Bài thuyết trình Cây sinh dòng bệnh dịch tả heo - Trần Như Khoa

Nội dung text: Bài thuyết trình Cây sinh dòng bệnh dịch tả heo - Trần Như Khoa

1. CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG THÚ Y ĐỀ TÀI: CÂY SINH DÒNG BỆNH DỊCH TẢ HEO Sinh viên: Trần Như Khoa Giáo viên: Nguyễn Ngọc Hải
2. Mục lục • I. Vài nét về bệnh dịch tả heo (classical swine fever or hog cholera ). • II. Phân lập sơ bộ các nhóm kháng nguyên DTH • III. Cây sinh dòng dịch tả heo ở Mexico ( 1997- 2001) III.1 Giới thiệu III.2 Nguyên liệu và phương pháp III.3 Kết luận III.4 Thảo luận • IV. Cây sinh dòng dịch tả heo ở Mỹ IV.1 Các chủng virus phân lập và trình tự IV.2 Ly trích RNA, RT-PCR và giải trình tự IV.3 Phân tích cây sinh dòng IV.4 Kết luận và thảo luận
3. I. Vài nét về bệnh dịch tả heo (classical swine fever or hog cholera ). Bệnh dịch tả heo ( DTH ) là 1 bệnh +truyền nhiễm nguy hiểm +khó khăn trong việc kiểm soát Nguyên nhân + Virus RNA , giống Pestivirus , họ Flaviviridae
4. Virus DTH có đặc điểm + Tính bảo tồn + Khó khăn trong chuẩn đoán
5. II. Phân lập sơ bộ các nhóm kháng nguyên DTH Giải trình tự các gen cơ bản của những phân lập virus trên thế giới: • + gene NCR ( Non Coding Region) ở đầu 5’ • + gene mã hoá vỏ bọc ( Envelop ) E2 • + gene mã hoá NS5B ( Non Structural )
6. Các nhóm kháng nguyên • Nhóm 1.1: gồm các chủng virus vaccine , phân lập virus ở Anh, Mỹ năm 1940 - 1950 . • Nhóm 1.2: gồm các chủng virus vaccine , phân lập virus ở Tây Âu năm 1940 Malaysia, Mỹ năm 1960 . • Nhóm 1.3: gồm các chủng virus vaccine , phân lập virus ởMaylasia năm 1980 Thái Lan năm 1980 -1990 .
7. • Nhóm 2.1: gồm các chủng virus vaccine , phân lập virus ở Malaysia năm 1980 • Nhóm 2.2: gồm các chủng virus vaccine , phân lập virus ở Singapore năm 1980, Tây Âu năm 1980-1990 • Nhóm 2.3: gồm các chủng virus vaccine , phân lập virus ở Nhật năm 1970 Tây Âu năm 1980-1990
8. • Nhóm 3.1: chỉ có dòng Congenital Tremor phân lập ở Anh năm 1960 • Nhóm 3.2: gồm các chủng virus vaccine , phân lập virus ở Nam Triều Tiên năm 1980-1990 • Nhóm 3.3: gồm các chủng virus vaccine , phân lập virus ở Thái Lan năm 1990 • Nhóm 3.4: gồm các chủng virus vaccine , phân lập virus ở Nhật năm 1970; Đài Loan năm 1990
9. • Các phân lập virus DTH ở Việt Nam thuộc nhóm 1.1, 2.1 và 2.2 • Nguyên nhân gây nên sư thất bại của chương trình kiểm soát bệnh DTH :virus thực địa có những biến đổi về độc lực, yếu tố kháng nguyên
10. III. Cây sinh dòng dịch tả heo ở Mexico III.1 Giới thiệu Dịch tễ học nghiên cứu kiểu gene để so sánh sư đa dạng, khác nhau nhằm biết rõ hơn về bệnh dịch Bằng kỹ thuật RT-PCR : giải trình tự 5’ Non- Translated Region (NTR hoặc còn gọi là NCR Non Coding Region) gồm 150 Nu, trình tự gen E2 glycoprotein gồm 190 Nu và NS5B polymerase gene gồm 409 NU .
11. • Kết quả từ 1 nghiên cứu sơ bộ đoạn gene E2 đã xác đình rằng các chủng phân lập từ bệnh dịch ở Mexico và virus vaccine PAV-250 thuộc vào nhóm 1. • Mục đích của nghiên cứu này là điều tra về di truyền biến thể của classical swine fever virus (CSFV) được cô lập từ các ổ dịch tại Mexico (1997- 2001) tại 6 khu vực địa lý bằng RT-PCR theo trinh tự của gene polymerase NS5B
12. III.2 Nguyên liệu và phương pháp 8 chủng virus được lấy từ 6 vùng khác nhau ở Mexico, các chủng tham khảo ALD ,A76, và chủng vaccine đang được sử dụng PAV-250 Các chủng được lưu giữ tại nhiệt độ 80oC cho đến khi các nghiên cứu đạt kết quả và để ly trích RNA bằng TRIZOL® Reagent (GIBCO BRL)
13. • NS5B gene được khuếch đai bằng RT-PCR sử dụng primers primers A 5' GACACTAG(TC)GCAGGCAA(TC)AG 3' B: 5' AGTGGGTTCCAGGA(AG)TACAT 3’ tạo ra 1 đoạn 449 Nu
14. Việc tinh sạch các sản phẩm PCR đựơc thực hiện bằng cách sử dụng Wizard® CR DNA Purification System (Promega). Các sản phẩm PCR được giải trình tự bởi Big Dye Sequencing (Applied biosystems) on the ABIPRISM™ 310 sequencer
15. • Xác định trình tự sắp xếp bằng cách sử dụng chương trình máy tính DNAman 3.0 (phần mềm sinh học Lynnon ) • Phân tích cây sinh dòng ( phylogenetic ) được thực hiện bởi chương trình DNAdist, 1 rễ cây bằng phương pháp Neighbor- Joining ( chương trình Neighbor ), và tạo 1 cây sinh dòng hoàn chỉnh bởi chương trình Drawtreee bằng cách sử dụng chương trình máy tinh Phylip version 3.6
16. III.3 Kết luận • Các sản phẩm khuếch đại của gene CSFV NS5B tạo ra 1 loạt trình tự có kích thước từ 413-452 Nu, từ những phân lập 413 Nu được sử dụng để làm cây sinh dòng (hình 1)
17. Hình 1: Cây sinh dòng phân lập các chủng virus CSFV từ 6 khu vực địa lý trong Mexico ( 1997- 2001 )
18. Các chủng CSFV đã được chia thành 3 nhóm di truyền, trong đó chủng Isolate8 liên quan rất chặt chẻ đến chủng tham khảo ALD .Isolate5 và Isolate9 cùng nhóm với chủng tham khảo A76, Isolates (5 & 9) nó có cùng khu vực địa lý. Chủng vaccine PAV250 không thể hiện mối quan hệ di truyền rõ ràng với bất kỳ chủng phân lập nào . Isolate6 và Isolate7 có mối quan hệ chặt chẽ mặc dù khác khu vực địa lý
19. III.4 Thảo luận 1 nghiên cứu trước đó sử dụng 11 Nu để tạo ra 1 cây sinh dòng cũng đã cho thấy chủng PAV250 không cùng nhóm các chủng phân lập CSFV Vì thực tế là các chủng đã không tuân theo 1 khuôn mẫu nhất định , không theo khu vực địa lý chúng được phân lập.
20. Mặc dù đã giới hạn số lượng virus được cô lập tai các khu vực , nghiên cứu này còn cho thấy sự đa dạng di truyền trên gene CSFV NS5B trong số các ổ dịch được cô lập , cho thấy rằng virus chịu trách nhiệm cho ổ dich ở 1 khu vực không phải có cùng 1 kiểu di truyền .
21. IV. Cây sinh dòng DTH tại Mỹ IV.1 Các chủng virus phân lập và trình tự Các chủng CSFV phân tích trong nghiên cứu này được liệt kê trong Bảng 1. Chúng được lấy từ bộ sưu tập virus của EU Reference Laboratory for CSF ( EURL, Germany ). Dịch vụ y tế động, thực vật (Aphis-USDA, USA),Instituto Colombiano Agropecuario (ICA,Colombia), and Servicio Nacional de Sanidad Animal y Calidad Agroal-imentaria (SENASA, Argentina)
22. IV.2 Ly trích RNA, RT-PCR và giải trình tự • Thu nhận các tế bào bị nhiễm PK-15 và 1 phần nguyên liệu Minced và ly trích tổng số RNA bằng việc sử dung TRIzolTM (Gibco BRL) tinh khiết • Reverse transcription (RT) các phản ứng được thực hiện bằng cách sử dụng các mồi ngẫu nhiên và khu vực gen mã hoá các glycoprotein E2 được khuếch đại bằng PCR.
23. • Bộ mồi được sử dụng tiếp theo (Paton et al., 2000) đã được sử dụng: mồi tiến trước 5′-TCR WCA ACC AAY GAG ATA GGG-3′ ( vị trí 2467-2487 từ bộ gen của chủng Alfort ) và mồi tiến sau 5′-CAC AGY CCR AAY CCR AAG TCA TC-3′ (vi trí 2738-2716 của chủng Alfort ) • Giải trình tự bằng cách sử dụng kit giải trình tự Cy5 trên máy giải trình tự tự động ALFExpress II (Amersham Biosciences).
24. IV.3 Phân tích cây sinh dòng • Các trình tự Nu được hiệu chỉnh, sự sắp xếp và phân tích được báo cáo trước đây (Paton et al, 2000). • Cây sinh dòng được tạo ra theo nguyên lý Neighbor-joining, được tính toán với DNADIST và phân hệ NEIGHBOR với cùng 1 tham số . Vẽ ra 1 cây hình dung bằng chương trình TREEVIEW phiên bản 1.6.6
25. IV.4 Kết luận và thảo luận • Trong nghiên cứu này ,bao gồm các phân lập CSFV từ 7 vùng phía bắc và trung tâm nước Mỹ . Không may mắn là không được phép lấy mẫu từ những nước khác, do thực tế là cơ quan và phân lập virus từ những trường hợp CSF không được lưu trữ để phân tích rõ hơn với những phòng thí nghiệm tương ứng.
26. • Như đã tìm thấy cho 1 số khu vực địa lý ở châu Âu(Biagetti et al., 2001; Hofmann, 1996; Stadejek et al., 1996, 1997) bằng cách gõ lệnh di truyện, những kết quả cho thấy chủng phân lập ở Mỹ có vùng gene rất khác. Trong khi các chủng phân lập ở Euro (trừ chủng Nga ; Vlasova et al. (2003) tất cả chúng khác nhau về di truyền thuộc nhóm con 2 , chủng phân lập Mỹ được phân tích thuộc nhóm con của nhóm 1 (Fig .2).
27. • Ở Cuba, Bệnh này được lưu giữ dưới sự kiểm soát cho đến năm 1993 thông qua một chương trình kiếm soát quốc gia với các chiến dịch tiêm phòng và một epidemiologi nghiêm ngặt. Tuy nhiên ,trong năm 1993-1997, bệnh dịch CFSV mới xảy ra ,kéo theo tình hình kinh tế xấu đi trên đất nước. Các chủng từ ổ dịch ở Cuba thuộc nhóm con của nhóm 1 ,2 tạo thành 1 ổ dich tại phía Đông và Tây , tương ứng .
28. • Các chủng từ Guatemala và Honduras nằm trong 1 nhóm con khác (1.3). Các chủng phân lập từ Guatemala có mối liên quan chặt chẽ với các chủng phân lập từ Honduras năm 1996, còn các chủng phân lập từ Honduras năm 1992 thì khác nhau rõ ràng. Mặc dù các ổ dịch đầu tiên không có mối quan hệ xác định, có thể vì khi đó dữ liệu dịch tễ học còn thiếu. Mặt khác có thể hiểu rằng virus được chuyển đến từ 2 nước láng giềng do thương mại
29. • Các chủng phân lập ở Nam Mỹ và Mexico hình thành 4 cụm trong nhóm con (1.1).Trong 1 nhóm , chủng phân lập từ Brazil (1987 ) và các ổ dịch ở Colombia ( 1998,1999 ) đã được nhận ra .Gần đây là ổ dịch ở Colombia năm 2002-2003 đã được xác định rõ ràng
30. • Các ổ dịch ở Colompia năm 1999 đã xảy ra , bắt nguồn từ Putumayo ở phía Nam của đất nước. Hoạt động thương mại trong lĩnh vực này (giữa biên giới Peru và Brazil ) có thể dẫn đến sự xuất hiện của virus này . Mặt khác các chủng phân lập của dịch đã được diễn ra tại trung tâm của đất nước (Zipaquira Cundinamarca). Nguyên nhân gây ra bệnh dịch 2002 và 2003 là thuộc vào các chủng phân lập ở nhóm 1.1 (Hình 2) Bệnh dịch kéo dài từ trung tâm của đất nước hướng tới các phòng ban Boyaca ,Tolima, Quindio, Bắc của Santader nhưng không hướng tới hòn đảo khác trong Caribe
31. • Brazil thực hiện chương trình nhổ tận gốc vào năm. Quốc gia này chia thành 3 lĩnh vực • (1) phía nam tiểu bang , nơi mà bệnh dịch tự do phát triển không có vaccine • (2) các tiểu bang với số lượng heo lớn nơi CSF vẫn đặc hữu và tiêm phòng ép buộc • (3) nơi sản xuất lợn còn lại của đất nước. Các dữ liệu dịch tế học của các chủng ở Brazil là không đầy đủ, cũng như không có thông tin về nơi bắt nguồn từ Bắc hay Nam ở đất nước. Do đó kết luận chỉ có thể rút ra cho những kết quả này là do các ổ dịch cũ ( khoảng 1987 ) và khắp nơi trong vùng là do sự kiện khác nhau .
32. • Mexico có 3 khu vực riêng: • (1) Các tiểu bang miền Bắc gần biên giới Mỹ cộng với bán đaỏ Yucatan là miễn CSF mà không cần tiêm phòng (2) khu vực trung tâm, nơi đã diệt tận gốc, nơi mà vaccine không được sử dụng (3) khu vực phía Nam của đất nước nằm trong vùng được kiểm soát, ở đó tiêm phòng được sử dụng 1 cách liên tục. Không có dịch được báo cáo với OIE năm 2004, nhưng có 6 ổ dịch năm 2003-2004 tương ứng. Không may mắn, không có các chủng phân lập từ những ổ dịch này có thể kiếm được.
33. Những kết quả của chúng tôi cho phép kết luận rằng tại châu Mỹ có ít nhất 3 sự kiện không liên quan đến sự xuất hiện của CSFV. Ngoài ra, bao gồm có 4 các chủng phân lập virus trong lịch sử từ những ổ dịch ở Mỹ được nghiên cứu nguồn gốc CSFV đã được thông báo đầu tiên ở Oho, USA in 1883 .Mỗi chủng phân lập ở Mỹ ,bao gồm các nghiên cứu nhóm với các chủng phân lập từ những vùng khác ở châu Mỹ. Điều này cho thấy virus CSF có thể có nguồn gốc đồng thời trên toàn thế giới, kể cả châu Á, ở đây chỉ có 3 chủng phân lập virus CSF được tìm thấy (Paton et al.,2000 ). Sau đó có 1 vài chủng đã lây lan, có thể là do đường thương mại đến 1 vài địa điểm khác trên thế giới.
34. Mặc dù 1 vài cụm virus CSF đã được xác nhận đặc điểm di truyền 1 tại các ổ dịch 1 cách rõ ràng ,sự thiếu hụt trong dữ liệu của dịch tể học và bị giới hạn số lượng các chủng phân lập đã làm cản trở lớn đến kết quả. Tuy nhiên, đáng chú ý là có 1 vài bang tại lục địa Mỹ đã phận lập được các dạng của CSFV. Điều này hiễn nhiên cho Cuba, nhưng dường như là các trường hợp cho Guatemala và Honduras ở Trung Mỹ. Cho việc thu thập 1 bức tranh rõ nét hơn, 1 sự hợp tác chặt chẽ giữa chính quyền ,thú ý và các phòng thí nghiệm chẩn đoán phân tích CSFV là cần thiết.
35. • Fig. 2. Neighbor-joining phylogenetic tree constructed from a 190 nucleotide fragment of the E2 gene. The tree was outgrouped to the sequence of the Kanagawa isolate (CSF0309). The isolates are named by their code (Table 1). Group and subgroup nomenclature is as proposed by Paton et al. (2000). Vaccine strains are in italics and underlined; ‘*’ denotes group of 11 isolates with identical sequences in the 190 b region analyzed (Table 1); bar: number of substitutions per site.
36. • Tài liệu tham khảo Sách: Công Nghệ Sinh Học trong Thú Ý - Nguyễn Ngọc Hải Web: www.elsevier.com/locate/virus /VIRAL/O_42-05.pdf?LA=1