Br O N H H Cl Hình 4.5. Cơ chế tác dụng của -galactosidase 2.2. (directional cloning) iết đơn Hin Bam Công nghệ DNA tái tổ hợp 80
  84. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Bam Hin E. coli Hin Bam E. coli - (Hình 4.7). r BamHI Amp BamHI BamHI BamHI lacZ Plasmid vector DNA ngoại lai r BamHI Amp Gen lacZ mất hoạt tính T4 DNA ligase Đoạn DNA Amp r Amp r ngoại lai lacZ chèn giữa gen lacZ làm gen lacZ mất hoạt tính Biến nạp vào E. coli và cho sinh trưởng ở 37oC trên môi trường có Amp và IPTG+X-gal Vi khuẩn E. coli chứa vector tái tạo Vi khuẩn E. coli chứa vector tái tổ vòng phát triển thành khuẩn lạc có hợp phát triển thành khuẩn lạc có màu xanh màu trắng Hình 4.6. Tạo dòng theo phương thức khử hoạt tính bằng chèn đoạn. Ampr: gen kháng ampicillin, lacZ: gen mã hóa enzyme β-galactosidase. Công nghệ DNA tái tổ hợp 81
  85. Simpo PDFr Merge and Split Unregistered Version - Amp HindIII HindIII BamHI HindIII r Tet BamHI Plasmid vector DNA ngoại lai BamHI + HindIII Amp r H s Tet B H B H B H B Điện di agarose gel Amp r H Tet s B T4 DNA ligase Amp r Amp r H H Tet s Các thể biến nạp được Tet s B dàn mỏng trên môi B trường có Amp Hiệu suất biến nạp thấp Hiệu suất biến nạp cao Hình 4.7. Tạo dòng định hướng. Tetr: gen kháng tetracycline, Tets: gen kháng tetracycline bị khuyết đoạn và mất hoạt tính. 2.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn/tế bào vật chủ Sau khi tạo được vector tái tổ hợp mang gen ngoại lai, việc tiếp theo là biến nạp nó vào tế bào vật chủ. Trong trường hợp này tế bào vật chủ thường Công nghệ DNA tái tổ hợp 82
  86. đưSimpoợc sử dụngPDF là Merge vi khuẩn and E. Split coli Unregisteredđể khuếch đại mộtVersion lượng - lớn DNA plasmid tái tổ hợp dùng cho các phân tích về sau. Hai phương pháp được dùng để biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli là điện biến nạp (electroporation transformantion) và hóa biến nạp (chemical transformation). 2.3.1. Điện biến nạp Đây là kỹ thuật hiệu quả nhất để biến nạp vi khuẩn. Hai thông số quan trọng của phương thức này là loại tế bào vi khuẩn và tần số xung điện cần thiết. Thể tích của dung dịch tế bào thường được dùng là 30 µL (tương ứng với nồng độ 1010 tế bào E. coli/mL) có bổ sung 5 ng plasmid trong một cuvette có khoảng trống điện cực (electrode gap) 0,1 cm. Hiệu suất biến nạp của phương thức này lớn hơn 1×109 thể biến nạp/µg plasmid siêu xoắn và khoảng 1×108 thể biến nạp/µg plasmid được dùng trong phản ứng gắn. Tần số biến nạp khoảng 0,02 cho cả hai loại plasmid. Tần số biến nạp thấp đã ngăn cản được sự đồng biến nạp (co-transformation) vào vi khuẩn của hai hoặc nhiều phân tử plasmid. Phương pháp điện biến nạp có một số ưu điểm sau: - Hiệu suất biến nạp cao. - Có thể dùng một thể tích dịch tế bào nhỏ. Thể tích dịch tế bào khoảng 20 µL có thể cho hiệu suất khoảng 109 thể biến nạp. - Phương pháp chuẩn bị tế bào biến nạp rất đơn giản, không sử dụng các kỹ thuật phức tạp và tốn thời gian. Hơn nữa, các tế bào dùng để biến nạp có thể được chuẩn bị trước và bảo quản vô hạn định mà không mất tính khả biến. - Tần số điện biến nạp với DNA siêu xoắn và DNA mạch vòng là giống nhau. Do đó, không cần thiết phải dùng vector được tinh sạch cao trong các phản ứng gắn. - Hiệu suất biến nạp phân tử cho DNA mạch vòng rất cao đối với các plasmid có kích thước lên đến 50 kb. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi thiết bị biến nạp đắt tiền. Công nghệ DNA tái tổ hợp 83