Bài giảng Hóa sinh đại cương - Chương 4: Cấu trúc và tính chất lý hoá của protein

Nội dung text: Bài giảng Hóa sinh đại cương - Chương 4: Cấu trúc và tính chất lý hoá của protein

1. 45 Chương 4 Cấu trúc và tính chất lý-hoá của protein I. Các quan điểm khác nhau về nghiên cứu cấu trúc protein Như đã biết, protein là những phần chức năng của cơ thể, sự hình thành chức năng mới dựa trên cơ sở thành phần cấu trúc của protein, hay nói cách khác giữa chức năng và thành phần cấu trúc trong protein có liên hệ mật thiết với nhau. Từ đó sự nghiên cứu cấu trúc protein có thể dựa trên các quan điểm: nghiên cứu thành phần cấu trúc hoặc dựa vào chức năng sinh học để tìm hiểu cấu trúc của chúng. Chẳng hạn, việc nghiên cứu xác định cấu trúc bậc I của phân tử protein là bước đầu tiên quan trọng để xác định phân tử hoạt tính sinh học và tính chất hoá lý của protein, là cơ sở để xác định cấu trúc không gian của phân tử protein. Dựa vào cấu trúc không gian của các phân tử protein tương đồng, có thể dự đoán sự định vị cầu disunfua, cấu trúc không gian của protein nghiên cứu. Ngược lại sự xuất hiện một bệnh lý đặc trưng nào đó liên quan đến thay đổi chức năng của protein mà nguyên nhân chỉ là thay đổi 1gốc amino acid trong phân tử. Ví dụ: bệnh thiếu máu hồng cấu hình lưỡi liềm, khi nghiên cứu cấu trúc bậc I của hemoglobin bình thường và bệnh lý đã xác định được đó là do gốc amino acid glutamic ở vị trí thứ 6 trong chuỗi β của hemoglobin A (bình thường) bị thay thế bằng gốc amino acid valine II. Các kiểu liên kết trong cấu trúc protein 2.1. Các liên kết cộng hoá trị Trong phân tử protein ngoài các liên kết cộng hoá trị bình thường, người ta thường nhắc đến hai kiểu liên kết cộng hoá trị đặc biệt có ý nghĩa quan trọng đối với cấu trúc và chức năng của chúng đó là: - Liên kết peptide (xem chương 3). - Liên kết disunfua (-S-S-). Liên kết disunfua là liên kết đồng hoá trị tạo thành do sự kết hợp giữa hai phân tử cysteine với nhau loại đi 2H (hình 4.1). Liên kết disunfua (còn gọi là cầu disunfua) có thể hình thành giữa hai phân tử cysteine trong cùng một chuỗi polypeptide hoặc giữa hai cysteine thuộc hai chuỗi polypeptide khác nhau. Cầu disunfua có vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc bậc III của phân tử protein. Những phân tử protein càng chứa nhiều cầu disunfua thì càng chặt chẽ, vững bền. những protein không tan như protein của lông, móng, tóc, sừng rất vững bền với các tác nhân hoá học, chứa tới 12% là cysteine
2. 46 Oxy hóa Hình 4.1 Sự hình thành cầu disulfua giữa hai phân tử cysteine 2.2. Các liên kết yếu làm ổn định cấu trúc protein 2.2.1. Liên kết hydro Là tương tác yếu hình thành giữa một nguyên tử mang điện tích âm (gọi là nguyên tử nhận A-acceptor) và một nguyên tử hydro (H) đang nằm D  H + A ⇔ D  H ••• A Liên kết hydro a b c Hình 4.2 Một số liên kết hydro quan trọng trong hệ thống sống Ghi chú: a) giữa hydro của một ancohol và oxy của nước; b) giữa nhóm carbonyl keto và nước; c) giữa nhóm peptide trong polypeptide;
3. 47 trong một nối cộng hoá trị với một nguyên tử khác (gọi là nguyên tử cho D- donnor). Nối cộng hoá trị giữa D và H phải là nối phân cực và đám mây điện tử của A phải mang những điện tử không liên kết có khả năng thu hút điện tích δ+ của H. Năng lượng cần để phá vở một liên kết hydro là khoảng 5 kcal mol-1. Một đặc điểm quan trọng của các liên kết hydrogengen là H, nguyên tử nhận A, nguyên tử cho D đều xếp trên một đường thẳng. Nguyên tử N trong liên kết N-H cũng như O trong liên kết O-H đều là những nguyên tử cho chính. Trong hệ thống sống đó là các nhóm amine (-NH2) và hydroxyl (-OH), sự hiện diện của các nhóm này khiến cho các phân tử có mang chúng dể hoà tan trong nước do có sự hình thành các liên kết hydrogengen giữa chúng. Đặc biệt, các phân tử nước H2O - nhân tố chủ yếu của vật chất sống luôn luôn hình thành một mạng lưới đều đặn những hình tứ diện dù ở thể lỏng hay thể rắn. Hình 4.3 Sơ đồ cấu trúc mạng lưới hình thành bởi các phân tử H2O - Nguyên tử oxy biểu thị bằng các vòng tròn lớn - Nguyên tử hydro được biểu thị bằng các vòng tròn nhỏ 2.2.2. Liên kết ion Là tương tác tĩnh điện giữa hai nhóm có điện tích ngược dấu. Trong nhiều trường hợp chất vô cơ, điện tử liên kết luôn luôn bị hút về
4. 48 phía nguyên tử có độ âm điện cao hơn gây ra sự phân li cation (nguyên tử tích điện tích âm) và anion (nguyên tử tích điện dương), ví dụ: NaCl → Na+ + Cl- Vì điện tử liên kết không dược phân chia đồng đều cho hai nguyên tử nên liên kết này không được xếp vào loại các liên kết công hoá trị. Khác với các liên kết cộng hoá trị hay liên kết hydro, các liên kết ion không có định hướng trong không gian vì điện trường là không đồng đều quanh ion. Trong môi trường nước, các anion và cation luôn luôn được vây bọc bởi các phân tử H2O tạo thành một lớp vỏ bọc ngoài nên không thể liên kết trực tiếp với các anion và cation khác. Do đó, người ta cho rằng tương tác tĩnh điện này không đóng vai trò quan trong quyết định cấu hình không gian của các phân tử hữu cơ. 2.2.3. Liên kết Van der Waals Là các tương tác không đặc hiệu xuất hiện giữa hai nguyên tử khi chúng tiến lại gần nhau. Tương tác này không do sự phân phối lệch của các điện tử giữa hai phân tử mà do các biến động thoáng qua của đám mây điện tử gây ra sự phân cức nhất thời trên phân tử. Liên kết Van der Waals là kết quả của lực hút và lức đẩy. Hai lực này cân bằng ở một khoảng cách nhất định, đặc trưng cho từng loại nguyên tử. Khoảng cách này được gọi là bán kính Van der Waals. Đây là lực liên kết yếu nhất, với giá trị chỉ khoang 1 k cal mol-1. Để liên kết này thật sự có ý nghĩa, nó phải tồn tại một số lượng lớn, nghĩa là bề mặt tiếp xúc giữa hai phân tử phải cực đại. Điển hình là khi một phân tử có mang một hốc có hình dáng phù hợp với chổ lồi trên phân tử kia như trường hợp tương tác giữa kháng nguyên - kháng thể, giữa enzyme - cơ chất. 2.2 4. Liên kết kị nước (tương tác kị nước) Các phân tử không phân cực, tức là các phân tử không chứa nhóm ion hoá lẫn liên kết phân cực, đều không hoà tan trong nước, chúng là những phân tử kị nước. Lực thúc đẩy các phân tử hay các vùng không phân cực của các phân tử liên kết với nhau thay vì với các phân tử H2O (đẩy phân tử H2O ra ngoài) được gọi là liên kết kị nước. Đây không phải là một lực liên kết đúng nghĩa mà là khuynh hướng loại trừ các nhóm không phân cực ra khỏi mạng lưới nước. Còn liên kết thật sự tồn tại giữa các phân tử không phân cực là liên kết Van der Waals. Các tương tác kị nước đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định các protein, các phức protein với các phân tử khác cũng như sự phân bố các protein trong các màng sinh học.
5. 49 III. Hình dạng kích thước và cấu trúc của phân tử protein 3.1. Hình dạng kích thước Protein có khối lượng phân tử (Mr) tương đối lớn và thay đổi trong một dãi rộng từ hơn 10 nghìn đến hàng trăm nghìn dalton (bảng 4.1). Các phân tử protein có thể có dạng cầu (kể cả hình bầu dục) hoặc dạng sợi. Thuộc về dạng cầu hầu hết là những protein có hoạt tính xúc tác hoặc vận chuyển như enzyme, hemoglobin, globulin tỷ lệ giữa trục dài và trục ngắn của phân tử bé hơn hoặc bằng 20. Ở các protein hình sợi tỷ lệ này lớn hơn nhiều ví dụ tropocolagen (đơn vị cấu trúc cơ sở của colagen) có O O chiều dài khoảng 3000 A , đường kính khoảng 15A . Các protein hình sợi tương đối trơ về mặt hoá học, chủ yếu giữ chức năng cấu trúc chống đỡ cơ học ví dụ: colagen của da, xương, sụn, gân, răng; keratin của tóc, lông; fibroin của tơ; myosine của cơ v.v 3.2. Cấu trúc bậc nhất (cấu trúc sơ cấp) Cấu trúc bậc I biểu thị thành phần và trình tự các amino acid trong phân tử protein, cấu trúc này được giữ vững bằng liên kết peptide-liên kết cộng hoá trị (xem chương 3). Cấu trúc bậc I là bản dịch của mã di truyền, việc xác định cấu trúc bậc I là cơ sở để tổng hợp nhân tạo protein bằng phương pháp hoá học hoặc bằng các biện pháp công nghệ sinh học. Ví dụ: năm 1953, lần đầu tiên Frederick Sanger (người Anh) đã xác định trình tự sắp xếp các amino acid trong phân tử insulin và đến năm 1966 protein này lần đầu tiên đã được tổng hợp bằng phương pháp hoá học. Ngày nay người ta đã có thể dùng vi khuẩn Escherichia coli để tổng hợp insulin (sẽ trình bày kỹ hơn ở chương 6). 3.2.1. Cấu trúc bậc I của một số protein đã biết Bằng các phương pháp xác trình tự amino acid của protein, ngoài một số loại protein đã biết rõ cấu trúc bậc I như insulin đã được trình bày ở chương 3, hiện nay nhiều loại protein khác đã biết được trình tự các amino acid trong chuỗi polypeptide như: ribonuclease là một protein có 124 amino acid, nối với nhau thành một chuỗi (hình 4.4); hemoglobin là protein có 4 chuỗi polypeptide, 2 chuỗi α ( mỗi chuỗi 141 amino acid) và 2 chuỗi β (mỗi chuỗi 146 amino acid); tripsinogen bò (229 amino acid); chimotrypsin bò (229 amino acid); alcohol dedhyrogenase ngựa (374 amino acid); glutamate dehdrogenase bò (500 amino acid) v.v 3.1.2. Tính quy luật trong cấu trúc bậc nhất của protein Những protein đồng thể của những loài khác nhau có một số gốc amino acid tương đối không đổi ở những vị trí đặc biệt và có những gốc amino acid thay đổi, nghĩa là ở những loài khác nhau, các amino acid khác
6. 50 có thể thay thế cho nhau. Thí dụ insulin của nhiều loài khác nhau có những amino acid khác nhau ở vị trí 8, 9, 10 (bảng 4.1), tương tự như đối với oxytocin, vasopressin, vasotocin ở một số loài động vật khác. Hình 4.4 Cấu trúc bậc nhất của ribonuclesae của bò Bảng 4.1 Sự thay thế amino acid trong chuỗi A của insulin ở một số loài Loài Vị trí của amino acid 8 9 10 Bò Ala Ser Val Lợn Thr Ser Ile Cừu Ala Gly Val Ngựa Thr Gly Ile Cá nhà táng Thr Ser Ile Người Thr Ser Ile Chó Thr Ser Ile Thỏ Thr Ser Ile 3.3 Cấu trúc bậc II (cấu trúc thứ cấp) Biểu thị của cấu trúc bậc II là sự xoắn của chuỗi polypeptide, là tương tác không gian giữa các gốc amino acid ở gần nhau trong mạch polypeptide tạo thành hai dạng xoắn α và xắn β. Nói cách khác, là dạng không gian cục bộ của từng phần trong mạch polypeptide. Cấu trúc này
7. 51 được làm bền nhờ các liên kết hydro được tạo thành giữa liên kết peptide ở kề gần nhau, cách nhau những khoảng xác định. Xoắn α Liên kết hydro Phiến gấp β Hình 4.5 Các kiểu xoắn trong cấu trúc bậc II của protein 3.3.1. Phương pháp nghiên cứu cấu trúc bậc II Hiện nay người ta có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau để phân tích cấu trúc bậc II của phân tử protein như phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại- khả kiến, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, trao đổi hydro nặng, đo độ chiết quang v.v , cơ sở của một số phương pháp thường hay được dùng để phân tích cấu trúc bậc II của protein dựạ trên những nguyên tắc riêng sau: - Phổ hồng ngoại: phổ hấp thụ hồng ngoại chính là phổ dao động quay, vì khi hấp thụ bức xạ hồng ngoại thì cả chuyển động dao động và chuyển động quay đều bị kích thích. Phổ quay của phân tử không những là phương pháp quý để nhận dạng các chất mà còn cho phép xác định chính xác khoảng cách giữa các hạt nhân nguyên tử và góc giữa các kiên kết. - Phổ tử ngoại- khả kiến: Khi phân tử hấp thụ bức xạ tử ngoại hoặc khả kiến thì những eletron hoá trị của nó bị kích thích và chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Vì thế phổ thu được gọi là phổ tử ngoại khả kiến (Ultraviolet and Visible Spectra, viết tắt là UV-Vis) và cũng được gọi là phổ hấp thụ eletron. Mỗi trạng thái eletron ứng với một đường cong thế năng và do đó ứng với một giá trị xác định của tần số dao động riêng của phân tử.
8. 52 - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Dựa trên nguyên lí sử dụng các nơtron và các proton trong hạt nhân nguyên tử, số lượng spin của proton và nơtron đều bằng nhau và bằng 1/2. Tuỳ thuộc vào việc các spin của những hạt nucleon đó có cặp đôi hay không mà hạt nhân của nguyên tử có thể được đặc trưng bởi một số lượng tử spin hạt nhân (I) bằng không hay khác không. Nếu ở hạt nhân có một spin không cặp đôi thì I= 1/2, nếu có nhiều spin không cặp đôi thì I ≥ 1. Nếu chiếu vào mẫu dung dịch protein sóng vô tuyến có tần số xác định, thì các hạt nhân ở mức năng lượng thấp sẽ hấp thụ năng năng lượng của sóng vô tuyến để chuyển lên mức cao. Người ta nói lúc đó đã xẩy ra cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance, viết tắt là NMR). Từ đó người ta đã thiết kế máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân bao gồm ống chứa dung dịch mẫu được đặt giữa từ trường của một nam châm mạnh. Một máy phát cung cấp sóng radio. Một máy thu sóng radio theo dõi sự hấp thụ năng lượng thông qua cuộn cảm bao quanh mẫu, tín hiệu cộng hưởng từ được khuyếch đại, phân tích và truyền sang bút tự ghi để vẽ phổ. Máy cộng hưởng từ hạt nhân được phát hiện từ năm 1946, ứng dụng vào hoá hữu cơ năm 1953, ngày nay càng được phát triển và hoàn thiện. Nó là công cụ đắc lực cho các nhà hoá học trong việc xác định cấu trúc phân tử protein. - Trao đổi hydro nặng: Dựa trên nguyên tắc các hydro nặng H2 (thường được ký hiệu là D-deuterium) và H3 (thường được ký hiệu là T tritium) để thay thế cho các hydro bình thường đang nằm trong các liên kết trong cấu trúc phân tử protein. Từ đó nhờ hình ảnh phổ đặc trưng được phát ra từ các loại hydro nặng đó để xác định cấu trúc của phân tử. 3.3.2. Cấu trúc bậc II của một số protein đã biết Theo Paulin và Cori (1951) cấu trúc bậc II của protein bao gồm 2 kiểu chính là xoắn α và phiến gấp β Bảng 4. 2. Số lượng xoắn α và phiến gấp β trong chuỗi đơn một số protein số gốc (%) Protein (số gốc) Xoắn α Phiến gấp β Chymotrypsin (247) 14 45 Ribonuclease (124) 26 35 Carboxypeptidase (397) 38 17 Cytochrom C (104) 39 0 Lysozyme (129) 40 12 78 0 Myoglobin (153)
9. 53 Các tế bào Sợi nhỏ Tiền fibrin Tiền sợi nhỏ Hai sợi xoắn Xoắn α Hình 4.6 Lát cắt ngang sợi tóc với chuỗi xoắn α keratin Ở trong tóc người ta tìm thấy keratin (hình 4.6) là loại protein có hai dạng cấu trúc: dạng α bình thường và dạng β duỗi thẳng.; cấu trúc phiến gấp β tìm thấy trong fibroin của tơ. trong các protein khác nhau cũng thay đổi khá nhiều. Ví dụ trong hemoglobin và mioglobin là 75%; lisozym là 35%; ribonuclease là 17% - Ngoài ra còn có kiểu xoắn colagen được tìm thấy trong phân tử colagen (hình 4.7), đơn vị cấu trúc của nó là tropocolagen bao gồm 3 mạch polypeptide bện vào nhau thành một dây cáp siêu xoắn (vì mỗi mạch đơn có cấu trúc xoắn chiều cao của mỗi gốc xoắn trên trục siêu xoắn này là 2,9 anstron, một vòng xoắn là 3,3 Hình 4.7 Cấu trúc kiểu xoắn colagen gốc amino acid . Ba mạch Cấu trúc xoắn α hiện nay polypeptide trong “dây cáp” nối được tìm thấy trong nhiều loại protein với nhau bằng các liên kết khác nhau Mặt khác tỷ lệ % xoắn α hydro.
10. 51 3.4. Cấu trúc không gian của protein 3.4.1. Định nghĩa và khái niệm về cấu trúc không gian Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, người ta đã nghiên cứu cấu trúc không gian ba chiều của các phân tử protein, đó là hình dạng do sự xoắn để tạo xoắn α và phiến gấp β tạo thành cấu trúc bậc II, đó là hình dạng do sự cuộn lại của các chuỗi có cấu trúc bậc II để tạo thành cấu trúc bậc III và vị trí của sự sắp xếp các protein có cấu trúc bậc III đó trong không gian để tạo thành cấu trúc bậc IV (hình 4.8). Bậc I Bậc II Bậc III Bậc IV Hình 4.8 Sơ đồ các bậc cấu trúc của phân tử protein Trong cấu trúc không gian ngoài liên kết hydro thì liên kết cầu disulfua trong cấu trúc bậc II và đặc biệt trong cấu trúc bậc III có ý nghĩa hết sức quan trọng để giữ cấu trúc cuộn khúc của chuỗi polypeptide thành khối. Đặc trưng cho potein hình cầu, là tương tác không gian giữa các gốc amino acid ở xa nhau trong mạch polypeptide. Trong nhiều protein cầu có chứa các gốc Cys tạo nên liên kết disulfua giữa các gốc Cys xa nhau trong mạch polypeptide làm cho mạch bị cuộn lại. Ngoài ra cấu trúc bậc III còn được giữ vững bằng các loại liên kết khác như Van der Waals, liên kết hydro, liên kết tĩnh điện giữa các gốc amino acid v.v Cấu trúc bậc IV chỉ đặc trưng cho những phân tử protein có cấu trúc từ hai hay nhiều chuỗi protein hình cầu, tương tác với nhau sắp xếp trong không gian tạo nên. Mỗi một chuỗi polypeptide đó được gọi là một tiểu đơn vị (subunit), chúng gắn với nhau nhờ các liên kết hydro, tương tác Van der Waals giữa các nhóm phân bố trên bề mặt của các tiểu đợn vị để làm bền cấu trúc bậc IV.
11. 52 Như vậy ta có thể định nghĩa một cách ngắn gọn cấu trúc không gian của protein là hình dạng của phân tử protein được cấu thành do sự sắp xếp trong chuỗi và giữa các chuỗi polypeptide trong không gian. 3.4.2. Xác định khối lượng phân tử của protein Để xác định khối lượng của phân tử protein người ta có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau như: phương pháp khuyếch tán, phương pháp phân tích rơnghen, phương pháp tán xạ ánh sáng v.v Tuy nhiên, các phương pháp khác nhau thường cho những kết quả khác nhau. Sau đây xin giới thiệu một số phương pháp có độ tin cậy cao và thường được sử dụng để xác định khối lượng phân tử protein. - Phương pháp ly tâm siêu tốc Dựa trên sự xác định tốc độ lắng (hằng số lắng) của protein trong dung dịch chịu sự ly tâm tốc độ rất lớn (hàng trăm ngàn vòng trong 1 phút) rồi tính khối lượng phân tử (Mr) theo công thức RTS Mr = D(1- VP) Trong đó R là hằng số khí tính theo erg mol-1 độ-1, T là nhiệt độ tuyệt đối, S là hằng số lắng tính theo đơn vị Svedberg (đơn vị Svedberg được ký hiệu bằng chữ S và bằng 10-13 giây), D là hệ số khuyếch tán, V là thể tích riêng phần của protein, P là tỷ trọng của dung môi. Bảng 4.3 Mối liên quan giữa hằng số lắng (S) và khối lượng phân tử của một số protein Protein Trị số S Khối lượng (đơn vị Svedbrg) (KDa) Chất ức chế pancreatic tripsin 1 6,520 Cytochrom C 1,83 12,310 Ribonuclease A 1,78 13,690 Myoglobulin 1,97 17,800 Tripsin 2,5 23,200 Carbonic anhydrase 3,23 28,800 Concanavalin A 3,8 51,260 Malate dehydrogenase 5,76 74,900 Lactate dehydrogenase 7,54 146,200
12. 53 - Phương pháp điện di Dựa trên nguyên tắc là khả năng di chuyển và phân bố trên giá thể (thường là gel polyacrylamide hay agarose) của từng loại protein trong điện trường. So sánh với các protein đã biết trước khối lượng (protein chuẩn) để xác định khối lượng protein mẫu cần tìm. Khối lượng (hay trọng lượng phân tử Mr) được xác định tương quan với sự di động điện di của một phân tử protein trên gel polyacrylamide chứa SDS (SDS-PAGE). Người ta lập đồ thị chuẩn theo log Mr của các protein đã biết khối lượng (marker) tỷ lệ hay tương quan đối với sự di động tương đối của các protein. Căn cứ vào đồ thị này sẽ tính được Mr của protein chưa biết khối lượng phân tử. Hình 4.9. Protein chưa biết Log Mr Sự di động tương đối Hình 4.9 Cách lập đồ thị chuẩn để tính Mr của protein - Phương pháp sắc ký lọc gel (lọc sàng phân tử) Người ta có thể dùng phương pháp sắc ký lọc gel để phân tách các protein có khối lượng phân tử và kích thước khác nhau. Gel được dùng thường là sephadex. Đó là một polysaccharide đặc biệt, hydrate hoá rất mạnh thành những hạt gồm những phân tử polysaccharide kết hợp với nhau bằng những liên kết ngang tạo nên những lỗ “rây” phân tử trong không gian với các lỗ có kích thước nhất định (liên kết ngang càng nhiều thì lỗ rây càng bé và ngược lại). Sephadex được nhồi vào cột cùng với dung dịch đệm rồi cho hỗn hợp protein chảy qua, dung dịch protein xuống cột theo trọng lực, các phân tử phân tử protein nhỏ có thể lọt vào lỗ rây nên chảy xuống cột chậm hơn các phân tử protein lớn không lọt vào lỗ rây (hình 4.10). Kết quả là hứng được riêng từng loại protein sau những thời gian nhất định. Xác định khối lượng protein bằng cách dùng phương pháp ngoại suy với một số protein mẫu đã biết khối lượng phân tử.
13. 54 Hình 4.10 Sơ đồ minh hoạ sắc ký lọc gel A-Hỗn hợp gồm cả phân tử lớn và nhỏ B- Các phân tử nhỏ chui vào sâu trong lỗ gel C- Các phân tử lớn đang được rút ra ngoài còn các phân tử nhỏ tạm thời được giữ lại 3.4.3. Cấu trúc không gian một số protein đã biết Nhờ sự phát triển ngày càng tiến bộ, ngày nay người ta đã biết cấu trúc bậc I cũng như không gian của nhiều loại protein có vai trò quan trọng trong cơ thể ( xem bảng 1.1). Ngoài cấu trúc không gian của một số protein đã giới thiệu trong phần cấu trúc bậc II ở trên, từ lâu người ta cũng đã biết cấu trúc không gian (bậc III và IV) của nhiều protein có vai trò đặc biệt quan trọng khác như: hemoglobin là protein được nhắc đến nhiều nhất, có khối lượng 64.5 kDa, được cấu trúc từ 547 amino acid nằm trong 4 chuỗi polypeptide, 2 chuỗi α và 2 chuỗi β; myoglobin chỉ gồm một chuỗi polypeptide kết hợp với nhân hem và chymotripsin là protein có khối lượng 22.6 kDa, cấu tạo từ 241 amino acid tạo thành 3 chuỗi polypeptide (hình 4.11). 3.4.4. Các điều kiện làm bền vững cấu trúc không gian Như đã biết cấu trúc không gian của phân tử protein được ổn định ngoài nhờ một số liên kết disulfua bền vững, thì phần lớn là nhờ các liên kết yếu như liên kết hydro, liên kết Van der Waals v.v Vì vậy các điều kiện để làm ổn định cấu trúc của protein là phải tránh những tác động có
14. 55 thể làm phá vở những liên kết đó như: tác động mạnh của cơ học, nhiệt độ, độ pH, các muối kim loại nặng v.v (sẽ được giới thiệu kỹ hơn trong mục biến tính protein ở phần sau). Chymotripsin Myoglobin Hemoglobin Hình 4.11 Cấu trúc của không gian của một số phân tử protein 3.4.5. Tính quy luật trong cấu trúc bậc IV của protein Các protein có cấu trúc bậc IV, phân tử có thể được cấu tạo từ hai cho tới hàng trăm tiểu đơn vị. Tuy nhiên phần lớn các phân tử protein được cấu trúc từ các tiểu đơn vị đồng nhất hoặc từ các nhóm tiểu đơn vị giống nhau, vì thế phân tử protein thường được cấu tạo đối xứng. Ví dụ: cấu trúc không gian protein được xác đinh đầu tiên là hemoglobin có khối lương phân tử 64,5 Kda, gồm 4 chuỗi polypeptide, hai chuỗi α (141 amino acid mỗi chuỗi) và hai chuỗi β (146 amino acid mỗi chuỗi). Nhờ phân tích cấu trúc bằng tia X Max Peutz và John Kendrew (1959) đã phát hiện sự sắp xếp các tiểu đơn vị trong hemoglobin thành cặp đối xứng, mỗi một cặp gồm một tiểu đơn vị α và một tiểu đơn vị β . Vì
15. 56 vậy, có thể coi hemoglobin có cấu trúc 4 tiểu đơn vị hay 2 tiểu đơn vị (mỗi tiểu đơn vị gồm cả α và β). Những protein cấu trúc từ các tiểu đơn vị đồng nhất có một hay một số nhất định kiểu đối xứng như đối xứng quay tròn hay xoắn ốc. Như vậy các tiểu đơn vị có thể xếp chồng lên nhau quanh một hoặc một số trục hay là đường xoắn ốc. Hình 4.12 Hai kiểu đối xứng vòng tròn trong cấu trúc protein Trong cấu trúc đối xứng quay tròn các tiểu đơn vị sắp xếp xung quanh một trục tạo thành dạng cấu trúc đóng, các protein có cấu trúc đối xứng đường xoắn ốc tạo thành cấu trúc dạng mở mà những tiểu đơn vị có thể xếp thêm vào theo đường xoắn ốc. Có nhiều dạng đối xứng quay tròn mà dạng đơn giản nhất là đối xứng vòng tròn, ở đó các tiểu đơn vị được sắp xếp bao quanh một trục duy nhất (hình 4.12). Ngoài ra trong sự đối xứng quay tròn có thể phân bố phức tạp hơn còn được gọi là đối xứng hai mặt, thậm chí hai mươi mặt như ở cấu trúc vỏ của một số loại vius. Trong một số ít trường hợp phân tử protein có thể gồm nhiều tiểu đơn vị không đồng nhất thì cấu trúc của chúng có thể không mang tính đối xứng và rất phức tạp. IV. Tính chất lý -hoá của protein 4.1. Tính tan của protein Các loại protein khác nhau có khả năng hoà tan dễ dàng trong một số loại dung môi nhất định, chẳng hạn như albumin dễ tan trong nước; globulin dễ tan trong muối loãng; prolamin tan trong ethanol, glutelin chỉ tan trong dung dịch kiềm hoặc acid loãng v.v 4.2. Tính ngậm nước của protein Trong môi trường nước, protein kết hợp với nước trương lên trở thành dạng keo hay nói cách khác protein ở trạng thái hydrate hoá, các phân tử nước bám vào các nhóm ưa nước trong phân tử protein như -NH2, -COOH , lớp áo nước bao quanh phân tử protein là một trong các yếu tố
16. 57 làm bền vững cấu trúc, ngăn cách các phân tử protein không cho chúng dính vào nhau để thành tủa. 4.3. Độ nhớt của dung dịch protein Khi protein hoà tan trong dung dịch, mỗi loại dung dịch của những protein khác nhau có độ nhớt khác nhau (bảng 4.3). Người ta có thể lợi dụng tính chất này để xác định khối lượng phân tử của protein (độ nhớt càng cao thì khối lượng phân tử càng cao). Bảng 4.4 Độ nhớt của một số protein Protein Nồng độ % Độ nhớt tương đối (trong nước) (của nước =1) Gelatin 3,0 4,54 Albumin trứng 3,0 1,20 Gelatin 8,0 14,2 Albumin trứng 8,0 1,57 4.4. Hằng số điện môi của dung dịch protein Khi thêm các dung môi hữu cơ trung tính như ethanol, aceton vào dung dịch protein trong nước thì độ tan của protein giảm tới mức kết tủa do giảm mức độ hydrate hoá của các nhóm ion hoá của protein, lớp áo mất nước, các phân tử protein kết hợp với nhau thành tủa. Như vậy, hằng số điện môi của dung môi làm ngăn cản lực tĩnh điện giữa các nhóm tích điện của protein và nước. Mối liên hệ đó được đặc trưng bởi biểu thức: L1 - l2 F = D r2 Trong đó: D - hằng số điện môi của dung dịch F- lực tĩnh điện giữa các ion tích điện L1 , l2 - điện tích các ion, r - khoảng cách giữa các ion Ở đây lực tĩnh điện giữa các ion tỷ lệ nhgịch với hằng số điện môi và khoảng cáhc giữa các ion protein. 4.5. Tính chất điện li của protein Cũng như các amino acid, protein là chất điện li lưỡng tính vì trong phân tử protein có nhiều nhóm phân cực mạnh (gốc bên R) của amino acid ví dụ: nhóm COOH thứ hai của Asp, Glu; nhóm NH2 của Lys; nhóm OH
17. 58 của Ser, Thr, Tyr v.v Trạng thái tích điện của các nhóm này phụ thuộc vào pH của môi trường. Ở một pH nào đó mà tổng điện tích (+) và điện tích (-) của phân tử protein bằng không, phân tử protein không di chuyển trong điện trường thì giá trị pH đó gọi là pHi (isoeletric-điểm đẳng điện) của protein. Như vậy protein chứa nhiều Asp, Glu (amino acid có tính acid mạnh) thì pHi ở trong vùng acid, ngược lại nhiều amino acid kiềm như Lys, Arg, His thì pHi ở trong vùng kiềm. Ở môi trường có pH pHi phân tử protein thể hiện tính acid, cho ion H+, do đó số điện tích âm lớn hơn số điện tích dương, protein là một đa anion, tích điện âm. Bảng 4.5 Giá trị pHi của một số protein Protein pHi Protein pHi Pepsin 1,0 Globulin sữa 5,2 Albumin trứng 4,6 Hemoglobin 6,8 Casein 4,7 Ribonuclease 7,8 Albumin huyết 4,9 Tripsin 10,5 thanh Cytochrom C 10,6 Gelatin 4,9 Prolamin 12,0 Trong môi trường có pH = pHi , protein dễ dàng kết tụ lại với nhau vì thế người ta lợi dụng tính chất này để xác định pHi của protein cũng như để kết tủa protein. Mặt khác do sự sai khác nhau về pHi giữa các protein khác nhau, có thể điều chỉnh pH của môi trường để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng. 4.6. Sự kết muối của dung dịch protein Muối trung tính có ảnh hưởng rõ tới độ hoà tan của protein hình cầu: với nồng độ thấp chúng làm hoà tan nhiều protein. Tác dụng đó không phụ thuộc vào bản chất của muối trung tính, mà phụ thuộc vào nồng độ muối và số điện tích của mỗi ion trong dung dịch, tức là phụ 2 thuộc vào lực ion µ của dung dịch (µ = 1/2 ∑ C1 Z1 trong đó ∑ là ký hiệu của tổng, C1 là nồng độ của mỗi ion, Z1 là điện tích của mỗi ion). Các muối có ion hoá trị 2 (MgCl2, MgSO4 ) làm tăng đáng kể độ tan của protein hơn các muối có ion hoá trị 1 (NaCl, NH4Cl, KCl ). Khi tăng đáng kể nồng độ muối trung tính thì độ tan của protein bắt đầu giảm và ở nồng độ muối rất cao, protein có thể bị tủa hoàn toàn.
18. 59 Các protein khác nhau tủa ở những nồng độ muối trung tính khác nhau. Người ta sử dụng tính chất này để chiết xuất và tách riêng từng phần protein khỏi hỗn hợp. Đó là phương pháp diêm tích (kết tủa protein bằng muối). Thí dụ dùng muối amonium sulfate 50% bão hoà kết tủa globulin và dung dịch amonium sulfate bão hoà để kết tủa albumin từ huyết thanh. 4.7. Biểu hiện quang học của protein Cũng như nhiều chất hoá học khác, protein có khả năng hấp thụ và bức xạ xạ ánh sáng dưới dạng lượng tử hγ. Vì vậy có thể đo cường độ hấp thụ của protein trong dung dịch hay còn gọi là mật độ quang thường ký hiệu bằng chữ OD (Optical Density). Dựa trên tính chất đó người ta đã sản xuất ra các loại máy quang phổ hấp thụ để phân tích protein. Nhìn chung protein đều có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến (từ 350nm- 800nm) và vùng tử ngoại (từ 320nm xuống tới 180nm). Trong vùng ánh sáng khả kiến protein kết hợp với thuốc thử hấp thụ mạnh nhất ở vùng ánh sáng đỏ 750nm (định lượng protein theo Lowry). Đối với vùng tử ngoại dung dịch protein có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở hai vùng bước sóng khác nhau: 180nm-220nm và 250nm - 300nm. Ở bước sóng từ 180nm-220nm đó là vùng hấp thụ của liên kết peptide trong protein, cực đại hấp thụ ở 190nm. Do liên kết peptide có nhiều trong phân tử protein nên độ hấp thụ khá cao, cho phép định lượng tất cả các loại protein với nồng độ thấp. Tuy nhiên vùng hấp thụ này của các liên kết peptide trong protein có thể bị dịch về phía có bước sóng dài hơn khi có một số tạp chất lẫn trong dung dịch protein. Mặt khác chính các tạp chất này cũng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở vùng bước sóng ở vùng bước sóng 180nm-220nm. Vì thế trong thực tế thường đo độ hấp thụ của dung dịch protein ở bước sóng 220nm-240nm. Ở bước từ 250nm-300nm là vùng hấp thụ các amino acid thơm (Phe, Tyr, Trp) có trong phân tử protein hấp thụ cực đại ở 280nm (xem chương 2). Có thể sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ của dung dịch protein ở bước sóng 280nm để định tính và định lượng các protein có chứa các amino acid thơm. Hàm lượng các amino acid thơm trong các protein khác nhau thay đổi khá nhiều, do đó dung dịch của các protein khác nhau có nồng độ giống nhau có thể khác nhau về độ hấp thụ ở bước sóng 280nm.Và được đánh giá bằng hệ số tắt, ví dụ: hệ số tắt của albumin huyết thanh bò băng 6,7 khi cho ánh sáng có bước sóng 280 nm đi qua 1 cm dung dịch có nồng độ 10 mg/ml; trong khi hệ số tắt của kháng thể IgG bằng 13,6. Ngoài ra có nhiều chất khác trong dung dịch cũng có ảnh hưởng đến độ hấp thụ protein. Vì vậy, các phương pháp đo độ hấp thụ ở
19. 60 vùng ánh sáng tử ngoại thường được dùng để định lượng protein đã được tinh sạch hoặc để xác định protein trong các phân đoạn nhận được khi sắc ký tách các protein qua cột. 4.8. Kết tủa thuận nghịch và không thuận nghịch protein Khi protein bị kết tủa đơn thuần bằng dung dịch muối trung tính có nồng độ khác nhau hoặc bằng alcohol, aceton ở nhiệt độ thấp thì protein vẫn giữ nguyên được mọi tính chất của nó kể cả tính chất sinh học và có thể hoà tan trở lại gọi là kết tủa thuận nghịch. Các yếu tố kết tủa thuận nghịch được dùng để thu nhận chế phẩm protein. Trong quá trình kết tủa thuận nghịch muối trung tính vừa làm trung hoà điện vừa loại bỏ lớp vỏ hydrate hoá của protein, còn dung môi hữu cơ háo nước phá hủy lớp vỏ hydrate nhanh chóng. Trong chế phẩm protein nhận được còn lẫn các chất đã dùng để kết tủa, cần sử dụng phương pháp thích hợp để loại bỏ các chất này. Ví dụ có thể dùng phương pháp thẩm tích để loại bỏ muối. Ngược lại kết tủa không thuận nghịch là phân tử protein sau khi bị kết tủa không thể phục hồi lại trạng thái ban đầu. Sự kết tủa này thường được sử dụng để loại bỏ protein ra khỏi dung dịch, làm ngưng phản ứng của enzyme. Một trong những yếu tố gây kết tủa không thuận nghịch đơn giản nhất là đun sôi dung dịch protein (sẽ nói kỹ hơn trong phần biến tính protein ở phần sau). 4.9. Các phản ứng hoá học của protein Cũng như các amino acid và peptide protein có các phản ứng hoá học tương tự đó là: phản ứng của các nhóm -COOH, -NH2, gốc R và phản ứng tạo màu đặc trưng của liên kết peptide như phản ứng biure (xem chương 2 và 3. Ngoài ra, còn một số phản ứng màu đặc trưng khác, có ý nghĩa quan trọng trong phát hiện protein và các gốc amio acid trong chuỗi polypeptide: 4.9.1. Phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteau Thuốc thử Folin-Ciocalteau có chứa acid phosphomolipdic và acid phos phovolframic. Các chất này làm tăng độ nhạy của phản ứng biure, mặt khác phản ứng với gốc Tyr và Trp trong phân tử protein. Các gốc amino acid này tham gia trong quá trình tạo phức chất màu xanh da trời. 4.9.2. Phản ứng với ninhydrin Tất cả các amino acid trong phân tử protein đều phản ứng với hợp chất ninhydrin tạo thành phức chất màu xanh tím, Phản ứng được thực hiện qua một số bước như sau: Dưới tác dụng của ninhydrin ở nhiệt độ cao, amino acid tạo thành NH3, CO2 và aldehit, mạch polypeptide ngắn đi môt carbon; đồng thời
20. 61 ninhydrin chuyển thành diceto oxy hindrien. Diceto oxy hindrien, NH3 mới tạo thành tiếp tục phản ứng với một phân tử ninhidrin khác để tạo thành phức chất màu xanh tím (hình 4.12) Hình 4.12 Phản ứng của protein với ninhydrin Protein cũng có thể tham gia nhiều phản ứng tạo màu khác như: phản ứng xanthproteic, các gốc amino acid Tyr, Trp, Phe trong protein tác dụng với HNO3 đặc tạo thành màu vàng và sau khi thêm kiềm sẽ chuyển thành màu nâu; phản ứng Pauli; các gốc Tyr, His trong protein tác dụng với diasobenzosulfate acid tạo thành màu đỏ anh đào; phản ứng Milon gốc Tyr tác dụng với thuỷ ngân nitrate trong HNO3 đặc tạo thành kết tủa màu nâu đất v.v V. Biến tính protein 5.1. Khái niệm chung Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa mà protein vẫn mất khả năng tạo thành dung dịch keo bền như trước và mất những tính chất ban đầu, chẳng hạn độ hoà tan giảm, tính chất sinh học bị mất gọi là sự biến tính protein. Vì vậy, đối với việc bảo quản protein, người ta thường để dung dịch protein ở nhiệt độ thấp thường là 0-4oC. Song ở nhiệt độ này dung dịch protein dần dần cũng bị biến tính, biến tính càng nhanh khi dung dịch protein càng loãng. Sự biến tính ở nhiệt độ thấp của dung dịch protein loãng được gọi là sự biến tính “bề mặt”: protein bị biến tính tạo nên một lớp mỏng trên bề mặt dung dịch, phần dưới lớp mỏng là những nhóm ưa nước nằm trong dung dịch, phần trên lớp mỏng là những gốc kỵ nước của amino acid kết hợp với nhau bởi lực Van der Waals. Ở dung dịch đặc các phân tử protein kết hợp với nhau chặt chẽ hơn do đó làm giảm bớt và hạn chế sự biến tính bề mặt. Để bảo quản tốt các chế phẩm protein như enzyme, hormon, γ-globulin kháng độc tố v.v người ta tiến hành làm đông khô (làm bốc hơi nước của dung dịch
21. 62 protein ở áp suất và nhiệt độ thấp), bột thu được có thể bảo quản được ngay cả ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong các ống hàn kín. 5.2. Các yếu tố gây biến tính Có nhiều yếu tố tác động gây ra sự biến tính protein như: nhiệt độ cao, tia tử ngoại, sóng siêu âm, acide, kiềm, kim loại nặng. Vì vậy, trong thực tế người ta rất chú ý ảnh hướng của các yếu tố có khả năng làm biến tính protein, ví dụ: khi chiết xuất và tinh chế protein, đặc biệt là các protein enzyme, cũng như khi xác định hoạt độ của chúng, phải chú ý đề phòng biến tính. Muốn vậy phải đảm bảo những điều kiện thích hợp nhất cho qui trình kỹ thuật, như tiến hành thí nghiệm trong lạnh và đảm bảo pH thích hợp của các dung dịch sử dụng. 5.3. Tính chất của protein biến tính Những thay đổi dễ thấy nhất ở protein biến tính là thay đổi tính tan, khả năng phản ứng hoá học và hoạt tính sinh học như: hemoglobin bị biến tính không kết hợp với oxy được, tripsin khi bị biến tính không thuỷ phân được protein, kháng thể biến tính mất khả năng kết hợp với kháng nguyên v.v Nghiên cứu cấu trúc không gian cho thấy khi bị biến tính phân tử protein không còn cuộn chặt như trước mà thường duỗi ra hơn, kết quả là phá vỡ cấu hình không gian cần thiết để thực hiện hoạt tính sinh học. Sự biến tính không làm đứt liên kết peptide mà làm đứt các liên kết hydro, liên kết muối v.v nối các khúc của chuỗi polypeptide hoặc các chuỗi polypeptide với nhau, vì vậy cấu trúc của nhóm kỵ nước của protein bị đảo lộn, các nhóm kỵ nước quay ra phía ngoài và các nhóm ưa nước quay vào trong, sự hydrate hoá của protein giảm (protein mất lớp áo nước) các phân tử protein dễ kết hợp với nhau, độ tan giảm và có thể kết tủa. Sự biến đổi cấu trúc khiến protein biến tính dễ được tiêu hoá hơn protein nguyên thuỷ, thí dụ tripsin không thuỷ phân ribonuclease nguyên thuỷ, nhưng phân giải rất nhanh ribonuclease biến tính. Người ta phân biệt hai dạng biến tính: biến tính thuận nghịch (biến tính trở lại dạng ban đầu với tính chất và chức năng nguyên thuỷ của nó, đó là sự hoàn nguyên) và biến tính không thuận nghịch (protein không trở lại dạng ban đầu của nó). Lòng trắng trứng luộc là một ví dụ điển hình về biến tính không thuận nghịch, còn về biến tính thuận nghịch ta có thể nêu trường hợp tripsin: đun nóng tripsin ở pH 3 tới 90oC, cấu trúc của phân tử tripsin bị biến đổi (biến tính) nhưng sau khi làm lạnh một thời gian nhất định, tripsin trở lại cấu trúc ban đầu và lại có hoạt tính enzyme.
22. 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Trần Thị Ân, Đái Duy Ban, Nguyễn Hữu Chấn, Đỗ Đình Hồ, Lê Đức Trình. 1980. Hoá sinh học. NXB Y học 2.Phạm Thị Trân châu, Trần Thị Áng. 1999. Hoá sinh học. NXB Giáo dục 3. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương. 1998. Sinh học phân tử. NXB Giáo dục 4. Nguyễn Hữu Đĩnh-Trần Thị Đà 1999, Ứng dụng một số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, Nhà xuất bản giáo dục 5.Copyright by The Mc Graw-Hill Companies, 2003. Harper’s Illustrated Biochemistry, Twenty-Sixth Edition, Langer Medical Publishing 6. Coreighton T. 1993. proteins, 2nd edition, W.H.Freeman and Company 7. Dennison D., 2002. A Guide To Protein Isolation. Kluwer Academic Publishers. New York, Boston, Dordrecht, Lodon, Moscow. 8. Fersht Alan,1998, Structure and Mechanism in Protein Science, W. H. Freeman, 3rd Rev Edit. 9. Lehninger A.L., 2004. Principle of Biochemistry, 4th Edition. W.H Freeman, 2004 10. Lodish H ., 2003. Molecular Cell Biology. 5th ed, W.H Freeman. 11. Walker John M. . 1996. The Protein Protocols Hand book. 2nd edition. Humana Press Inc. Totuwa, New Jersey.