Ảnh hưởng của cystein trong môi trường nuôi cấy tế bào trứng đến khả năng tạo phôi bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) ở heo

Nội dung text: Ảnh hưởng của cystein trong môi trường nuôi cấy tế bào trứng đến khả năng tạo phôi bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) ở heo

1. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T2- 2016 Ảnh hưởng của cystein trong môi trường nuôi cấy tế bào trứng đến khả năng tạo phôi bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) ở heo Nguyễn Thanh Bình Trường Đại học Thủ Dầu Một, Bình Dương ( Bài nhận ngày 16 tháng 07 năm 2015, nhận đăng ngày 14 tháng 04 năm 2016) TÓM TẮT Nghiên cứu này nhằm đánh giá ảnh hưởng tế bào, 408 phôi 3–4 tế bào, 264 phôi 5–8 tế bào của việc bổ sung cystein vào môi trường nuôi cấy và 106 phôi dâu. Trong đó, tỷ lệ thụ tinh và phân tế bào trứng đến hàm lượng glutathione (GSH) chia phôi tốt nhất ở các trứng được nuôi chín 44 trong trứng và sự phát triển của phôi bằng kỹ giờ, với 200 phôi có 2 tế bào (80 %), 161 phôi có thuật thụ tinh trong ống nghiệm ở heo. Khi bổ 3–4 tế bào (64,4 %), 144 phôi có 5-8 tế bào (45,6 sung 0,6 mM cystein vào môi trường TCM 199 đã %) và 62 phôi dâu (24,8 %). Kết quả cho thấy làm tăng lượng GSH trong trứng, nhận thấy rõ từ thời điểm bổ sung cystein vào môi trường nuôi giờ nuôi thứ 40 và nồng độ GSH đạt mức cao trứng và thời gian nuôi trứng đã ảnh hưởng đến nhất ở giờ nuôi thứ 44 (18,32 pmol/trứng). Sau 5 nồng độ GSH trong trứng. Đồng thời, tỷ lệ phát ngày nuôi phôi, trong tổng số 1000 trứng được triển phôi bị ảnh hưởng bởi thời gian nuôi chín nuôi chín và cho thụ tinh đã thu được 583 phôi 2 và nồng độ GSH trong trứng. Từ khóa: cystein, TCM, phôi, heo, GSH MỞ ĐẦU Tạo phôi heo bằng phương pháp thụ tinh tiến bộ trong hệ thống IVM - IVF nhưng tỷ lệ trong ống nghiệm đã được nghiên cứu từ những phôi heo được tạo ra trong ống nghiệm thường năm cuối thế kỷ 20 [1]. Đến nay, phương pháp thấp (khoảng 20 %) và chất lượng kém. Quá trình này vẫn được nghiên cứu với mong muốn tạo ra nuôi chín trứng heo in vitro diễn ra trong thời phôi heo với số lượng lớn và chất lượng ngày gian dài (trên 36 giờ), trứng phải thực hiện trao càng tốt hơn để phục vụ cho những mục đích đổi chất. Khi đó trứng sản sinh ra một lượng chất nghiên cứu cơ bản cũng như nghiên cứu y sinh oxy hóa, nếu các chất oxy hóa này tích tụ nhiều học [2]. Bằng kỹ thuật nuôi chín trứng trong ống và không được chuyển hóa bởi các chất chống nghiệm - thụ tinh trong ống nghiệm (IVM - IVF) oxy hóa sẽ gây độc cho trứng. Điều này làm ảnh người ta có thể chủ động được nguồn trứng phục hưởng đến chất lượng trứng cũng như sự phát vụ cho quá trình nghiên cứu. Mặc dù đã có nhiều triển tiếp theo của phôi sau khi thụ tinh [3]. Trang 19
2. Science & Technology Development, Vol 19, No.T2-2016 Glutathione (GSH) được tổng hợp trong tế NaCl, có bổ sung kháng sinh và được chuyển bào của các loài động vật, có tác dụng bảo vệ tế ngay về phòng thí nghiệm trong vòng 2 giờ. bào khỏi bị oxy hóa. Trong quá trình thụ tinh in Tại phòng thí nghiệm, buồng trứng heo được vitro, GSH có tác dụng làm giảm năng lượng cần rửa 2 lần với dung dịch nước muối sinh lý có thiết để tháo xoắn nhiễm sắc thể trước khi hình kháng sinh. Các nang có đường kính 3 - 6 mm thành tiền nhân đực [4] và đóng vai trò quan được chọn để thu nhận trứng. Buồng trứng có các trọng trong hình thành tiền nhân đực sau khi thụ nang đạt yêu cầu về đường kính được chọc hút và tinh [5]. Trong quá trình phát triển phôi in vitro, thu dịch nang trứng bằng ống tiêm 10 mL, kim GSH giúp tăng cường sự phát triển của phôi và 18G có chứa 1 mL dung dịch Dulbecco's duy trì hình thái trục chính phân bào giảm nhiễm phosphate buffered saline (D-PBS). Dịch nang của noãn, từ đó đảm bảo hình thành hợp tử bình trứng thu được được quan sát dưới kính hiển vi thường [6]. Cystein (Cys) là một trong ba acid soi nổi để tìm noãn. Những trứng có tế bào chất amine cấu tạo nên GSH. Mặc dù Cys tham gia đen đều và có từ 3 lớp tế bào ổ trở lên bám đều vào quá trình tổng hợp GSH trong noãn nhưng xung quanh được thu nhận cho thí nghiệm. trong môi trường tế bào, Cys lại dễ bị oxy hóa Nuôi chín trứng thành cystine. Khi bổ sung Cys làm tăng sự tổng hợp GSH nội bào [7]. Trứng được nuôi chín trong môi trường TCM Tiêu chuẩn trong đánh giá chất lượng trứng – 199 bổ sung 10 % fetal calf serum (FCS), để thụ tinh trong ống nghiệm là trứng trưởng penicilline và streptomycine. Trứng được nuôi thành ở giai đoạn MII và có một thể cực. Ngoài trong vi giọt (25 noãn/100 µL), có phủ dầu 0 ra, đánh giá nồng độ GSH trong trứng để xác khoáng, trong tủ CO2 ở 38,5 C, 5 % CO2, bão định mức trưởng thành tế bào chất. Đồng thời, hòa hơi nước. Vi giọt được ổn định trong tủ CO2 0 khả năng thụ tinh và phát triển của phôi tốt hơn ở 38,5 C, 5 % CO2, bão hòa hơi nước ít nhất khi trứng trưởng thành nhân và tế bào chất. trước 2 giờ nuôi. Tại cuối mỗi thời gian nuôi chín, trứng được tiến hành đánh giá nồng độ Ở Việt Nam, các nghiên cứu nuôi trưởng GSH. thành noãn và thụ tinh trong ống nghiệm trên heo còn ít. Đặc biệt đánh giá GSH trong quá trình Thời gian nuôi chín trứng để đánh giá GSH nuôi chín trứng chưa có và tỷ lệ phát triển phôi từ 0 giờ đến 50 giờ nuôi, thời gian nuôi chín heo còn thấp. trứng để thụ tinh in vitro từ 36 giờ đến 48 giờ nuôi. 5,5 -dithiobis(2–nitrobenzoic acid) dễ bị VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP khử bởi nhóm sulfhydryl của GSH tạo thành các Buồng trứng heo được thu nhận từ lò mổ anion có màu vàng được đo ở bước sóng 412 nm. Vissan - 420 Nơ Trang Long, quận Bình Thạnh, Đậm độ màu tỉ lệ với nồng độ GSH. Thành phố Hồ Chí Minh. Tinh dịch tươi của heo Chuẩn bị tinh trùng đực giống Duroc được cung cấp bởi trại heo giống quốc gia Bình Minh - Tân Bình, Bình Tinh dịch tươi của heo đực giống Duroc, trại Minh, Trảng Bom, Đồng Nai. heo giống Bình Minh được sử dụng để chuẩn bị Ngay sau khi heo cái được giết mổ, buồng tinh trùng. Trước tiên 4 mL dung dịch D-PBS trứng heo được cắt rời khỏi ống sinh dục. Sau đó, được cho vào ống falcon. Tiếp theo, 2 mL tinh buồng trứng được rửa trong dung dịch 0,9 % dịch được cho vào đáy ống falcon sao cho tạo NaCl có bổ sung kháng sinh (peniciline và thành phân lớp tinh dịch và dung dịch D-PBS. streptomycine) 2 - 3 lần. Buồng trứng được trữ Tinh trùng khỏe, được thu nhận từ tinh dịch bằng trong bình có chứa dung dịch nước muối 0,9 % phương pháp bơi lên. Quá trình bơi lên được diễn Trang 20
3. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T2- 2016 ra 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, lớp dịch tinh chín, các trứng được thụ tinh với tinh trùng đã trùng phía trên được thu nhận và ly tâm 2000 được xử lý và hoạt hóa trong môi trường TL- vòng trong 5 phút. Cuối cùng, lớp cặn được thu Hepes. Nồng độ tinh trùng được sử dụng để thụ nhận và huyền phù trở lại. Cặn huyền phù được tinh là 1x106 tinh trùng/mL. Sau thụ tinh 6 giờ, điều chỉnh mật độ tinh trùng trong môi trường các phôi giả định đều được chuyển sang nuôi tiếp TL-Hepes để đạt nồng độ 1x106 tinh trùng/mL. trong cùng một môi trường PZM3 + 3 mg/mL Thụ tinh và nuôi phôi BSA. Phôi giả định được nuôi đến 120 giờ và được theo dõi sự phát triển mỗi 24 giờ nuôi. Trứng sau khi hoàn tất thời gian nuôi chín Xử lý số liệu được loại bỏ lớp tế bào ổ bằng cách dùng pipette Pasteur hút đẩy nhiều lần. Sau đó, trứng được ủ Các số liệu thu được của các thí nghiệm được với tinh trùng đã được điều chỉnh mật độ trong vi phân tích thống kê để so sánh sự khác biệt giữa giọt môi trường (100 µL tinh trùng/giọt), có phủ các nghiệm thức bằng phần mềm Statgraphic dầu khoáng. Vi giọt môi trường được chuẩn bị và centurion XV. 0 cân bằng trong tủ ấm 38,5 C, 5 % CO2 ít nhất 2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN giờ trước khi sử dụng. Các trứng được ủ với tinh 0 Nồng độ GSH trong noãn được nuôi in vitro có trùng trong 6 giờ, ở điều kiện 38,5 C; 5 % CO2, bổ sung cystein bão hòa hơi nước. Nồng độ GSH sau khi nuôi chín trứng ở 4 Sau khi ủ trứng với tinh trùng 6 giờ, noãn mốc thời gian khác nhau và được bổ sung 0,6 được thụ tinh trong môi trường TL-Hepes được mM Cys ở 3 thời điểm khác nhau, trong quá trình rửa trong môi trường nuôi phôi (PZM – 3 và 3,0 nuôi được đo mật độ quang bằng máy quang phổ mg/mL BSA) để loại bỏ tinh trùng ra khỏi hợp tử ở bước sóng 412 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 giả định. Sau đó, các hợp tử giả định được nuôi lần. Kết quả được thể hiện ở Bảng 1, khi bổ sung trong vi giọt môi trường PZM - 3 + 3 mg/mL 0,6 mM Cys vào môi trường TCM 199 + 10 % BSA (10 phôi/ 100 µL môi trường nuôi phôi), có FCS ở các thời điểm nuôi khác nhau (giờ 0 - bắt phủ dầu khoáng, ở 38,5 0C; 5 % CO , bão hòa hơi 2 đầu nuôi, giờ 36 và giờ 40) đều làm tăng nồng độ nước. Hợp tử giả định được nuôi đến 120 giờ và GSH trong noãn heo so với không bổ sung Cys. được theo dõi sự phát triển mỗi 24 giờ nuôi. Kết quả này phù hợp với Sawai và cs [8] bổ sung Trứng được nuôi ở 4 mức thời gian nuôi khác Cys trong môi trường không có serum ở các thời nhau là 36 giờ, 40 giờ, 44 giờ và 48 giờ trong gian 0, 12, 24 và 36 giờ khi nuôi noãn 48 giờ đều môi trường TCM199 + 5 % FCS. Sau khi nuôi làm tăng nồng độ GSH. Bảng 1. Nồng độ GSH trong noãn theo thời gian nuôi chín noãn Thời điểm Thời gian nuôi (giờ) Số noãn$ bổ sung 36 40 44 48 0 * 90 5,48a ± 0,6 8,57a ± 0,6 13,18a ± 2,7 6,38a ± 3,4 0,6 Giờ 0 90 7,15b ± 0,8 10,51a ± 1,2 15,52b ± 0,91 8,31b ± 1,3 Giờ 36 90 5,37a ± 0,5 12,20b ± 0,44 16,67b ± 1,4 10,32c ± 0,5 Giờ 40 90 - 9,12a ± 0,5 18,32c ± 1,3 11,40c ± 0,7 a,b,c: Các ký tự khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt về mặt thống kê (P< 0,05) * Kết quả từ thí nghiệm 1 $: Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Trang 21
4. Science & Technology Development, Vol 19, No.T2-2016 Đối với các trứng được nuôi đến 36 giờ, 0,0006 mM. Hơn nữa, trong môi trường in vitro nồng độ GSH tăng khi Cys được bổ sung từ đầu Cys dễ dàng bị oxy hóa, nên với nồng độ Cys có quá trình nuôi noãn (từ 5,48 pmol/noãn lên 7,15 trong môi trường TCM 199 thì không đủ để noãn pmol/noãn) và khác biệt so với lô không bổ sung heo tổng hợp GSH [4]. Vì thế, trong thí nghiệm Cys. Ngược lại, bổ sung Cys ở giờ 36 làm giảm này trứng được nuôi trong môi trường TCM 199 nồng độ GSH so với lô đối chứng (từ 5,48 ± 0,60 bổ sung 0,6 mM Cys vào ở ba thời điểm khác pmol/trứng xuống còn 5,37 pmol/trứng). Tuy nhau của quá trình nuôi chín là giờ 0, giờ 36 và nhiên, nồng độ GSH trong trứng của lô có bổ giờ 40 để đánh giá ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 0,6 mM Cys lúc giờ 36 khác biệt không có ý sung Cys lên nồng độ GSH trong trứng. nghĩa thống kê so với lô không bổ sung Cys. Nồng độ GSH đo được trong thí nghiệm này Đối với các noãn được nuôi đến 40 giờ, nồng cao hơn so với các báo cáo trước đây. Theo độ GSH đạt cao nhất khi bổ sung Cys lúc giờ 36 Wang và cs (1997), nồng độ GSH của trứng heo (12,20 pmol/noãn) và khác biệt so với lô đối trưởng thành trong môi trường NCSU 23 bổ sung chứng. Mặc dù, khi Cys được thêm vào ở thời 0,57 mM Cys và 10 % pFF là 5,8 pmol/ trứng. điểm ngay khi bắt đầu nuôi và giờ 40 đều làm Theo Sawai và cs [8], bổ sung Cys trong môi tăng nồng độ GSH trong trứng nhưng không khác trường không có serum ở các thời gian 24, 36 và biệt so với lô không bổ sung Cys (10,51; 9,12 và 48 giờ đều làm tăng nồng độ GSH nhưng không 8,57 pmol/trứng). làm ảnh hưởng đến sự trưởng thành nhân, sự xâm Đối với các trứng được nuôi đến 44 giờ, nhập và tháo xoắn của tinh trùng. nồng độ GSH trong trứng được nuôi trong môi Điều này cho thấy cần có một thời gian nhất trường có bổ sung Cys đều tăng và khác biệt so định để Cys được tổng hợp chuyển vào trong với lô không có bổ sung Cys. Nồng độ GSH đạt trứng. Từ đó sẽ làm tăng nồng độ GSH khi bổ cao nhất khi bổ sung Cys lúc giờ 44 (18,32 sung Cys vào môi trường. pmol/noãn) và khác biệt so lô đối chứng. Mặc dù, Hiệu quả bổ sung cystein đến tỷ lệ thụ tinh nồng độ GSH của trứng khi thêm Cys vào ở thời điểm ngay khi bắt đầu nuôi và giờ 36 có khác Sau khi thụ tinh hai ngày, phôi được quan sát biệt nhưng không có ý nghĩa (10,51 và 16,67 (Hình 1) và kết quả được thể hiện ở Bảng 2. pmol/trứng). Đối với các trứng được nuôi đến 48 giờ, nồng độ GSH trong trứng được nuôi trong môi trường có bổ sung Cys đều tăng và khác biệt so với lô không có bổ sung Cys. Nồng độ GSH đạt cao nhất khi bổ sung Cys lúc giờ 40 (từ 6,38 ± 3,40 pmol/ trứng lên 11,40 pmol/ trứng). Đồng thời, nồng độ GSH của trứng khi thêm Cys vào ở thời điểm giờ 36 chỉ đạt 10,32 pmol/ trứng, nhưng khác biệt không ý nghĩa so với việc bổ sung Cys lúc nuôi tại 40 giờ. Trong khi đó, nồng độ GSH trong trứng được nuôi có bổ sung Cys ngay khi bắt đầu nuôi chỉ đạt 8,31 pmol/ trứng. Hình 1. Các phôi sau 2 ngày nuôi (ở vật kính 10X) Trong môi trường TCM 199 cũng có thành phần Cys nhưng với nồng độ rất thấp khoảng Trang 22
5. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T2- 2016 Bảng 2. Tỷ lệ thụ tinh trong ống nghiệm Thời gian nuôi chín trứng trước khi thụ tinh Thời gian nuôi (giờ) Tỷ lệ thụ tinh (%) có ảnh hưởng rất lớn. Thật vậy, các noãn này có thời gian nuôi chín từ 36 giờ đến 48 giờ, nên có 36 43,2a sự khác biệt về tỷ lệ thụ tinh giữa các lô thí 40 51,2ab nghiệm. Sau khi tinh trùng xâm nhập thành công 44 80,0c và vào trong tế bào chất thì sẽ làm tháo xoắn, 48 58,8b hình thành tiền nhân đực, hợp nhất tiền nhân đực a - c: Các ký tự khác nhau trong cùng một cột thể và tiền nhân cái, hình thành thể cực thứ hai, sau hiện sự khác biệt về mặt thống kê (P< 0,05) đó, phôi tiến hành lần phân chia đầu tiên, từ hợp Tỷ lệ thụ tinh đạt được từ 43,2 – 80 %. Tuy tử với một tế bào thành phôi có 2 tế bào. Khi tế nhiên, thời gian nuôi chín trứng khác nhau thì tỷ bào chất của trứng không hoặc chưa đủ trưởng lệ thụ tinh giữa các trứng cũng khác nhau. Trong thành thì các sự kiện trên khó xảy ra. đó đạt tỷ lệ thấp nhất ở lô có các trứng được nuôi Khi so với các tác giả ở Việt Nam đã thực chín 36 giờ (43,2 %) và khác biệt không có ý hiện quá trình thụ tinh in vitro thành công trên nghĩa thống kê so với lô nuôi 40 giờ (51,2 %). heo kết quả này cao hơn: H.T.L. Duyên [12] ghi Mặc dù tỷ lệ thụ tinh của trứng được nuôi 48 giờ nhận tỷ lệ phôi 2 tế bào 30,1 % khi xử lý tinh cao hơn trứng nuôi 40 giờ nhưng cũng không có trùng bằng phương pháp Gradient Percoll và nuôi ý nghĩa thống kê (58,8 % so với 51,2 %). Tỷ lệ phôi trong môi trường NCSU23 + 0,4 % BSA. thụ tinh đạt cao nhất ở lô có các trứng được nuôi Trong khi thí nghiệm này, tinh trùng được xử lý chín 44 giờ (80 %) và khác biệt có ý nghĩa so với bằng phương pháp swim up, nuôi phôi trong các lô thí nghiệm khác. PZM3 + 3 mg/mL BSA. Điều này cho thấy với 44 giờ được nuôi chín Hiệu quả bổ sung cystein đến khả năng thu in vitro thì trứng đã trưởng thành hoàn toàn, thích phôi hợp nhất cho quá trình thụ tinh diễn ra. Kết quả Các phôi được nuôi tiếp tục đến ngày thứ 5 này phù hợp với nhận định của Alminana và cs; sau khi thụ tinh. Sự phát triển của phôi qua từng Yoshioka và cs; Yuan và Krisher [9-11] tỷ lệ giai đoạn được ghi nhận tương ứng lúc 72; 96 và trứng trưởng thành (ở kỳ giữa II và có một thể 120 giờ kể từ lúc thụ tinh. Kết quả thể hiện ở cực) đạt từ 75 % đến 85 % ở những quy trình Bảng 3. IVM có thời gian nuôi đến 44 giờ, các trứng này được dùng để thụ tinh trong ống nghiệm sẽ cho tỷ lệ tạo phôi in vitro cao. Bảng 3. Tỷ lệ phát triển phôi qua từng giai đoạn Thời gian nuôi Tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn (%) (giờ) phôi 3 - 4 tế bào phôi 5 - 8 tế bào phôi dâu 36 27,2a 12,0a 1,2a 40 28,8a 19,6b 5,2b 44 64,4c 45,6d 24,8d 48 42,8b 28,4c 11,2c a - d: Các ký tự khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt về mặt thống kê (P< 0,05) Trang 23
6. Science & Technology Development, Vol 19, No.T2-2016 lệ phôi 3-4 tế bào là 42,8 % (Hình 2) và khác biệt so với lô nuôi 36 giờ và 40 giờ. Kết quả thu đạt được với tổng số phôi 5 - 8 tế bào từ 4 lô thí nghiệm là 264 phôi. Tỷ lệ phát triển phôi đến giai đoạn 5-8 tế bào khá cao (12- 45,6 %) và có sự khác biệt giữa 4 lô thí nghiệm. Trong đó, thấp nhất ở lô 36 giờ (12 %) và khác biệt so với lô nuôi 40 giờ (19,6 %). Lô nuôi 48 giờ, tỷ lệ phôi 5 - 8 tế bào là 28,4 %. Cao nhất ở lô 44 giờ (45,6 %) và khác biệt so với các lô thí Hình 2. Các phôi 3-4 tế bào (ở vật kính 10X) nghiệm khác. Sau 5 lần lặp lại thí nghiệm, tổng số phôi 3-4 Tổng số phôi dâu được tạo thành từ 4 lô thí tế bào thu được từ 4 lô thí nghiệm là 408 phôi. Tỷ nghiệm là 106 phôi. Tỷ lệ phôi dâu từ 1,2–24,8 % lệ phát triển phôi đến giai đoạn 3-4 tế bào từ và có sự khác biệt giữa 4 lô thí nghiệm. Trong 27,2–64,4 % và có sự khác biệt giữa 4 lô thí đó, thấp nhất là lô 36 giờ (1,2 %) và khác biệt so nghiệm. Trong đó, thấp nhất ở lô 36 giờ (27,2 %) với lô nuôi 40 giờ (5,2 %). Lô nuôi 48 giờ, tỷ lệ và không khác biệt so với lô nuôi 36 giờ (28,8 phôi dâu là 11,2 % và khác biệt so với lô nuôi 36 %). Cao nhất ở lô 44 giờ (64,4 %) và khác biệt so giờ và 40 giờ. Cao nhất ở lô 44 giờ (24,8 %) và với các lô thí nghiệm khác. Còn lô nuôi 48 giờ, tỷ khác biệt so với các lô thí nghiệm khác. Hình 3. Các phôi 5-8 tế bào và phôi dâu (ở vật kính 10X) Kết quả cho thấy với thời gian nuôi trứng từ phôi dâu được nuôi 40 giờ tốt hơn so với 36 giờ. 36 giờ trở lên, các phôi đều phát triển đến giai Mặc dù, trứng nuôi 36 giờ có tỷ lệ phôi dâu thấp đoạn phôi dâu (Hình 3). Với thời gian nuôi noãn (khoảng 1,2 %). trên 36 giờ, phôi đã truyền thông tin di truyền So với H.T.L. Duyên [12], kết quả đạt được thành công và phôi heo đã vượt qua giai đoạn cao hơn nhiều về tỷ lệ phôi dâu tạo thành. ngừng tăng trưởng. N.T.Thoa và cs [13] báo cáo tỷ lệ phôi dâu tạo Khi đánh giá chung khả năng phát triển đến thành khi nuôi phôi trong môi trường Pig - FM giai đoạn phôi 3-4 tế bào và phôi 5-8 tế bào của vẫn thấp hơn so với kết quả của nghiên cứu này trứng được nuôi 36 và 40 giờ, không có sự khác (23,75 % so với 24,8 %). biệt. Nhưng khả năng phát triển đến giai đoạn Trang 24
7. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T2- 2016 KẾT LUẬN phôi heo in vitro từ nguồn noãn heo được nuôi Những kết quả đã trình bày trên đây cho thấy chín in vitro từ 36 giờ đến 48 giờ sử dụng môi rằng thời điểm bổ sung cystein vào môi trường trường PZM3 bổ sung 3 mg/mL BSA. Thời gian nuôi trứng và thời gian nuôi trứng đã ảnh hưởng nuôi chín trứng có ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinh đến nồng độ GSH trong trứng; tỷ lệ phát triển và phát triển phôi heo. Tỷ lệ thụ tinh cao nhất (80 phôi bị ảnh hưởng bởi thời gian nuôi chín và %) và tỷ lệ phôi dâu cao nhất (24,8 %) tương ứng nồng độ GSH trong trứng. Chúng tôi đã tạo được với thời gian nuôi chín trứng là 44 giờ. Effect of cysteine in maturation medium on embryos development by in vitro fertilization (IVF) in porcine Nguyen Thanh Binh Thu Dau Mot University, Binh Duong ABSTRACT In this article, we studied the effect of cystein embryos containing 5-8 cells and 106 morula. In in maturation culture on glutathione particular, fertilization rate and embryo division concentration in oocyte and on embryos was the best in the oocyte maturation of the 44th development by in vitro fertilization in porcine. hour with 200 embryos containing 2 cell (80 %), 0.6 mM cysteine supplementation on TCM-199 161 embryos containing 3-4 cells (64.4 %), 114 medium has increased the amount of GSH in the embryos containing 5-8 cells (45.6 %) and 62 oocyte. The GSH level began to increase at the morula (24.8 %). The results showed that the 40th hour after cystein supple metation and time of the cysteine supplementation into medium attained the highest at the 44th hour (18.32 and the time of muturation affected oocyte GSH pmol/oocyte). After 5 days of embryos culture, a level. In addition, embryoic development rate total of 1000 oocyte maturation and fertilization was also affected by maturation time and oocyte was obtained including 583 embryos containing GSH level. 2 cells, 408 embryos containing 3-4 cells, 264 Key words: cysteine,TCM, embryo, porcine, GSH TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. W.T.R. Cheng, R.M. Moor, C. Polge, In Bảo, N.T. Bình, T.T.T. Bình, N.H. Duy, vitro fertilization of pig and sheep oocytes C.A. Dũng, L.T.H. Khả, N.T.T. Lan, N.K. matured in vivo and in vitro, Linh, N.T. Mai, G.Q. Như, H.T. Quế, N.N. Theriogenology, 25, 1, 146 (1986). Quỳnh, M.C.M. Tâm), Nhà xuất bản Giáo [2]. N.T. Binh, Thụ tinh trong ống nghiệm trên Dục, Thành phố Hồ Chí Minh, 623-632 heo. Trong Thụ tinh trong ống nghiệm (2011). (H.M. Tường, Đ.Q. Vinh, V.T.N. Lan, H.G. Trang 25
8. Science & Technology Development, Vol 19, No.T2-2016 [3]. T.B. Nguyen, V.T. Nguyen, M. Masashi, pronuclear formation, Biology of Effects of liquid preservation of sperm on Reproduction, 57, 1, 1-6 (1997). their ability to activate oocytes and initiate [9]. C. Alminana, M.A. Gil, C. Cuello, I. preimplantational development after Caballero, J. Roca, J.M. Vazquez, E.A. intracytoplasmic sperm injection in the pig, Martinez, In vitro fertilization (IVF) in Theriogenology, 71, 9, 1440-1450 (2009). straws and a short gamete coincubation [4]. M. Yoshida, K. Ishigaki, T. Nagai, M. time improves the efficiency of porcine Chikyu, V.G. Pursel, Glutathione IVF, Reproduction in Domestic Animals, concentration during maturation and after 43, 6, 747-752 (2008). fertilization in pig oocytes: relevance to the [10]. K. Yoshioka, C. Suzuki, S. Itoh, K. ability of oocytes to form male pronucleus, Kikuchi, S. Iwamura, H. Rodriguez- Biology of Reproduction, 49, 1, 89-94 Martinez, Production of piglets derived (1993). from in vitro-produced blastocysts fertilized [5]. A.C. Boquest, L.R. Abeydeera, W.H. and cultured in chemically defined media: Wang, B.N. Day, Effect of adding reduced effects of theophylline, adenosine, and glutathione during insemination on the cystein during in vitro fertilization, Biology development of porcine embryos in vitro, of Reproduction, 69, 6, 2092-2099 (2003). Theriogenology, 51, 7, 1311-1319 (1999). [11]. Y. Yuan, R.L. Krisher, Effect of ammonium [6]. K.A. Zuelke, S.C. Jeffay, R.M. Zucker, during in vitro maturation on oocyte S.D. Perreault, Glutathione (GSH) nuclear maturation and subsequent concentrations vary with the cell cycle in embryonic development in pigs, Animal maturing hamster oocytes, zygotes, and pre- Reproduction Science, 117, 3, 302-307 implantation stage embryos, Molecular (2010). Reproduction and Development, 64, 1, 106- [12]. H.T.L. Duyên, Ứng dụng kỹ thuật thụ tinh 112 (2003). in vitro và PCR xác định giới tính trên heo [7]. H. Funahashi, B.N. Day, Effects of cumulus (Sus scrofa domestica), Luận văn Thạc sỹ cells on glutathione content of porcine sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự oocytes during in vitro maturation, Journal nhiên, ĐHQG-HCM (2003). of Animal Science, 73, 1, 90 (1995). [13]. N.T. Thoa, L.N. Anh, V.T. Hương, T.S. Hà, [8]. K. Sawai, H. Funahashi, K. Niwa, Stage- D.V. Hương, N.T. Hương, Kết quả tạo phôi specific requirement of cysteine during in lợn trong ống nghiệm sử dụng môi trường vitro maturation of porcine oocytes for NCSU37 + 10 % pFF, Tạp chí Khoa học glutathione synthesis associated with male Công nghệ Chăn nuôi, 19, 34-40 (2009). Trang 26