Enzyme và ứng dụng

Nội dung text: Enzyme và ứng dụng

1. ENZYME VÀ ỨNG DỤNG I. Khái niệm: −Các quá trình hoá học xảy ra trong cơ thể sống là những phản ứng có hiệu quả cao nhất. Đó là nhờ tác dụng xúc tác của enzyme, enzyme là những chất xúc tác sinh học ,có thể là protein hoặc acid nucleic,có đầy đủ tính chất của chất xúc tác,ngoài ra còn có những tính chất ưu việt hơn so với các chất xúc tác khác như: hiệu suất cao trong điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường,có tính chất đặc hiệu cao.Các tính chất này vẫn được giữ nguyên khi tách enzyme ra khỏi hệ thống sống,hoạt động trong điều kiện invitro (trong ống nghiệm).Vì vậy mà enzyme càng được sử dụng rộng rãi trong thực tế,trong công nghiệp nên đã hình thành nên nhiều ngành lien quan đến enzyme như công nghệ sản xuất enzyme,công nghệ sản xuất các thiết bị có phẩn tử enzyme như biosensor( các thiết bị cảm biến sinh học) . để khai thác và sử dụng hiệu quả cần có kiến thức nhất định về enzyme. II. Danh pháp-Cấu tạo-Phân loại: −Tên enzyme = tên cơ chất+ase Ví dụ: enzyme thuỷ giải protein: protease enzyme phân huỷ nucleic : nuclease enzyme tổng hợp DNA : DNA-polymerase −Bên cạnh đó còn có những tên thong thường(rất nhiều),ví dụ như ligase(enzyme nối, trong quá trình tự sao DNA),amylase (enzyme thuỷ phân tinh bột,có trong dịch ruột) −Cấu tạo: Enzyme 1 cấu tử:là enzyme trong thành phần cấu tạo chỉ có protein. VD: pepsin ,urease Enzyme 2 cấu tử là enzyme trong thành phần của nó ngoài protein còn có thành phần non-protein-nhóm ngoại.Người ta gọi phần protein là”feron” hay”apoenzyme” phần nhóm ngoại là “agon” hay “coenzyme”.Thường nhóm ngoại là dẫn xuất của các vitamin,các nucleotide. VD: catalase,xitocrom −Trung tâm hoạt động:chỉ có 1 phần rất nhỏ của enzyme tham gia phản ứng, phần này gọi là trung tâm hoạt động,số trung tâm hoạt động có thể lớn hơn 1 −Ngày càng nhiều enzyme mới được phát hiện, để thống nhất tên gọi enzyme ngưòi ta đã phân tất cả enzyme làm 6 loại: Loại enzyme Loại phản ứng được xúc tác Oxidoreductas Các enzyme này xúc tác các phản ứng oxi-hoá khử e có nghĩa là chúng vận chuyển các nguyên tử Hydro hoặc điện tử của chúng từ cơ chất của chúng sang các phần tử nhận
2. Transferase Các nhóm nhỏ các nguyên tử được vận chuyển từ cơ chất này sang cơ chất khác Hydrolase Các enzyme này làm gãy đứt các lien kết hoá học bằng phản ứng thủy phân Lyase Các enzyme này nối them 1 nhóm mới vào cơ chất bằng cách làm gãy nối đôi,nguợc lại nó cũng có thể xúc tác để tạo nối đôi Izomerase Chúng xúc tác sự tái phân bố các nguyên tử trong cơ chất,tức là chúng tạo ra các đồng phân của cùng 1 hợp chất Ligase Các enzyme này tạo liên kết hoá học mới,năng lượng từ ATP sẽ cần cho sự tạo các lien kết hoá học này,Ligase giúp cho sự tổng hợp nên Hydro carbon,protein và các đại phân tử khác Tính đặc hiệu và tính chất lí hoá của enzyme: −Mỗi loại enzyme chỉ xúc tác cho 1 phẩn ứng nhất định với cơ chất tương ứng. −Enzyme có khả năng xúc tác 1 cách hiệu quả ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường,trong khi các chất xúc tác khác lại đòi hỏi điều kiên xúc tác thường nhiệt độ áp suất cao,mà hiệu quả phản ứng lại không cao.sở dĩ enzyme có khả năng tuyệt vời như vậy vì nó tạo ra được môi trường đặc hiệu có lợi nhất về mặt năng lượng để thực hiện phản ứng.môi trường đặc hiệu trên được tạo bởi tâm hoạt động lien kết với cơ chất mà nó xúc tác tạo ra phức enzyme-cơ chất. −Enzyme có cường độ xúc tác đặc hiệu rất cao bởi: Năng lượng tự do giải phóng trong quá trình hình thành lien kết yếu trong tương tác lien kết cơ chất enzyme. Enzyme thường sử dụng năng lượng lien kết làm giảm năng lượng hoạt hoá.Fisher đưa ra giả thuyết “sự ăn khớp như chìa khoá và ổ khoá” cho phép giải thích tính xúc tác đặ hiệu của enzyme.tuy nhiên không thể dựa vào đó để giải thích cơ chế hoạt đọng của enzyme,vì trong thực tế sự khớp quá khăng khít này lại là nguyên nhân cản trở diễn tiến phản ứng. Enzyme sử dụng năng lượng lien kết tạo phản ứng xúc tác đặc hiệu thong qua 1 số cơ chế như sau: Giảm entropi. Làm mất vỏ nước bao quanh cơ chất. Năng lượng lien kết do các tương tác yếu tạo ra ở trạng thái chuyển tiếp. Tạo ra khớp phản ứng làm cho phản ứng xảy ra dễ dàng hơn.
3. −Sau khi tạo thành phức enzyme-cơ chất các nhóm chức năng nằm ở vị trí đặc biệt trong phức sẽ phát huy tác động của mình theo 1 số cơ chế. Phổ biến nhất là cơ chế xúc tác acid-base và cơ chế xúc tác hóa trị. Cơ chế xúc tác acid-base:thường trong phản ứng sinh hoá luôn có sự hình thành các chất trung gian mang điện không bền,dễ dàng phân rã trở lại trạng thái ban đầu.Tuy nhiên chúng có thể ổn định nhờ sự trao đổi prôtn với sự tham gia của H+,H3O+, và OH- trong môi trường nước xúc tác acid-base riêng,khác với xúc tác acid-base chung xảy ra trong môi trường phản ứng ngoài nước còn có chất cho và nhận proton khác. Xúc tác thong qua liên kết hoá trị tạm thời:lien kết này tồn tại trong khoảng thời gian rất ngắn giữa enzyme và cơ chất.Sự hình thành liên kết yếu tạm thời này giữa enzyme và cơ chất sẽ hoạt hoá rất mạnh cho phản ứng. Xúc tác thông qua ion kim loại: rất nhiều trường hợp enzyme có chứa các kim loại và cơ chất xuất hiện tương tác(thông qua ion kim loại)giúp định hướng cơ chất vào tâm phản ứng ngoài ra kim loại còn tham gia vào phản ứng oxi-hoá khử. III. Cơ chế phản ứng: −Bước đầu tiên của bất kì phản ứng nào có sự xúc tác của enzyme là sự hình thành mối liên kết đặc hiệu giữa các phân tử tạo thành phức enzyme- cơ chất,nhờ cấu hình của enzyme phù hợp với cơ chất qua 1 khu vực tương đối lớn là trung tâm hoạt động của enzyme,sau khi tạo ra phức này enzyme và cơ chất tác dụng với nhau (như phần tính đặc hiệu) làm xảy ra phản ứng hoá học trong cơ chất và các sản phẩm tương ứng được tạo ra liền sau đó enzyme tách khỏi cơ chất để sẵn sàng kết hợp với các cơ chất mới,quá trình này diễn ra rất nhanh. −Cơ chế hoạt động như trên là giả thuyết ổ khoá và chìa khoá,khái niệm này chỉ có tính chất tương đối.khoá và chìa khoá ở đây không phải cấu trúc cố định mà tương tác với nhau kèm theo sự thay đổi của cả 2bên.giả thuyết khác có vẻ hay hơn”phù hợp do cảm ứng”có nghĩa là cấu hình enzyme thay đổi khi cơ chất bám vào trung tâm hoạt động. Đồng thời quá trình kết hợp cũng kéo căng hoạt dồn nén một hoặc một vài liên kết hoá học trong phân tử cơ chất làm cho phản ứng dễ dàng hơn.khi phản ứng kết thúc enzyme lại trở về với hình dáng bình thường. −Trong bất kì phản ứng hoá học nào,các phân tử thành viên phải nhận được 1 số năng lượng từ môi trường xung quanh,năng lượng hoạt hoá,tuy nhiên trong 1 số trường hợp năng lượng hoạt hoá này lại trở thành lực cản của phản ứng,lúc này việc tăng nhiệt độ và áp suất có thể vượt qua lực cản.phản ứng cũng được tăng tốc nếu có enzyme hoặc chất xúc tác nào đó thích hợp.nói tóm lại enzyme làm giảm năng lượng hoạt hoá để phản ứng xảy ra dễ hơn. IV. Các yếu tố ảnh hưởng tới vận tốc phản ứng enzyme: Chú giải:
4. E là enzyme; S là cơ chất; ES là phức chất giữa enzyme và cơ chất; P là sản phẩm của phản ứng; ES* là phức chất giữa enzyme và cơ chất mà cơ chất đã được biến đổi thành dạng gần như sản phẩm. 1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: −Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuuyến tính vào [E]: v= k.[E] −Trong đó: v- vận tốc phản ứng. [E]- nồng độ cơ chất. −Có trường hợp khi nồng độ enzyme quá lớn thì tốc độ phản ứng chậm. 2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: a. Phương trình Henri & Michaelis – Menten: −Cả Henri (1903), Michaelis & Menten (1913) đều đã đưa ra phưong trình biểu diễn mối liên hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng độ cơ chất ([S]) giống nhau nhưng tuy nhiên:  Henri nhấn mạnh tầm quan trọng của vận tốc (v).  Michaelis & Menten nhấn mạnh tầm quan trọng của vân tốc đầu (vo) của phản ứng. S + E −Phức ES gọi là phức Michaelis – Menten với giả định cân bằng giữa enzyme, cơ chất và phức E cơ chất được thiết lập ngay lập tức và duy trì trong quá trình phản ứng, còn phản ứng phân giải ES thành sản phẩm là quá chậm. V [ S ] k v = với K = −1 o + [ ] s K s S k1 −Tuy nhiên phương trình này chưa khái quát được các phản ứng E vì giả định này không sử dụng được cho các phản ứng E xảy ra với vận tốc đủ nhanh. b. Giả định trạng thái dừng (steady- state ): −G.E. Briggs và John B.S Haldane (1925) lần đầu đưa ra giả định trạng thái dừng có tính chất khái quát hơn với nội dung: vận tốc phản ứng tạo thành phức ES bằng vận tốc phân giải tạo thành P và E trong đó thì hằng số Ks được thay thế bằng hằng số Michaelis – Menten_Km được tính theo công thức: k = 2 + K m K s k1 3. Ảnh hưởng của chất kìm hãm (inhibitor): −Các chất kìm hãm (I) cũng gọi là chất ức chế, là những chất làm giảm tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác.
5. −Bản chất: ion, chất vô cơ, chất hữu cơ, có thể là cơ chất hay sản phẩm của phản ứng E. −Kiểu tác dụng:  Đặc hiệu hay không đặc hiệu.  Kìm hãm thuận nghịch hay không thuận nghịch (inactivator). −Trong bài chỉ xét đến các phản ứng :  Chất kìm hãm thuận nghịch, kìm hãm enzyme bằng cách kết hơp với nó và làm ảnh hưởng đến sự kết hợp của E & S, tức là ảnh hưởng đến hoạt độ phân tử của nó.  Phản ứng do enzyme monomer xúc tác, chỉ có một cơ chất S và tạo thành một sản phẩm P, tuân theo phương trình Michaelis- Menten. Các chất kìm hãm có thể tác dụng theo kiểu:  Cạnh tranh (một phần hay toàn phần).  Không cạnh tranh.  Phi cạnh tranh. • Chất kìm hãm cạnh tranh: − Định nghĩa: các I này có cấu trúc tương tự cấu trúc của cơ chất bình thường →nó cảm ứng sự hình thành trung tâm hoạt động (TTHĐ) của E theo cách giống với S cạnh tranh và cạnh tranh với S để kết hợp vào TTHĐ của E nhưng khác với S ở chỗ nó không bị chuyển hoá bởi E. −Ảnh hưởng của chất kìm hãm cạnh tranh tới vo: = V [ ] vo I Ta có: K p  KP= Km[1+ ] +1 K [ S ] i [ I ] −Ta thấy: V không thay đổi, nhưng Km lại tăng lên [1+ ] lần. K i −Phương trình Lineweaver-Burk khi có chất kìm hãm cạnh tranh: 1 K p 1 1 = × [ ] + vo V S V
6. −Điều này xác nhận đăc điểm của kìm hãm cạnh tranh là có thể bị loại trừ khi nồng độ cơ chất đủ lớn hơn so với nồng độ chất kìm hãm. −Mức độ kìm hãm của I cạnh tranh phụ thuộc vào tương quan nồng độ của I & S, ái lực tương đối của I đối với E. −Lưư ý: I chỉ có thể kết hợp với E chứ không thể kết hợp với phức chất ES vì khi E kết hơp với S thì cấu trúc E thay đổi và không phù hợp để kết hợp với I. Ứng dụng để nghiên cứu trung tâm hoạt động cũng nhu cơ chế xúc tác của enzyme, con đường trao đổi chất. Mặt khác cũng có thể sử dụng các I cạnh tranh trong điều trị bệnh. • Chất kìm hãm không cạnh tranh (non- competitive inhibition) −Khái niệm: I không cạnh tranh kết hợp với E ở vị trí khác vị trí kết hợp của S tạo thành EIS không bị chuyển hoá tiếp (dead-endcomplex). S và I không cạnh tranh với nhau để kết hợp với E và cũng không loại trừ tác dụng kìm hãm bằng cách tăng nồng độ của cơ chất S. Dù I không cạnh tranh ở vị trí khac nhưng chính sự kết hợp này dẫn đến sự thay đổi cấu trúc không gian cản trở sự tiếp hợp giữa E và S làm giảm tốc độ phản ứng. −Ảnh hưởng của I không cạnh tranh tới vo: Theo phương trình trên ta có được: V v = o K [ I ]  K  [ m] +1+ × 1+ [ m]  S K i  s  V =  K   [ I ]   [ m] +1 × 1+   S   K i  Vkct = K m +1 [ s] [ I ] Ta thấy: Km không đổi nhưng V giảm đi [1+ ] lần. K i • Chất kìm hãm phi cạnh tranh (uncompetitive inhibition):
7. −Khái niệm: chất kìm hãm cạnh tranh chỉ có thể kết hợp với phức E-cơ chất [ES] và không thể kết hợp với E tự do. Có thể thấy trong trường hợp này khi E kết hợp với S làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử và tạo trung tâm kết hợp với I → không thể loại bỏ tác dụng kìm hãm bằng cách t8ng nồng độ cơ chất. −Ảnh hưởng của I phi cạnh tranh đến vo: V v = o [ ] Ta có: K m I [ ] +1+ S K i [ I ] −Chia cả tử và mẫu cho [1+ ] ta có được: K i V v = pct o K và biến đổi một chút có được: pct +1 [ S ] 1 K pct 1 1 = × [ ] + vo V pct S V pct −Km và V đều giảm một lượng giống nhau nên đường biểu diễn phương trình trên song song với đường khi không có chất I. Và đây là cách để xác định kiểu kìm hãm phi cạnh tranh. −Nói chung I phi cạnh tranh ít gặp đối với các phản ứng một cơ chất nhưng quan trọng đối với phản ứng E nhiều cơ chất → làm sang tỏ cơ chế phản ứng E. • Kiểu kìm hãm hỗn hợp: −Là kiểu kìm hãm thể hiện ở mô hình động học không đặc trưng cho một trong ba kiểu đã nêu mà có tính chất trung gian giữa hai kiểu: −Vd: cạnh tranh – không cạnh tranh. hoặc không cạnh tranh – phi cạnh tranh. Kìm hãm hỗn hợp (mix inhibition). • Kìm hãm do nồng độ cơ chất quá cao (thừa cơ chất): −Trong giới hạn cho phép thì vo tăng khi tăng nồng độ cơ chất S. Tuy nhiên đến giới hạn nào đó của S thì vo đạt giá trị cực đại (V), nhưng nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì vận tốc lại giảm xuống thấp hơn. −Có nhiều giả thuyết giải thích cho vấn đề này:
8. Nồng độ cơ chất quá cao tạo ra rào cản không gian gây khó khăn cho tương tác đúng giữa S và E. Do S kết hợp không đúng cách tạo thành phưc ESS không hoạt động. • Kìm hãm không thuận nghịch (irreversible inhibition): −Đặc điểm: các I không thuân nghịch kết hợp với E tạo phức EI không phân huỷ hoặc khó phân huỷ, phân ly với vận tốc rất thấp: E + I → EI −Cách kìm hãm: Làm biến tính không thuận nghịch protein enzyme hoặc bao vây trung t6m kết hợp (TTKH) cơ chất của enzyme hoặc phản ứng đặc hiệu không thuận nghịch với các nhóm chức trong TTHĐ của enzyme làm hỏng TTHĐ của enzyme.  Mức độ kìm hãm tăng theo thời gian tác dụng cho đến khi toàn bộ phân tử E hoặc I của đã ở trong phức EI. 4. Ảnh hưởng của các ion kim loại: −Đặc điểm: Ion kim loại có thể kìm hãm (inhibit) hoặc hoạt hoá (activate) e. Các ion kim loại nặng ở nồng độ gây biến tính protein có tác dụng kìm hãm không thuận nghịch e. Tác dụng của ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ của chúng. Và giới hạn này là khác nhau cho từng loại ion riêng biệt. Tác dụng của ion kim loại có mối quan hệ qua lại giữa ph của enzyme và cơ chất. Tác dụng hoạt hoá ion kim loại có tính đặc hiệu, mỗi ion kim loại thường hoạt hoá các enzyme xúc tác cho 1 kiểu phản ứng nhất định và cũng thay đổi tuỳ ion. −Độ bền liên kết với E và cách tác dụng:  Độ bền liên kết: khoảng 1/3 số enzyme cần ion kim loại cho hoạt động của chúng. Kim loại có vai trò khác nhau đối với hoạt động xúc tác của enzyme: cấu trúc hoặc trực tiếp tham gia xúc tác theo các cách khác nhau: các ion liên kết chặt chẽ với enzyme(trong quá trình tinh sạch vẫn còn kết hợp với E: ion Fe2+, Fe3+, ) các ion trong dung dịch liên kết lỏng lẻo với E → kích thích (activate) làm tăng hoạt độ của enzyme: Na+,  Các kiểu tác dụng: Làm cầu nối giữa E và S (Mildvan, 1970): tạo điều kiện thuận lợi cho E kết hợp với tạo thành phức E-M-S hoặc hoạt hoá S và tạo thành cơ chất thực có thể kết hợp với E tạo thành phức kiểu E-S-M Làm trung gian cho các phản ứng oxy hoá khử bằng cách thay đổi trạng thái oxy hoá của ion.
9. Làm biến dạng cấu trúc không gian hoạt động của phân tử enzyme nhờ tương tác tĩnh điện, thường gặp nhất là ion Ca2+. 5. Ảnh hưởng của các anion: −Nhiều anion có tác dụng hoạt hoá E (Cl − ảnh hưởng đến hoạt độ của α- amylase động vật). −Khi có mặt các anion có thể làm thay đổi pH thích hợp của E về phía kiềm. 6. Các chất hoạt hoá khác: −một số chất có thể làm tặng hoạt độ của enzyme bằng cách gián tiếp hay trực tiếp:  Gián tiếp: loại trừ chất kìm hãm khỏi hỗn hợp phản ứng hoặc không trực tiếp tác dụng với phân tử.  Trực tiếp: acid ascorbic, a.lipoic, glutation dạng khử có thể trực tiếp tham gia phản ứng kết hợp và loại thuận nghịch hydronên chúng có thể hoạt hoá các e xúc tác cho phản ứng oxy hoá-khử à chúng thường tác dụng vào tthđ của enzyme hoặc làm thay đổi cấu hình phân tử e theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác. 7. Ảnh hưởng của pH: a. pH hoạt đông thích hợp của E: −Hoạt độ của E phụ thuộc vào pH môi trường và pH ảnh hưởng đến trạng thái ion hoá của các gốc R hoặc của các gốc a.a trong phân tử E, ion hoá các nhóm chức trong trung tâm hoạt động, ion hoá cơ chất dẫn đến ảnh hưởng vân tốc phản ứng. −pH thích hợp (pHopt) của phần lớn enzyme vào khoảng 7. Tuy nhiên một số enzyme có pHopt rất thấp (pepsin) hoặc rất cao (subtilisin) hoặc ít thay đổi trong khoảng pH xác đ ịnh. −Cần chú ý là pHopt của một enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính và nhiệt độ cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ phản ứng. b. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của E: −Độ bền của phân tử E cũng phụ thuộc vào trạng thái ion hoá của phân tử, phần lớn E bền trong khoảng 5<pH<9. −Bản chất hoá học của thành phần dung dịch đệm cũng ảnh hưởng tới độ bền, hoạt độ xúc tác của E. 8. ảnh hưởng của nhiệt độ: a. Nhiệt độ hoạt động thích hợp của E: −Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định chưa ảnh hưởng tới cấu trúc của E. −Đại lương đặc trưng cho ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng là hằng số Q10:
10. k = t+10 Q10 . kt −Hệ số này càng lớn thì phản ứng càng khó xảy ra. ở nhiệt độ thường và của phần lớn phản ứng E thì Q10 thường có giá trị là 2. o −Nhiệt độ hoạt động thích hợp topt của nhiều enzyme vào khoảng 40÷50 c. Trên 50oc hoạt độ thường bị giảm mạnh do làm hỏng cấut trúc phân tử E. Topt của một số E vi sinh vật và E có nguốn gốc thưc vật thì cao hơn. −Topt của 1 enzyme chỉ có nghĩa là ở điều kiện đó thì E có hoạt độ cao nhất. b. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của E: −Ở khoảng 700C thì phần lớn enzyme bị nmất hoàn toàn hoạt độ, gọi là nhiệt độ tới hạn. ở khoảng tới hạn E bị biến tính hiếm khi hồi phục lại được. −Một số cách làm gia tăng độ bền nhiệt của E: −Làm giảm cấu trúc không cuộn trong phâ tử bằng cách thay đổi một số gốc a.a trong phân tử. −Giảm gốc Gly và tăng gốc Pro. −Làm bền cấu trúc xoắn α. −Thêm chất làm tăng độ bền nhiệt: Ca2+, V. ứng dụng: −Ứng dụng enzyme như các hoá chất để phân tích định lượng các chất :có thẻ xác định các chất đặc biệt với hàm lượng rất thấp và bị lẫn với các chất khác tương tự với nhau mà các phương pháp hoá học khác khó có thể xác định được chính xác,hoặc phân tích những chất không bền dễ dàng bị phân huỷ ở nhiêt độ hoặc áp suất cao,hoặc những điều kiện phản ứng khó thiết lập −Vd: xác định cơ chất sử dụng amylase để định lượng tinh bột cho kết quả chính xác hơn khi dùng acid vì 1 số polysaccharide như hemicellulosenzymecũng bị thuỷ phân bởi acid ở điều kịên thường −Sử dụng enzyme trong công nghiệp:từ 1970 tách enzyme ra khỏi tế bào và sử dụng trong sản xuất công nghiệp,hiện tại có it nhất 60 enzyme đã được thương mại hoá, đa số là các enzyme ngoại bào,ví dụ như sản xuất sữa,bánh mì,beer, cn dệt . −Sử dụng enzyme trong công nghiệp sản xuất bột giặt và các chất tẩy khác. −Sử dụng trong công nghiệp sản xuất sợi, vải, bột giấy và giấy −Sử dụng E trong nông nghiệp: tăng hiệu suất sử dụng thức ăn, sản xuất thức ăn dễ tiêu hoá cho động vật, đặc biệt là động vật còn non để tăng hiệu quả sử dụng thức ăn. −Một số lĩnh vực mới:nhuộm tóc, tạo sóng cho tóc,chăm sóc da,khai thác dầu mỏ. −Enzyme trong y dược: chuẩn đoán bệnh, điều trị bệnh,
11. VI. Các phương pháp xác định hoạt độ Ezyme: 1. Nguyên tắc chung của các phương pháp xác định hoạt độ enzyme: −Phản ứng do enzyme có thể khái quát đơn giản hóa bằng phương trình phản ứng: −Có thể xác định hoạt độ enzyme bằn gcách phân tích sự biến đổi theo thời gian trong điều kiện phàn ứng xác định của: cơ chất còn lại; hoặc sản phẩm tạo thành; hoặc cả cơ chất và sản phẩm. Tùy theo đặc trưng của phản ứng, sự tiện lợi của phương pháp, yêu cầu về độ chính xác, điều kiện của phòng thí nghiệm mà chọn cách xác định phù hợp nhất. Tuy nhiên, cách đáng tin cậy nhất trong mọi trường hợp là xác định sản phẩm tạo thành theo thời gian (vì có thể hoạt độ enzyme cần xác định rất thấp, sự chuyển hóa cơ chất khó đo được chính xác cho nên sự xuất hiện của sản phẩm có thể được xác định bằng những cách đo đặc hiệu cho phép khẳng định sự có mặt của enzyme một cách tin cậy). 2. Các đơn vị đo hoạt động xúc tác của enzyme: −Đơn vị IU (International Unit): Một đơn vị IU là hoạt độ của một enzyme ở điều kiện tiêu chuẩn thích hợp, xúx tác cho phản ứng chuyển hóa một µ mol cơ chất trong một phút. 1 IU = 1 cơ chất/phút = (10-6 mol/60 giây) −Đơn vị Katal (viết tắ là kat ): Một đơn vị kat là lượng enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa một mol cơ chất trong một giây ở các điều kiện phân tích (đơn vị kat ít được dung). 1 kat = 1 mol/giây 1kat = 60 x 106 IU 3. Hoạt độ riêng (specific activity): Hoạt độ riêng của enzyme được tính bằng số đơn vị hoạt độ enzyme trên một đơn vị khối lượng (miligam hay gam) protein. −Hoạt độ riêng là một chỉ tiêu quan trọng đánh giá độ sạch của chế phẩm enzyme. Trong quá trình tinh sạch enzyme, nếu hoạt độ tổng số của enzyme không thay đổi nhiều thì hoạt độ riêng sẽ tăng lên; nếu hoạt độ riêng không ăng lên nghĩa là chế phẩm đã có độ tinh khiết rất cao. 4. Điều kiện phản ứng khi tiến hành xác định hoạt độ enzyme: −Trong phản ứng xác định hoạt độ enzyme, cần sử dụng cơ chất và cofactor ở mức dư thừa (nếu enzyme cần cofactor) và thời gian xác định càng ngắn càng tốt. −Cần phải chọn lựa các điê2u kiện sao cho có được sự biến đổi tuyến tính giữa nồng độ enzyme, thời gian phản ứng và mức độ chuyển hóa cơ chất (trong giới hạn nồng độ cơ chất đã lựa chọn). −Một số enzyme bị ức chế bởi cơ chất ở nồng độ quá cao; hoặc bị giảm hoạt độ nhanh chóng theo thời gian ở nhiệt độ phân tích. Do đó phản ứng
12. phân tích nên thực hiện trong khoảng thời gian nhất định và nồng độ enzyme lẫn cơ chất thích hợp. 5. Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme: a. Phân tích liên tục: là phương pháp đo cơ chất bị biến đổi hay sản phẩm tạo thành một cách liên tục theo thời gian. Tuy nhiên yêu cầu đối với thiết bị đo là phải có bộ phận ổn định nhiệt đây là mặt hạn chế của phương pháp. Đồng thời, do phải theo dõi sự biến đổi của chất phản ứng một cách liên tục nên khó thực hiện phân tích hoạt độ nhiều mẫu enzyme cùng lúc. b. Phân tích gián đoạn: là phương pháp cho enzyme tác dụng với cơ chất sau một khoảng thời gian nhất định thì ngừng phản ứng enzyme bằng cách thích hợp và sau đó đo lượng cơ chất còn lại hoặc sản phẩm tạo thành. Để ngừng phản ứng có thể dung các tác nhân làm bất hoạt enzyme: nhiệt độ cao, thay đổi pH, dung chất tạo phức hay tách enzyme ra khỏi hỗn hợp Phương pháp này khắc phục những hạn chế của phương pháp đo liên tục, phản ứng có thể tiến hành trong tủ ấm hay bể nhiệt ổn định, có thể tiến hành một lúc nhiều mẫu tuy nhiên vấn đề đặt ra là phải tìm cách làm ngưng phản ứng thích hợp nhất. −Dựa theo nguyên tắc xác định hoạt độ trên, có thể xác định theo một hoặc một số phương pháp chính sau đây: • Phương pháp đo độ nhớt: Dùng nhớt kế đo sự biến đổi độ nhớt của dung dịch phản ứng. Áp dụng với các enzyme mà cơ chất có độ nhớt cao hơn hẳn so với sản phẩm (chất có phân tử lớn như acid nucleic, protein, cellulose ). • Phương pháp phân cực kế: Sử dụng khi cơ chất và sản phẩm có khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực và có góc quay riêng khác nhau. • Phương pháp đo áp suất hay áp kế : Dùng với các phản ứng enzyme có sự tiêu hao hay sinh khí, như các phản ứng oxy hóa, decarboxyl hoá, loại amin hóa. Phản ứng sinh hay tiêu hao khí có thể trực tiếp hay gián tiếp. • Phương pháp quang phổ kế: Được sử dụng ph63 biến hiện nay, dựa trên khả năng hấp thu ánh sang ở các bước song xác định của cơ chất, hoặc sản phẩm phản ứng. • Phương pháp chuẩn độ: Dùng cho các phản ứng enzyme có sự hình thành acid hoặc base. Phương pháp yêu cầu giữ pH môi trường cố định, lượng kiềm hoặc acid chuẩn dung để chuẩn độ theo thời gian phản ánh hoạt độ enzyme. • Phương pháp sắc ký : Sử dụng sắc ký để phân tách sản phẩm phản ứng, như tách amino acid sau khi cho hai enzyme aminotranspherase lên cơ chất hay protein tác dụng lên cơ chất và sau đó dịnh lượng các amino acid thu được. Đây là phương pháp tốn nhiều thời gian, ít sử dụng. • Phương pháp hóa học: Dùng các phản ứng hóa học để định lượng cơ chất mất đi hay lượng sản phẩm tạo thành. Thông thường phải chọn phản
13. ứng tạo nên các phức chất màu có độ hấp thu ánh sáng cực đại ở vùng nào đó để từ đó định lượng hợp chất này. Phương pháp định lượng cơ chất còn lại hay sản phẩm tạo thành có thể đơn giản là sự đo cơ chất còn lại hay sản phẩm tạo thành một cách trực tiếp. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, có thể đo một cách gián tiếp và do đó phép đo phức tạp hơn. • Phương pháp phóng xạ: Dựa trên sự hình thành các bức xạ của các chất đồng vị phóng xạ gắn vào cơ chất tại nhóm chức thích hợp để có thể đo độ phóng xạ (sự phân rã) của cơ chất còn lại, hay sản phẩm tạo thành. Thường áp dụng xác định hoạt độ các enzyme mà các phương pháp thông thường ko thể đo được. Có thể kết hợp phương pháp điện di với phương pháp phóng xạ để xác định hoạt độ enzyme. • Phương pháp huỳnh quang: Dựa trên sự phát quang của một số hợp chất dưới tác dụng của một nguồn sang kích thích đặc trưng. Mức độ phát huỳnh quang được đo nhờ máy huỳnh quang kế. Đây cũng là phương pháp cho độ nhạy cao, cho phép phát hiện hoạt độ enzyme ở mức độ thấp. −Bên cạnh những phương pháp phân tích hoạt độ có tính định lượng nêu trên, nhiều trường hợp phân tích định tính hay bán định lượng cũng được sử dụng để nhanh chóng bước đầu xác định sự có mặt của enzyme. Thường được dung hơn hết là phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch có chứa đệm và cơ chất (tinh bột với amylase, casein với protease ) sau đó nhuộm màu (iod nhuộm với tinh bột, xanh coomassie hay amido đen với casein ) để phát hiện hay đánh giá hoạt độ enzyme qua vòng phân giải cơ chất. Để khẳng định chắc chắn bản chất phản ứng có phải do enzyme xúc tác hay ko, người ta xử lý nhiệt (vì phần lớn enzyme có bản chất protein (hay RNA) đều mất hay giảm phần lớn hoạt tính xúc tác sau khi xử lý ở nhiệt độ cao. Trong một số trường hợp có thể dùng chất ức chế đặc biệt khẳng định sự có mặt của enzyme trong mẫu phân tích (azid natri ức chế đặc hiệu catalase, phenyl methyl sulphonyl fluorid-PMSF ức chế đặc hiệu các protease serine ). 6. Một số lưu ý khi xác định hoạt độ hay thực hiện phản ứng enzyme : −Khi xác định hoạt độ enzymecần chọn điều kiện pH và nhiệt độ phân tích ở vùng thích hợp. Với những enzyme lần đầu tiên nghiên cứu, nên chọn pH trung tính, 300C-370C. Sau đó có những điều chỉnh sau nếu cần thiết. −Bên cạnh pH và nhiệt độ, cần lưu ý cơ chất, thành phần đệm, lực ion hay nồng độ muối, các chất làm bền −Các phân tích hoạt độ enzyme phải thực hiện ở một giá trị pH ổn định, nên phải dùng một loại đệm hay một hệ thống đệm thích hợp nào đó. Nồng độ đệm thường dùng là 20-50 nM. Tuy vậy các phản ứng sinh acid, base cần phải dùng đệm ở nồng độ cao hơn tránh thay đổi pH trong quá trình thí nghiệm. Cần chọn loại đệm thích hợp tránh làm kết tủa các yếu tố cần thiết cho hoạt động của enzyme như Ca2+, Zn2+.
14. −Cơ chất và sản phẩm, đệm đều phải đạt cùng nhiệt độ phân tích khi tiếp xúac với nhau để bắt đầu phản ứng. Nếu phân tích nhiều mẫu, thời gian bắt đầu và kết thúc phản ứng phải duy trì như nhau. −Luôn có mẫu kiểm tra thích hợp để tránh sai sót. −Phải lựa chọn phương pháp làm ngừng phản ứng thích hợp, tránh làm biến đổi cơ chất hay sản phẩm cần đo; hay can thiệp quá mạnh vào phép định lượng sản phẩm phản ứng enzyme (chất làm ngừng phản ứng có cùng bước song hấp thụ ánh sáng cần đo với chất phản ứng, hay ức chế phản ứng tạo màu tiếp theo của phân tích ) Tóm lại việc xác định hoạt độ của enzyme chỉ cho số liệu tin cậy khi chọn được phương pháp thích hợp và có các bước tiến hành đúng. VII. Tính chất ưu việt của enzyme so với các chất xúc tác khác: −Thu nhận dễ dàng từ các nguồn khác nhau,có thể từ động vật,hoặc vi sinh vật,với công nghệ DNA tái tổ hợp,hiệu quả thu enzyme cang cao hơn. −Hoạt động xúc tác nhẹ nhàng, điều kiện bình thường,ngay cả ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường thì sự xúc tác của enzyme vẫn cho hiệu quả phản ứng cao nhất. −Enzyme có tính đặc hiệu cao hơn những các xúc tác khác ,chỉ tác dụng lên những cơ chất nhất định và xúc tác cho những phản ứng nhất định do đó rất ít tạo sản phẩm phụ ,hiệu suất thu được sản phẩm chính khá cao. −Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác có thẻ được điều chỉnh dễ dàng thậm chí có thể ngừng phản ứng bằng các yếu tố tác động như nhiệt độ,ph,hoặ áp suất ,nồng độ cơ chất E. −Enzyme không bị mất đi khi phản ứng kết thúc.