Giáo trình Công nghệ Ezim - Trần Xuân Ngạch

75 trang ngocly 1340

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Công nghệ Ezim - Trần Xuân Ngạch", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

giao_trinh_cong_nghe_ezim_tran_xuan_ngach.pdf

Nội dung text: Giáo trình Công nghệ Ezim - Trần Xuân Ngạch

CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 0өc lөc Chѭѫng 1: NGUYÊN LIӊU THU ENZIM VÀ PHÂN BӔ 3 1.1. Nguӗn ÿӝng vұt: 3 1.2. Nguӗn gӕc thӵc vұt: 4 1.3. Nguӗn vi sinh vұt: 4 Chѭѫng 2: 6ҦN XUҨT CÁC CHӂ PHҬM ENZIM TӮ VI SINH VҰT 5 2.1. ĈLӅu hoà quá trình sinh tәng hӧp enzim trong môi trѭӡng nuôi cҩy vi sinh vұt 5 2.2. TuyӇn chӑn và cҧi tҥo giӕng vi sinh vұt cho enzim có hoҥt lӵc cao: 11 2.3. Phѭѫng pháp bҧ o quҧn giӕng vi sinh vұt : 12 2.4. Môi trѭӡng nuôi cҩy vi sinh vұt sinh tәng hӧp enzim: 13 2.5. Các phѭѫng pháp nuôi cҩy vi sinh vұt: 17 2.6. Tách và làm sҥch chӃ phҭm enzym : 22 Chѭѫng 3: .Ӻ THUҰT SҦN XUҨT CHӂ PHҬM TӮ HҤT CӔC NҬY MҪM (MALT) 24 3.1. Nguyên liӋu ÿҥi mҥch: 24 3.2. Làm sҥch và phân loҥi hҥt: 25 3.3. 5ӱa, sát trùng và ngâm hҥt: 26 3.4. 1ҭy mҫm: 28 3.5. 6ҩy malt: 34 3.6. Tách mҫm, rӉ, bҧo quҧn malt: 37 3.7. .ӻ thuұt sҧn xuҩt mӝt sӕ loҥi malt ÿһc biӋt: 38 Chѭѫng 4: 6ҦN XUҨT ENZIM TӮ THӴC VҰT 40 4.1. 6ҧn xuҩt ureaza tӯÿұu rӵa: 40 4.2. Thu nhұn bromelain tӯ dӭa: 40 Chѭѫng 5: ENZIM CӔĈӎNH 44 5.1. Giӟi thiӋu chung: 44 5.2. 0ӝt sӕ phѭѫng pháp chӫ yӃu chӃ tҥo enzim cӕÿӏnh : 44 5.3. 0ӝt sӕ liên kӃt trong viӋc cӕÿӏnh enzim. 45 5.4. Ҧnh hѭӣng cӫa sӵ cӕÿӏnh ÿӃn hoҥttính cӫa enzim 46 5.5. Các reactor chӭa enzim cӕÿӏnh: 48 5.6. . Sӱ dөng enzim cӕÿӏnh trong y hӑc và trong công nghiӋp: 50 Chѭѫng 6: GIӞI THIӊU MӜT SӔ LOҤI ENZIM CHӪ YӂU VÀ KHҦ NĂNG ӬNG 'ӨNG 55 6.1. Amylaza 55 6.2. Proteaza. 58 6.3. Pectinaza 60 6.4. Xenluloza: 64 Trang: 1
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 6.5. Saccaraza và glucooxydaza. 66 Chѭѫng 7: PHѬѪNG PHÁP XÁC ĈӎNH HOҤT ĈӜ MӜT SÔ LOҤI ENZIM 68 7.1. Ĉѫn vӏÿo hoҥt ÿӝ: 68 7.2. Các phѭѫng pháp xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ enzim: 69 7.3. Chuҭn bӏ dӏch chiӃt enzim ÿӇ xác ÿӏnh hoҥWÿӝ 71 Trang: 2
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Chѭѫng 1: NGUYÊN LIӊU THU ENZIM VÀ PHÂN BӔ 1.1. Nguӗn ÿӝng vұt: 1.1.1. Tuӷ tҥng: (Pan creas) Ĉây là nguӗn enzim sӟm nhҩt, lâu dài nhҩt, có chӭa nhiӅu loҥi enzim nhҩt nhѭ: tripxin, kimotripxin, cacboxy pectidaza A và B, ribonucleaza, amilaza, lipaza. + Tripxin y hӑc phҧi là loҥi tinh chӃ. + Ӭng dөng ÿҫu tiên cӫa chӃ phҭm tripxin là làm mӅn da ÿӇ lӝt da, khӱ các vӃt nӭt trên da. + Sҧn xuҩt sҧn phҭm thuӹ phân protein y hӑc (dӏch truyӅn y tӃ) và môi trѭӡng nuôi cҩy vsv. + ChӃ phҭm dӏch tuӷ y hӑc ÿӇ chӳa bӋnh vӅ tuӷ (rӕi loҥn chӭc năng, bӏ cҳt bӓ tuӷ). + Sҧn xuҩt chӃ phҭm enzim tҭy rӱa (vӃt bҭn, màu khó tan) ӣ nhiӋt ÿӝ vӯa phҧi, không thích hӧp vӟi nhiӋt ÿӝ cao và pH thay ÿәi. 1.1.2. Màng nhҫy dҥ dày lӧn: Là nguӗn enzim pepxin A, B, C, D, gastrisin. Các enzim này ÿѭӧc tiӃt ra ngoài tӃ bào cùng vӟi dӏch vӏ ( khi tiêu hoá thӭc ăn). Ĉӕi vӟi các typ pepxin có pHopt=1.3¸2.2. 1.1.3. 'ҥ dày bê: Trong ngăn thӭ tѭ cӫa dҥ dày bê có tӗn tҥi enzim thuӝc nhóm Proteaza tên là renin. Enzim này ÿã tӯ lâu ÿѭӧc sӱ dөng phә biӃn trong công nghӋ phomat. Renin làm biӃn ÿәi cazein thành paracazein có khҧ năng kӃt tӫa trong môi trѭӡng sӳa có ÿӫ nӗng ÿӝ Ca2+. Ĉây là quá trình ÿông tө sӳa rҩt ÿLӇn hình, ÿѭӧc nghiên cӭu và ӭng dөng ÿҫy ÿӫ nhҩt. Trong thӵc tӃ nӃu chӃ phҭm renin bӏ nhiӉm pepxin (trong trѭӡng hӧp thu chӃ phҭm renin ӣ bê quá thì. Khi ÿó, dҥ dày bê ÿã phát triӇn ÿҫy ÿӫ có khҧ năng tiӃt ra pepxin) thì khҧ Qăng ÿông tө sӳa kém ÿi. *ҫn ÿây có nghiên cӭu sҧn xuҩt proteaza tӯ vsv có ÿһc tính renin nhѭ ӣ các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus. 1.1.4. Các loҥi nӝi tҥng khác: Gan, lá lách, thұn, phәi, cѫ hoành tim, dҥ con, huyӃt. Các loҥi này ÿӅu có chӭa enzim, ÿa sӕ tӗn tҥi trong tӃ bào. ChӍ có mӝt sӕ loҥi ÿѭӧc sҧn xuҩt dѭӟi dҥng chӃ phҭm nhѭ: gan, tim lӧn ÿӇ tách aspartat-glutamat aminotransferaza, huyӃt tѭѫng (tӯ huyӃt) ÿӇ tách ra trombia (Proenzim chӕng ÿông máu) Nhìn chung nguyên liӋu ÿӝng vұt dùng ÿӇ tách enzim phҧi tѭѫi tӕt (lҩy ngay sau khi giӃt mә) hoһc giӳӣ -200C có thӇÿѭӧc 1¸12 tháng vүn không làm giҧm hoҥt tính enzim. Trang: 3
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 1.2. Nguӗn gӕc thӵc vұt: 1.2.1. Cây ÿұu rӵa (Canavalin ensifirmis): Ĉây là cây thuӝc hӑÿұu Canavalia – có nhiӅu ӣ châu Phi, ӣ ViӋt Nam có nòi kӇ trên. Trong tҩt cҧ các nòi ÿұu rӵa ÿӅu rҩt giàu enzim Ureaza, hàm lѭӧng có thӇÿӃn 20% chҩt khô. 1.2.2. +ӑ dӭa (Bromalaceae): Bao gӗm tҩt cҧ các nòi dӭa trӗng lҩy quҧ, lҩy sӧi (kӇ cҧ các nòi dӭa dҥi). Trong các bӝ phұn khác nhau cӫa cây dӭa (vӓ, lõi, chӗi, thân, lá, ) ÿӅu có chӭa enzim bromelain. Trong ÿó nhiӅu nhҩt là phҫn lõi ÿҫu quҧ dӭa. Hoҥt tính cӫa enzim bromelain phө thuӝc nhiӅu vào trҥng thái và ÿLӅu kiӋn bҧo quҧn nguyên liӋu. Các nghiên cӭu ÿã chӍ ra rҵng các nguyên liӋu sҩy khô ӣ nhiӋt ÿӝ 400C sӁ giӳ ÿѭӧc hoҥt tính enzim tӕt hѫn so vӟi nguyên liӋu ÿã ÿѭӧc bҧo quҧn lҥnh ӣ nhiӋt ÿӝ 40C. 1.2.3. Nhӵa ÿu ÿӫ (Carica Papaya. L): Ĉây là loҥi cây ăn quҧ phә biӃn ӣ các nѭӟc nhiӋt ÿӟi. Tӯ quҧ tѭѫi hoһc thân thu ÿѭӧc nhӵa (latex) chính là chӃ phҭm papain thô ÿӇ tӯÿó tinh chӃ thành papain thѭѫng phҭm. HiӋn nay ngѭӡi ta ÿã tҥo ra ÿѭӧc các giӕng ÿu ÿӫ có sҧn lѭӧng mӫ và hoҥt tính papain cao ÿӇ khai thác có hiӋu quҧ nguӗn enzim này (không ÿһt vҩn ÿӅ lҩy quҧ). 1.2.4. 0ӝt sӕ loҥi nguyên liӋu thӵc vұt khác: Khi tiӃn hành nghiên cӭu khoa hӑc, y sinh hӑc, nhiӅu khi cҫn xem xét (ÿӏnh tính, ÿӏnh Oѭӧng, cҩu trúc phân tӱ, ÿӝ hoҥt ÿӝng enzim, ) cӫa mӝt sӕ loҥi enzim có trong bҧn thân nguyên liӋu ÿó ÿӇÿӏnh lѭӧng sӱ dөng. Ĉáng chú ý hѫn cҧ là: ChӃ phҭm enzim Polyphenoloxydaza (EPPO): ÿLӇn hình nhҩt là eppo cӫa lá chè, cӫa Qӝi nhӫ hҥt ca cao tѭѫi, nѭӟc ép quҧ nho. ChӃ phҭm loҥi này phә biӃn hѫn cҧ là loҥi “bӝt axeton”. 1.2.5. +ҥt cӕc và mӝt sӕ loҥi cӫ chӭa tinh bӝt: Trong hҥt cӕc nҭy mҫm (malt) và mӝt sӕ loҥi cӫ nҭy mҫm (ÿLӇn hình là khoai lang) có Pӝt hӋ enzim rҩt phong phú ÿѭӧc ngѭӡi ta sӱ dөng tӯ rҩt lâu trong các lƭnh vӵc: mұt tinh Eӝt (mҥch nha), rӵu và bia (thұm chí có mӝt phѭѫng pháp sҧn xuҩt rӵu etylic mang tên là phѭѫng pháp maltaza hay phѭѫng pháp malt) 1.3. Nguӗn vi sinh vұt: Ĉây là nguӗn enzim phong phú nhҩt, có ӣ hҫu hӃt các loài vi sinh vұt nhѭ: nҩm mӕc, vi khuҭn và mӝt sӕ loài nҩm men. Có thӇ nói vi sinh vұt là nguӗn nguyên liӋu thích hӧp nhҩt ÿӇ sҧn xuҩt enzim ӣ qui mô lӟn dùng trong công nghӋ và ÿӟi sӕng. Dùng nguӗn vi sinh vұt có nhӳng lӧi ích chính nhѭ sau: + Chӫÿӝng vӅ nguyên liӋu nuôi cҩy vi sinh vұt và giӕng vi sinh vұt. + Chu kǤ sinh trѭӣng cӫa vi sinh vұt ngҳn: 16¸100 giӡ nên có thӇ thu hoҥch nhiӅu lҫn quanh năm. + Có thӇÿLӅu khiӇn sinh tәng hӧp enzim dӉ dàng theo hѭӟng có lӧi (ÿӏnh hѭӟng sӱ Gөng và tăng hiӋu suҩt tәng thu hӗi). + Giá thành tѭѫng ÿӕi thҩp vì môt trѭӡng tѭѫng ÿӕi rҿ, ÿѫn giҧn, dӉ tә chӭc sҧn xuҩt. Tuy nhiên trong mӑi trѭӡng hӧp cҫn lѭu ý khҧ năng sinh ÿӝc tӕ (gây ÿӝc, gây bӋnh) ÿӇ có biӋn pháp phòng ngӯa, xӱ lý thích hӧp. Trang: 4
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch ĈӇ sҧn xuҩt chӃ phҭm enzim, ngѭӡi ta có thӇ phân lұp các giӕng vi sinh vұt có trong tӵ nhiên hoһc các giӕng ÿӝt biӃn có lӵa chӑn theo hѭӟng có lӧi nhҩt, chӍ tәng hӧp ѭu thӃ Pӝt loҥi enzim nhҩt ÿӏnh cҫn thiӃt nào ÿó. Chѭѫng 2: SҦN XUҨT CÁC CHӂ PHҬM ENZIM TӮ VI SINH VҰT 2.1. ĈLӅu hoà quá trình sinh tәng hӧp enzim trong môi trѭӡng nuôi cҩy vi sinh vұt 9ӟi mөc ÿích nuôi cҩy thu hӗi enzim vӟi hiӋu suҩt cao, cҫn phҧi nhұn rӓ quá trình ÿLӅu hoà sinh tәng hӧp enzim ÿӇ có các ÿӏnh hѭӟng tác ÿӝng thích hӧp trong công nghӋ. TӃ bào vi sinh vұt chӍ tәng hӧp enzim khi cҫn thiӃt vӟi sӕ lѭӧng thích hӧp mong muӕn. 2.1.1. ĈLӅu hoà theo hѭӟng ÿóng mӣ bӣi gen operator (gen ÿLӅu khiӇn) _hiӋn Wѭӧng trҩn áp : + hiӋn tѭӧng trҩn áp (ӭc chӃ) (repression): là làm giҧm quá trình sinh tәng hӧp do sҧn phҭm cuӕi cùng cӫa quá trình nuôi cҩy. HiӋn tѭӧng này thѭӡng gһp ÿӕi vӟi các enzym xúc tác quá trình sinh tәng hӧp mӝt chiӅu nhѭ: quá trình sinh tәng hӧp axit amin, nucleotit. Ví dө: khi thêm mӝt axit amin nào ÿó vào môi trѭӡng nuôi cҩy thì tӃ bào sӁ không cҫn Wәng hӧp này nӳa. Do ÿó cǊng sӁÿình chӍ quá trình sinh tәng hӧp enzym, xúc tác cho quá trình tәng hӧp nên chính axit amin ÿó. Enzym này chӍÿѭӧc tәng hӧp trӣ lҥi khi có nhu Fҫu nghƭa là khi làm giҧm nӗng ÿӝ axit amin tѭѫng ӭng. Ĉӕi vӟi hӋ thӕng phân nhánh nghƭa là quá trình dүn ÿӃn viӋc tҥo thành nhiӅu sҧn phҭm cuӕi cùng khác nhau tӯ mӝt cѫ chҩt chung ban ÿҫu thì cѫ chӃ trҩn áp có thӇÿѭӧc thӵc hiӋn theo các cách khác nhau. Ví dө: Phҧn ӭng ÿҫu tiên cӫa quá trình sinh tәng hӧp các axit amin lizin, methionin, treonin ÿӅu do enzym aspactokinaza xúc tác. Enzym này có 3 izoenzim. Ký hiӋu: al, am, at. Quá trình sinh tәng hӧp al sӁ bӏ trҩn áp bӣi nӗng ÿӝ lizin. am cӫa methionin. Riêng ÿӕi vӟi at thì treonin vӯa là sҧn phҭm cuӕi cùng cӫa cҧ quá trình vӯa là Fѫ chҩt ban ÿҫu ÿӇ sinh tәng hӧp izolѫxin. Do ÿó quá trình sinh tәng hӧp axitt chӍ bӏ trҩn áp khi cҧ treonin và izolexin ÿҥt nӗng ÿӝ cao vѭӧt quá nhu cҫu cӫa tӃ bào. Có thӇ minh hoҥ cѫ chӃ trҩn áp này theo sѫÿӗ: Trang: 5
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch al 6 Phҧn ӭng E 4 Phҧn ӭngLizin am A B C D Methionin at G Treonin 4 PhIzoloxinҧn ӭng Ghi chú: A – Cѫ chҩt Aspartic ban ÿҫu. B, C, D, G là các sҧn phҭm trung gian có tác dөng trҩn áp. Nhѭ vұy ӣÿây sӵ trҩn áp chӍ xҧy ra khi có sӵ hӧp ÿӗng tác dөng cӫa cҧ 2 sҧn phҭm. 1Ӄu trҩn áp hӧp ÿӗng này cùng xҧy ra ÿӕi vӟi quá trình sinh tәng hӧp enzym giӕng nhau xúc tác cho các phҧn ӭng song song tҥo thành 2 sҧn phҭm cuӕi cùng khác nhau. Ví dө: quá trình sinh tәng hӧp valin và izolѫxin do 4 enzym giӕng nhau xúc tác theo sѫÿӗ sau: Į-axetolactat Valin Įȕ-Dioxy Į-Xeto 1 izovalerat izovalerat CH3CHO hoҥt ÿӝng 2 3 4 Į-axeto Įȕ-Dioxy Į-Xeto Izoloxin Į-Oxybutirat ȕ metylvalerat ȕ - metyl HiӋn nay ngѭӡi ta cho rҵng ARN mӟi là yӃu tӕ trҩn áp thӵc sӵ cho quá trình sinh tәng Kӧp các enzym xúc tác ÿӇ tәng hӧp các axit amin tѭѫng ӭng. + HiӋn tѭӧng cҧm ӭng (induction): là hiӋn tѭӧng ngѭӧc lҥi vӟi hiӋn tѭӧng trҩn áp làm Wăng lѭӧng enzym cӫa tӃ bào (Ghi chú ӣ sѫÿӗ trên: 1: Į-axeto.Į-oxyaxítintetaza 2: reductoizomeraza (axetolactat mutaza) 3: hydrooxyaxit dehydrataza 4: amino transpheraza Trang: 6
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Nghƭa là khi trong môi trѭӡng nuôi cҩy có chҩt cҧm ӭng sӁ kích thích cho vi sinh vұt sinh tәng hӧp nên nhiӅu enzym hѫn so vӟi bình thѭӡng. Chҩt cҧm ӭng ÿѭӧc xem nhѭ là mӝt chҩt nӅn (Chҩt cѫ sӓ, bӝ khung cácbon) ÿӇ sinh Wәng hӧp enzym. HiӋn nay, ngѭӡi ta chӍ ra rҵng có thӇ các sҧn phҭm trung gian cӫa quá trình biӃn ÿәi ÿóng vai trò là chҩt cҧm ӭng, thұm chí nhiӅu cѫ chҩt cӫa enzym cǊng có thӇ là chҩt cҧm ӭng. ĈLӇn hình là các gluxit (monosaccarit và polysaccarit). Trong sӕ các enzim do vi sinh vұt tәng hӧp, có nhӳng enzim bình thѭӡng chӍÿѭӧc Wәng hӧp rҩt ít ӓi nhѭng khi thêm mӝt sӕ chҩt nhҩt ÿӏnh vào môi trѭӡng nuôi cҩy thì hàm Oѭӧng cӫa chúng có thӇ tăng lên rҩt nhiӅu lҫn. Monod và Cohn (1925) gӑi các enzim này là enzim cҧm ӭng, chҩt gây nên hiӋu quҧ này là gӑi là chҩt cҧm ӭng. Các enzim cҧm ӭng thѭӡng là nhӳng enzim xúc tác cho quá trình phân giҧi nhѭ: Proteinaza, amylaza, pectinaza, penixilinaza, ȕ_galactosidaza ӣ tӃ bào E. coli. Khi nuôi cҩy E. coli trong môi trѭӡng glucoza và glyxerin, vi khuҭn chӍ tәng hӧp khoҧng 10 phҫn tӱȕ_galactosidaza/tӃ bào. NӃu nuôi cҩy trên môi trѭӡng lactoza là nguӗn các bon duy nhҩt thì hàm lѭӧng enzim là 6¸7% tәng hӧp lѭӧng protein cӫa tӃ bào. Trích ra tӯ tӃ bào chӭa ÿӃn 6000 phҫn Wӱ enzim, nghƭa là tăng lên gҫn 1000 lҫn so vӟi khi nuôi cҩy trong môi trѭӡng cӫ. 6ӵ cҧm ӭng thѭӡng có tính chҩt dây chuyӅn. Trong hӋ thӕng gӗm nhiӅu phҧn ӭng, cѫ chҩt ÿҫu tiên cӫa hӋ thӕng có thӇ cҧm ӭng quá trình sinh tәng hӧp tҩt cҧ các enzim xúc tác cho quá trình chuyӉn hoá cӫa nó. ĈLӅu này ÿѭӧc thӵc hiӋn theo cѫ chӃ sau: Trѭӟc hӃt chҩt cҧm ӭng làm tăng quá trình sinh tәng hӧp enzim tѭѫng ӭng, sau ÿó sҧn phҭm này lҥi Fҧm ӭng tәng hӧp enzim ÿӇ phá huӹ nó, tiӃp theo sҧn phҭm thӭ 2 này lҥi cҧm ӭng tәng Kӧp nên enzim thӭ 3, Ví dө: Histidin có tác dөng cҧm ӭng hàng loҥt các enzim xúc tát cho quá trình chuyӉn hoá nó thành axít glutamic (Chasin và Magasamil (1968)). + Cѫ chӃÿLӅu hòa theo kiӇu trҩn áp và cҧm ӭng: Zocob và Monod ÿã ÿӅ ra mô hình giҧi thích cѫ chӃ cӫa 2 hiӋn tѭӧng trҩn áp và cҧm ӭng trên cѫ sӣ di truyӅn. Theo mô hình này, sӵ trҩn áp và cҧm ӭng sinh tәng hӧp enzim ÿѭӧc thӵc hiӋn theo cùng mӝt cѫ chӃ chung dӵa trên cѫ sӣÿLӅu hoà hoҥt ÿӝng cӫa các gene dѭӟi tác dөng cӫa các chҩt phân tӱ thҩp. Nhӳng căn cӭ chính cӫa thuyӃt này nhѭ sau: 1) Có sӵ phân hoá chӭc năng cӫa các giai ÿRҥn khác nhau trong phân tӱ AND trong nhiӉm sҳc thӇ, dӵa vào chӭc phұn cӫa chúng trong qui trình sinh tәng hӧp Protein có thӇ chia thành các loҥi gene sau: - Gene cҩu trúc (ký hiӋu: S1,S2,S3) : mã hoá phân tӱ protein enzim ÿѭӧc tәng hӧp, tӭc là thӭ tӵ các axit amin trong phân tӱ enzim ÿѭӧc tәng hӧp là tuǤ thuӝc vào thӭ tӵ các nucleotit cӫa ÿRҥn gene này. Các gene mã hóa các enzim ÿӵѫc íҳp xӃp liӅn nhau thành Pӝt nhóm trên nhiӉm sҳc thӇ. Chúng là khuôn ÿӇ tәng hӧp phân tӱ ARNtt. - Gene Operator (ký hiӋu: O): ӣ cҥnh nhóm gene cҩu trúc, không mã hoá protein nhѭng ÿҧm bҧo cho quá trình sao chép mã ӣ gene cҩu trúc theo cѫ chӃ “Ĉóng mӣ” tӵa nhѭ công tҳc cӫa mӝt dây ÿèn. Quá trình sao chép chӍ có thӇ tiӃn hành khi gene operator ӣ trҥng thái “mӣ” (không kӃt vӟi chҩt nào cҧ) và ngӯng lҥi khi nó bӏ “ÿóng” (kӃt hӧp vӟi Pӝt chҩt ÿһc biӋt gӑi là chҩt trҩn áp represson). Mӝt gene operator có thӇ “phө trách” mӝt nhóm gene cҩu trúc các gene cҩu trúc này cùng vӟi gene operator cӫa chúng hӧp thành Trang: 7
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Pӝt ÿѫn vӏ sao chép sѫ cҩp gӑi là mӝt operon. Sӵ tәng hӧp ARNttÿѭӧc bҳt ÿҫu ӣ mӝt ÿҫu cӫa operon và chuyӇn qua các gene cҩu trúc ÿӇÿӃn ÿҫu kia cӫa operon. - Gene Promotor (gene hoҥt hoá ký hiӋu P) Ĉҵng trѭӟc gene operator là ÿRҥn And mà ARN-polimeraza sӁ kӃt hӧp và bҳt ÿҫu quá trình sao chép các gene cҩu trúc. - Gene ÿLӅu hoà regulator (ký hiӋu R): Gene này mã hoá cho mӝt protein ÿһc biӋt gӑi là chҩt trҩn áp (repressor). Chҩt trҩn áp có vai trò “ÿóng-mӣ” gene operator. Do ÿó gene ÿLӅu hoà có thӇ kiӇm tra quá trình sao chép gene cҩu trúc thông qua chҩt trҩn áp này. + Không có repressor (sҧn phҭm cuӕi cùng) R P O S1 S2 S3 ADN ARNtt Phiên mã E1 E2 E3 A BCD + Có repressor (sҧn phҭm cuӕi cùng): Trang: 8
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch RP O S1 S2 S3 ADN : ARN-polymeraza : Repressor : coreressor R: Gene ÿLӅu hoà, P: Gene promotor, O: Gene Operator, S1, S2, S3: Các gene cҩu trúc. 2) Trong trѭӡng hӧp ÿLӅu hoà sinh tәng hӧp enzim theo cѫ chӃ trҩn áp, repressor do gene ÿLӅu hoà tәng hӧp còn ӣ dҥng không hoҥt ÿӝng (aporepessor) chѭa có khҧ năng kӃt Kӧp vӟi gene operator nên quá trình sao chép các gene cҩu trúc tiӃn hành bình thѭӡng. Các enzim ÿѭӧc tәng hӧp xúc tác cho các phҧn ӭng ÿӇ tҥo thành các sҧn phҭm cuӕi cùng, Vҧn phҭm cuӕi cùng này lҥi có khҧ năng kӃt hӧp vӟi aporepessor và hoҥt hoá nó. Aporepessor ÿã ÿѭӧc hoҥt hoá sӁ kӃt hӧp vӟi operator ngăn cҧn quá trình sao chép các gene cҩu trúc, làm ngӯng viӋc tәng hӧp ARNtt tѭѫng ӭng do ÿó ÿình chӍ quá trình sinh Wәng hӧp các enzim tѭѫng ӭng. Trong trѭӡng hӧp này các sҧn phҭm mӟi ÿѭӧc coi nhѭ là chҩt trҩn áp (repressor). 3) Ĉӕi vӟi trѭӡng hӧp cҧm ӭng: + Không có chҩt cҧm ӭng R P O S1 S2 S3 ADN + Có chҩt cҧm ӭng: Trang: 9
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch R P O S1 S2 S3 ADN ARNtt E1 E2 E3 A BC D 6ѫÿӗ minh hoҥ cѫ chӃ cҧm ӭng sinh tәng hӧp enzim : Chҩt cҧm ӭng Khi không có mһt chҩt cҧm ӭng, chҩt trҩn áp (repressor) ÿѭӧc tәng hӧp ÿã ӣ trҥng thái hoҥt ÿӝng, nó kӃt hӧp vӟi gene ÿLӅu khiӇn operator, quá trình sao chép mã cӫa gene cҩu trúc bӏ bao vây nên các enzim tѭѫng ӭng không ÿѭӧc tәng hӧp. Khi có mһt chҩt cҧm ӭng thì chҩt trҩn áp repressor bӏ mҩt hoҥt ÿӝng, tách khӓi gene ÿLӅu khiӇn operator và quá trình sao chép mã bҳt ÿҫu, kӃt quҧ làm tăng lѭӧng enzim ÿѭӧc Wәng hӧp. Nhѭ vұy ta thҩy hiӋn tѭӧng trҩn áp và cҧm ӭng sinh tәng hӧp enzim là hai mһt ÿӕi lұp Fӫa mӝt quá trình hoá sinh thӕng nhҩt ÿѭӧc thӵc hiӋn thông qua hoҥt ÿӝng “ÿóng-mӣ” gene dѭӟi tác dөng cӫa các chҩt phân tӱ thҩp 2.1.2. ĈLӅu hoà tѭѫng tác giӳa ARN-polymeraza vӟi gene promotor: NhiӅu dҩu hiӋu thӵc nghiӋm cho thҩy các gene bҧo ÿҧm sinh tәng hӧp mӝt sӕ enzim Fҧm ӭng xúc tác cho quá trình phân giҧi không chӍ chӏu sӵ kiӇm tra theo cѫ chӃ cҧm ӭng nhѭÿã trình bày ӣ trên mà còn chӏu sӵ kiӇm tra theo mӝt cѫ chӃ khác nhӡ tác dөng cӫa AMP vòng (AMPv) gӑi là “trҩn áp phân giҧi” (cactabolic repressor) AMPv có tác dөng kích thích cӫa AMPvÿӕi vӟi quá trình sao chép mã cӫa các operon phân giҧi. HiӋn tѭӧng này ÿã ÿѭӧc nghiên cӭu nhiӅu ÿӕi vӟi operon lactoza. Theo nhiӅu tác giҧ, tác dөng kích thích cӫa AMPvÿӕi vӟi quá trình sao chép mã ÿѭӧc thӵc hiӋn nhӡ mӝt protein ÿһc biӋt làm trung gian gӑi là protein nhұn AMPv, hay còn gӑi là protein hoҥt hoá gene phân giҧi CAP (catabolite gene activator protein). Khi AMPv kӃt hӧp vӟi CAP tҥo thành phӭc hӧp có tác dөng hoҥt hoá gene promotor làm cho ARN-polymeraza dӉ dàng kӃt hӧp vӟi nó ÿӇ Eҳt ÿҫu quá trình sao chép mã. Nhѭ vұy AMPv có tác dөng làm tăng cѭѫng quá trình sao chép. CǊng có ý kiӃn cho rҵng phӭc hӧp AMPv-CAP-ARN-polymeraza cho phép bҳt ÿҫu quá trình sao chép mã. Trang: 10
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch AMPv CAP i P O Z a) ARNtt Ĉҫu vào AMPv ARN-Polymeraza i O Z b) CAP AMPv i ARN O Z c) CAP Pol i ARN O Z d) CAP Pol MiӅn bҳt ÿҫu vào Mô hình bҳt ÿҫu sao chép mã cӫa operon lactoza a – Phӭc hӧp CAP-AMPv chuҭn bӏ kӃt hӧp vào miӅn ÿһc biӋt cӫa ADN. b – Sau khi phӭc CAP-AMPv kӃt hӧp vào, nó làm yӃu ÿRҥn ADN. c - ARN-polymeraza kӃt hӧp vào miӅn ÿһc biӋt cӫa nó. d - ARN-polymeraza “trѭӧc” dӑc theo ÿRҥn ADN nhѭ mӝt “cái bӑt” ÿӃn miӅn bҳt ÿҫu. Ngѭӡi ta cǊng nhұn thҩy glucza và mӝt sӕ loҥi ÿѭӡng khác khi thêm vào môi trѭӡng nuôi cҩy vi khuҭn thѭӡng làm giàu lѭӧng AMPv trong tӃ bào, do ÿó làm giҧm quá trình sinh tәng hӧp nhiӅu enzim cҧm ӭng, ngay cҧ khi nó có chҩt cҧm ӭng trong môi trѭӡng. HiӋn tѭӧng này còn gӑi là “hiӋu ӭng glucoza” ÿѭӧc quan sát thҩy ӣ E. coli và mӝt sӕ vi khuҭn. Tuy nhiên cho ÿӃn nay vүn chѭa biӃt rõ cѫ chӃ làm giàu AMPv do glucoza và các ÿѭӡng khác 2.2. TuyӇn chӑn và cҧi tҥo giӕng vi sinh vұt cho enzim có hoҥt lӵc cao: ĈӇ chӑn giӕng vi sinh vұt có khҧ năng sinh tәng hӧp enzim cao, ngѭӡi ta có thӇ phân Oұp tӯ môi trѭӡng tӵ nhiên hoһc có thӇ dùng các tác nhân gây ÿӝt biӃn tác ÿӝng lên bӝ máy di truyӅn hoһc làm thay ÿәi ÿһc tính di truyӅn ÿӇ tҥo thành các biӃn chӫng có khҧ Qăng tәng hӧp ÿһc biӋt hӳu hiӋu mӝt loҥi enzim nào ÿó, cao hѫn hҷn chӫng gӕc ban ÿҫu. 2.2.1. Phѭѫng pháp gây ÿӝt biӃn: Ĉây là phѭѫng pháp hay ÿѭӧc dùng nhҩt nhҵm ÿӇ: - Tҥo nhӳng ÿӝt biӃn bӏ giҧm khҧ năng sinh tәng hӧp repressor hoһc tәng hӧp repressor có ái lӵc thҩp vӟi gene opertor. - Tҥo nhӳng ÿӝt biӃn tәng hӧp enzim có cҩu trúc bұc 1 thay ÿәi do ÿó có thӇ giҧm ÿӝ thay ÿәi vӟi kiӇu kìm hãm theo cѫ chӃ liên hӋ ngӵѫc. Trang: 11
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 1Ӄu sӵ thay ÿәi cҩu trúc bұc 1 xҧy ra ӣ vùng trung tâm hoҥt ÿӝng hoһc ӣ gҫn ÿó thì có thӇ làm thay ÿәi rõ rӋt hoҥt tính cӫa enzim. - Gây ÿӝt biӃn ӣÿRҥn gene hoҥt hoá promotor ÿӇ làm tăng áp lӵc cӫa nó ÿӕi vӟi ARN- polymaraza do ÿó làm tăng tӕc ÿӝ sao chép mã Dùng biӋn pháp này có thӇ làm tăng Oѭӧng glucoza-6-phosphatdehydrogenaza lên 6 lҫn. HiӋn tѭӧng ÿӝt biӃn thѭӡng liên hӋ vӟi sӵ thay ÿәi mӝt gene, chҷng hҥn bӏ “lӗi” mӝt bazѫ khi tái tҥo phân tӱ ADN. Ví dөӣ mӝt vӏ trí nào ÿó trên gene có thӭ tӵ nucleotit là G-X, nӃu nó bӏ thay thӃ bҵng A-T, T-A hoһc X-G thì phân tӱ ARNttÿѭӧc tәng hӧp trên ÿRҥn gene bӏ lӗi này cǊng sӁ khác vӟi ARNtt bình thѭӡng ӣ vӏ trí tѭѫng ӭng vӟi chӛ “lӗi” trên gene. Do ÿó sӁ tәng hӧp nên phân tӱ enzim khác vӟi bình thѭӡng ӣ mӝt sӕ gӕc axít amin. ĈӇ tҥo mӝt ÿӝt biӃn gene có thӇ dùng tác nhân vұt lý (tia tӱ ngoҥi, tia phóng xҥ) hay hoá hӑc (các hoá chҩt) tác dөng lên tӃ bào sinh vұt. 2.2.2. Phѭѫng pháp biӃn nҥp: Là sӵ biӃn ÿәi tính trҥng di truyӅn cӫa mӝt nòi vi sinh vұt dѭӟi ҧnh hѭӣng cӫa ADN trong dӏch chiӃt nhұn ÿѭӧc tӯ tӃ bào cӫa vi sinh vұt khác. Ӣÿây yӃu tӕ biӃn nҥp là ADN. 6ӵ chuyӉn vұt liӋu di truyӅn (ADN) tӯ tӃ bào cho ÿӃn tӃ bào nhұn có thӇ xҧy ra trong ӕng nghiӋm (invitro) khi cho tӃ bào nhұn tiӃp xúc vӟi dӏch chiӃt tӯ tӃ bào cho mà không có sӵ tiӃp xúc giӳa các tӃ bào. Các tӃ bào có thӇ nhұn bҩt kǤ loҥi ADN nào chӭ không ÿòi hӓi phҧi là ADN tӯ các giӕng hӑ hàng. Tuy nhiên tӃ bào chӍ có thӇ nhұn mӝt sӕÿRҥn ADN nhҩt ÿӏnh, thѭӡng không quá 10 ÿRҥn. Các ÿRҥn ADN ÿѭӧc di truyӅn trong biӃn nҥp có M=106-107 và phҧi có câu trúc xoҳn kép. TӃ bào không tiӃp nhұn các ÿRҥn ADN có kích thѭӟc nhӓ hѫn hoһc các ÿRҥn không có cҩu trúc xoҳn kép. HiӋn tѭӧng biӃn nҥp phә biӃn ӣ nhiӅu loài vi sinh Yұt nhѭ: Diplococus, Staphylococus, Hemophilus, Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Xantomonas. 2.2.3. Phѭѫng pháp tiӃp hӧp gene: Khác vӟi biӃn nҥp, ӣÿây vұt liӋu di truyӅn chӍÿѭӧc truyӅn tӯ tӃ bào cho ÿӃn tӃ bào nhұn khi hai tӃ bào tiӃp xúc vӟi nhau. Do vұy các vi sinh vұt có khҧ năng biӃn nҥp thì sӁ không có khҧ năng tham gia tiӃp hӧp gene nӳa. HiӋn nay quá trình tiӃp hӧp gene ÿã ÿѭӧc nghiên cӭu ӣ mӝt sӕ loài vi khuҭn nhѭ E. coli, salmonella, Pseudomonas aeruginosa. 2.2.4. Phѭѫng pháp tҧi nҥp: 9ұt liӋu di truyӅn (ADN) ÿѭӧc chuyӉn tӯ tӃ bào cho sang tӃ bào nhұn nhӡ vai trò trung gian cӫa thӵc khuҭn thӇ (phage). Trong quá trình tҧi nҥp, các ÿRҥn ADN ÿѭӧc chuyӉn tӯ WӃ bào cho ÿӃn tӃ bào tiӃp hӧp vӟi ADN cӫa tӃ bào nhұn. Do ÿó làm biӃn ÿәi tính chҩt di truyӅn cӫa tӃ bào nhұn. 2.3. Phѭѫng pháp bҧo quҧn giӕng vi sinh vұt : Khi sӱ dөng vi sinh vұt ÿӇ sҧn xuҩt enzim cҫn chӑn giӕng thuҫn chӫng, ÿã ÿѭӧc kiӇm tra ÿҫy ÿӫ vӅ các ÿһc tính hoá sinh, vi sinh, nuôi cҩy và cҫn ÿһc biӋt lѭu ý ÿӃn ÿLӅu kiӋn Eҧo quҧn giӕng. Thӵc tӃ khi bҧo quҧn giӕng gӕc trong mӝt thӡi gian dài có thӇ tҥo ra các biӃn dӏ ngүu nhiên không mong muӕn do ÿó ÿӏnh kǤ phҧi cҩy chuyӅn và kiӇm tra lҥi các ÿһc tính ban ÿҫu. Trang: 12
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 2.3.1. Phѭѫng pháp cҩy chuyӅn: Ĉây là phѭѫng pháp phә biӃn nhҩt dӉ thӵc hiӋn bҵng cách giӳ giӕng trên môi trѭӡng thҥch (thҥch nghiêng, hӝp petri, ) vӟi thành phҫn môi trѭӡng nuôi cҩy và ÿLӅu kiӋn nuôi Fҩy thích hӧp cho giӕng vi sinh vұt ÿó. Sau khi giӕng ÿã mӑc tӕt cҫn bҧo quҧn ӣ nhiӋt ÿӝ Oҥnh 3-40C và sau mӛi tuҫn phҧi cҩy chuyӅn lҥi. Khi cҩy chuyӅn chӍ lҩy bào tӱ hoһc khuҭn lҥc mà không nên lҩy cҧ môi trѭӡng dinh dѭӥng ÿӇ bҧo ÿҧm không chuyӅn các sҧn phҭm trao ÿәi chҩt vào môi trѭӡng mӟi (có thӇ gây nên nhӳng biӃn ÿәi bҩt lӧi không thӇ Oѭӡng hӃt ÿѭӧc). NӃu là xҥ khuҭn thì không nên bҧo quҧn giӕng trên môi trѭӡng thҥch mà nên giӳ trong ÿҩt ÿã khӱ trùng. ĈӇ kéo dài thӡi gian bҧo quҧn giӕng tӯ hàng tháng ÿӃn 1 năm, ngѭӡi ta phӫ mӝt lӟp paraphin lӓng ÿã tiӋt trùng trên bӅ mһt giӕng ÿӇ hҥn chӃ sӵ phát triӇn cӫa nó. Cҫn lѭu ý chӍ phӫ lӟp dҫu sau khi cҩy vi sinh vұt ÿҥt ÿӃn ÿӝ chín sinh lý. Phѭѫng pháp cҩy chuyӅn rҩt có hiӋu quҧÿӇ bҧo quҧn các giӕng nҩm men, vi khuҭn và Uҩt hӳu hiӋu, dӉ dàng triӇn khai giӕng ra sҧn xuҩt lӟn, hҥn chӃ các tai biӃn có thӇ dүn ÿӃn Kѭ hӓng giӕng gӕc. 2.3.2. Phѭѫng pháp làm khô: %ҵng cách giӳ giӕng trên cát, ÿҩt, silicagen trong ÿLӅu kiӋn khô ráo (tҩt cҧÿӅu ÿѭӧc khӱ trùng cҭn thұn). Trong ÿLӅu kiӋn nhѭ vұy sӁ hҥn chӃ sӵ phát triӇn tiӃp tөc cӫa giӕng khi bҧo quҧn. Phѭѫng pháp này rҩt hay ÿѭӧc sӱ dөng ÿӇ bҧo quҧn nҩm mӕc, xҥ khuҭn, Pӝt vài loài nҩm men, vi khuҭn thӡi gian giӳ giӕng có thӇÿѭӧc 1 năm. Phѭѫng pháp làm khô cǊng thӵc hiӋn ÿѫn giҧn, không cҫn dөng cөÿҳt tiӅn. Tuy nhiên giӕng nhѭ phѭѫng pháp cҩy chuyӅn thӡi gian bҧo quҧn tѭѫng ÿӕi ngҳn. 2.3.3. Phѭѫng pháp ÿông khô: 7ӭc là làm khô băng sҩy chân không thăng hoa (nêu nguyên tҳc), còn gӑi là sҩy lҥnh ÿӇ tҥo nên sҧn phҭm ÿông khô (thӵc phҭm ÿông khô, các vұt phҭm sinh hӑc, y hӑc ÿông khô ). Ĉây là phѭѫng pháp bҧo quҧn lâu dài ÿӃn 10 năm mà không làm cho giӕng bӏ biӃn ÿәi ÿһc tính nhѭng ÿòi hӓi công nghӋ cao, thiӃt bӏÿҳt tiӅn, chi phí bҧo quҧn lӟn. +ѫn nӳa mӝt sӕ loài vi sinh vұt nhѭ nҩm mӕc không có bào tӱ và mӝt sӕ loҥi vi rút tӓ ra không thích hӧp khi bҧo quҧn ÿông khô. 2.3.4. Phѭѫng pháp làm lҥnh ÿông trong nitѫ lӓng: Khí nitѫ hoá lӓng ӣ nhiӋt ÿӝ rҩt thҩp -1650C ÿӃn -1960C nên nӃu bҧo quҧn vi sinh vұt ӣ môi trѭӡng này sӁ rҩt tӕt vì giӕng ÿѭӧc giӳ bҩt biӃn trên 10 năm. Tuy nhiên ÿây là lƭnh Yӵc công nghӋ cao (cҫn nitѫ nguyên chҩt và lҥnh thâm ÿӝ) nên chi phí bҧo quҧn rҩt cao. 2.4. Môi trѭӡng nuôi cҩy vi sinh vұt sinh tәng hӧp enzim: Ĉây là yӃu tӕÿҫu tiên ҧnh hѭӣng trӵc tiӃp ÿӃn hoҥt ÿӝng sӕng cǊng nhѭ khҧ năng sinh Wәng hӧp enzim cӫa vi sinh vұt. Môi trѭӡng chҫn chӭa ÿҫy ÿӫ các chҩt C, N, H, O. Các chҩt vô cѫ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chҩt vi lѭӧng khác. 2.4.1. Nguӗn cácbon: Thѭӡng là hӧp chҩt hӳu cѫ trong ÿó chӫ yӃu là gluxit, tuǤ thuӝc vào ÿһc tính cӫa enzim và nòi vi sinh vұt mà ngѭӡi ta lӵa chӑn cho thích hӧp. - Ĉӕi vӟi các hӋ vi sinh vұt sinh enzim amylaza: ÿây là enzim cҧm ӭng ÿLӇn hình vì Yұy môi trѭӡng nuôi cҩy phҧi có các chҩt cҧm ӭng: tinh bӝt, dextrin, mantoza. Qua Trang: 13
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch nghiên cӭu ngѭӡi ta nhұn thҩy ba loҥi gluxit là nguӗn cácbon tӕt nhҩt ÿӇ sinh tәng hӧp amylaza ÿҥt hiӋu quҧ cao. Chҷng hҥn hiӋu suҩt sinh tәng hӧp trên môi trѭӡng gluxit khác nhau vӟi mӝt sӕ loҥi enzim amylaza nhѭ sau: + Ĉӕi vӟi Į-amylaza: Tinh bӝt > dextrin > mantoza > glucoza > saccaroza > galactoza > manit > avabinoza. + Ĉӕi vӟi Oligo-1,6-glucoridaza (dextrinaza): Tinh bӝt > dextrin > mantoza > saccaroza > glucoza > lactoza > galactoza > orabinoza > manit. + Ĉӕi vӟi Į-1,4-amyloglucoridaza : Tinh bӝt > dextrin > mantoza > saccaroza, glucoza, lactoza, orabinoza > rabinoza > lactoza > manit. Khi nuôi cҩy theo phѭѫng pháp bӅ mһt nӃu dùng cám thì không cҫn bә sung tinh bӝt, nguӗn tinh bӝt rҩt phә biӃn, ngoài cám có thӇ dùng bӝt ngô, bӝt mì, bo bo. &ҫn chú ý trong ÿa sӕ trѭӡng hӧp, mӝt sӕ loҥi ÿѭӡng, ÿLӇn hình nhҩt là ÿѭӡng glucoza Oҥi kìn hãm sinh tәng hӧp các enzim thuӹ phân nói chung (chҷng hҥn theo cѫ chӃ trҩn áp phân giҧi do làm giàu lѭӧng AMPv trong tӃ bào). Ĉӕi vӟi các hӋ vi sinh vұt sinh enzim Proteaza: Có mӝt sӕ nguӗn gluxit khi dùng nuôi cҩy nҩm mӕc có khҧ năng sinh tәng hӧp enzim Proteaza có hoҥt lӵc cao, chҷng hҥn theo thӭ tӵ sau: + Ĉӕi vӟi Asp. Flavus 74: fructoza > glucoza > saccaroza > ramnoza > mantoza > galactoza > orabinoza > lactoza. + Ĉӕi vӟi Asp. Awamori 200: fructoza > manit > saccaroza > orabinoza > galactoza > lactoza. + Ĉӕi vӟi Asp. Oryae 79: fructoza > saccaroza > mantoza > glucoza > manit > orabinoza > galactoza > lactoza. Tinh bӝt là nguӗn cácbon cӫa nhiӅu chӫng vi khuҭn sinh tәng hӧp enzim proteaza. Ví Gө: Vi khuҭn Bac. Subtilis có khҧ năng sinh tәng hӧp proteaza ӣ môi trѭӡng tinh bӝt >8%, giӕng xҥ khuҭn ѭa nhiӋt Micromonospora vulgaricus sinh tәng hӧp proteaza trong môi trѭӡng 0.15-0.25% tinh bӝt. Ngoài ra mӝt sӕ loҥi hydrocacbon cǊng có nguӗn cácbon cho 125 chӫng vi sinh vұt. Chҷng hҥn, mӝt sӕ giӕng vi khuҭn Pseudomonas semginosa có khҧ năng sinh tәng hӧp proteinaza hoҥt lӵc cao trên môi trѭӡng n-paraphin vӟi 12, 14, 16 nguyên tӱ C hoһc proplylenglycol, hydrocacbon thѫm. - Ĉӕi vӟi các hӋ vi sinh vұt sinh enzim Pectinaza: Quá trình sinh tәng hӧp enzim pectinaza có liên quan ÿӃn chҩt cҧm ӭng. Ĉó chính là pectin, ÿѭѫng nhiên ÿó là nguӗn cácbon. NӃu sӱ dөng hӛn hӧp gluxit trong ÿó có pectin, ÿӇ nuôi cҩy vi sinh vұt thì hoҥt lӵc cӫa pectinaza ngoҥi bào có thӇ tăng 4-6 lҫn so vӟi khi nuôi cҩy không có pectin. Giӕng Asp. Niger ÿѭӧc nuôi cҩy trên môi trѭӡng có nhiӅu nguӗn cácbon nhѭ: Pectin, tình bӝt, isulin, lactoza, saccaroza, mantoza, galactoza nӗng ÿӝ 2, 4, 6% sӁ cho pectinaza có hiӋu suҩt cao. Tuy nhiên nên nuôi cҩy trên môi trѭӡng chӍ có monosacarit và glyxerin thì hoàn toàn không thӇ sinh tәng hӧp enzim này. Ĉѭӡng glucoza có tác dөng kìn hãm Trang: 14
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch (chҩt trҩn áp) sinh tәng hӧp enzim pectinaza trên môi trѭӡng nuôi cҩy là pectin và lactoza ÿôi vӟi loài Asp. Niger, Asp. Awamori. - Ĉӕi vӟi các hӋ vi sinh vұt sinh enzim xenluloza. Enzim xenluloza là enzim cҧm ӭng vì vұy trong môi trѭӡng nuôi cҩy vi sinh vұt sinh enzim này nhҩt thiӃt phҧi có xenluloza là chҩt cҧm ӭng và là nguӗn cácbon. Nguӗn xenluloza rҩt phong phú: giҩy lӑc, bông, bӝt xenluloza, lõi ngô, cám, mùn cѭa, Uѫm rҥ, than bùn. Ngoài ra có thӇ kӇ thêm chiӃt xuҩt xenlobiozo-octa axetat, cám mì, lactoza, balixyl cǊng có nguӗn cácbon tӕt. Ĉӕi vӟi giӕng Stachybotris atra, nguӗn gluxit Wӕt nhҩt ÿӇ sinh tәng hӧp enzim xenluloza là tinh bӝt 1%. Các nguӗn cácbon khác nói chung (glucoza, xenlobioza, axetat, xitrat, oxalat, ). Lҥi kìm hãm sinh tәng hӧp xenluloza, glyxerin không phҧi là chҩt cҧm ӭng cho enzim này. - Ngoài nguӗn gluxit là chӫ yӃu còn phҧi kӇÿӃn các nguӗn cácbon khác nhѭ: + Các axit béo phân tӱ lѭӧng lӟn (oleic, stearic, miniotic). Ví dө: axit oleic có tác dөng kích thích tәng hӧp glucoamylaza lên 2.5-3.5 lҫn so vӟi nӗng ÿӝ thích hӧp 2-3%. + Etanol và glyxerin trong nhiӅu trѭӡng hӧp nuôi cҩy ÿѭӧc dùng làm cácbon bә sung. + Trong sӕ các axit hӳu cѫ thì axit lactic hay ÿѭӧc vi sinh vұt hҩp thөÿӇ tәng hӧp enzim. Tuy nhiên ngѭӡi ta thѭӡng không bә sung trӵc tiӃp axit này vào môi trѭӡng nuôi Fҩy mà chӍ bә sung loҥi nguyên liӋu hay chӃ phҭm có chӭa nó hoһc sӁ gây sinh ra nó trong quá trình nuôi cҩy. 2.4.2. Nguӗn nitѫ: - Ĉӕi vӟi hӋ vi sinh vұt sinh enzim amylaza: Ӣ nhiӅu loài nҩm mӕc, nguӗn nitѫ tӕt nhҩt là NaNO3 và NH4NO3, nӗng ÿӝ nitѫ dѭӟi Pӭc 0.05% nҩm mӕc vүn phát triӇn ÿӵѫc nhѭng sinh tәng hӧp amylaza rҩt kém. 7ӹ lӋ tӕi ѭu giӳa tinh bӝt và NaNO3 trong môi trѭӡng Zapec nuôi cҩy nҩm mӕc sinh Wәng hӧp amylaza ÿҥt hiӋu quҧ cao nhҩt là 18:1. Các muӕi amoni vô cѫ (NH4H2PO4, (NH4)2SO4, NH4Cl), mӝt sӕ nguӗn nitѫ hӳu cѫ (gelatin, cazein, cao ngô) cho hiӋu quҧ sinh tәng hӧp amylaza thҩp. Trong thӵc tӃ, ngѭӡi ta thѭӡng dùng nguӗn nitѫ là các axit amin có nguӗn gӕc tӯ dӏch thuӹ phân protein (dӏch tӵ phân nҩm men, nѭӟc chҩm, cao ngô, dӏch chiӃt malt) ÿây vӯa là nguӗn nitѫ vӯa là nguӗn cácbon và chҩt cҧm ӭng sinh enzim. Các axit amin có tác dөng tӕt nhҩt trong nhӳng trѭӡng hӧp này là asparagin, axit glutamic; D,L serin, histamin, alanin. Trong khi casein thұm chí là ӭc chӃ thì dӏch thuӹ phân casein lҥi cҧm ӭng sinh tәng hӧp amylaza lên gҩp 2 lҫn so vӟi ban ÿҫu. - Ĉӕi vӟi hӋ vsv sinh enzyme proteaza: Nguӗn nitѫ sӱ dөng rҩt phong phú, bao gӗm 2 nhóm: vô cѫ và hӳu cѫ. + Ĉӕi vӟi mӝt sӕ loài nҩm mӕc thuӝc hӑ Asp. (oryzae, awamori, niger, flavas) nӃu môi trѭӡng có nguӗn nitѫ hӳu cѫ thì sӁ sinh tәng hӧp proteinaza axit tính cao. Trên môi trѭӡng Czapek nӃu thay NaNO3 bҵng cazein thì hoҥt lӵc proteinaza có thӇ tăng lên 3,5 Oҫn. Sinh tәng hӧp enzyme proteaza ÿѭӧc nâng cao khi môi trѭӡng nuôi cҩy có cҧ hai nguӗn nitѫ hӳu cѫ và vô cѫ. NӃu môi trѭӡng chӍ có nguӗn nitѫ vô cѫ sӁ dүn ÿӃn ngӯng sinh tәng hӧp enzyme này. + Trong quá trình nuôi cҩy vi khuҭn, trong sӕ các nguӗn nitѫ vô cѫ thì NH4, H2PO4 là Wӕt hѫn cҧ. Các muӕi amon và nitrat khác ÿӅu làm giҧm hoҥt lӵc enzyme. Trang: 15
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch + Ĉӕi vӟi xҥ khuҭn ѭa nhiӋt Actynomyces Vulgaris U2 thì pepton là chҩt cҧm ӭng ÿӇ sinh tәng hӧp enzyme proteaza là tӕt nhҩt. + Các axit amin có ҧnh hѭӣng rõ rӋt nhҩt ÿӃn quá trình sinh tәng hӧp enzyme vsv nói chung. Chҷng hҥn glyxin, alanin, metionin, lѫxin làm tăng hoҥt lӵc proteaza cӫa chӫng ÿӝt biӃn Asp. Oryzae 251-90 lên 16% và chӫng nguyên thuӹ Asp. Oryzae 132-63 lên 7 - 14%. NhiӅu axit amin lҥi có tác dөng ӭc chӃ sinh tәng hӧp enzyme nhѭ: valin, axit glutamic, izolѫxin, treonin. Nói chung có khoҧng 10 axit amin nhѭ vұy. Axit amin có tác Gөng kích thích sinh tәng hӧp enzyme khi trong tӃ bào vsv không tӵ tәng lѭӧng ÿӫ lѭӧng axit amin tӵ do so vӟi môi trѭӡng nuôi cҩy. + Ngoài ra, các bazѫ purin nhѭ A (adenin), G (guanin) và các dүn xuҩt cӫa chúng, ARN và các sҧn phҭm thuӹ phân cǊng làm tăng ÿáng kӇ sinh tәng hӧp proteinaza vsv. - Ĉӕi vӟi hӋ vsv sinh tәng hӧp enzyme pectinaza: &Ǌng giӕng nhѭÿӕi vӟi hӋ vsv sinh tәng hӧp enzyme proteaza, nӃu dùng kӃt hӧp nitѫ Kӳu cѫ và vô cѫ sӁ có tác dөng tӕt ÿӃn quá trình sinh tәng hӧp pectinaza. Tuy nhiên, muӕi nitrat kim loҥi kiӅm lҥi kiӅm hãm enzyme này. Ĉӕi vӟi Asp. Niger, nguӗn nitѫ tӕn kém nhҩt ÿӇ sinh tәng hӧp pectinaza la NH4H2PO4. Ĉӕi vӟi Asp. Awamori thì lҥi là (NH4)2SO4. Trong khi ÿó thì N tӯ pepton, cazein thuӹ phân là hoàn toàn ӭc chӃ sӵ tҥo thành enzyme. - Ĉӕi vӟi nҩm mӕc Asp. Foetidus thì (NH4)2SO4, nѭӟc chiӃt cám, nѭӟc chiӃt nҩm men có tác dөng nâng cao hoҥt lӵc polygalacturonaza. Nói chung, tӍ lӋ thích hӧp nhҩt ÿӕi vӟi C/N khi tәng hӧp pectinaza trong khoҧng 7/1- 13/1. - Ĉӕi vӟi hӋ vsv sinh enzyme xenlulaza.: Nguӗn nitѫ thíh hӧp nhҩt ÿӕi vӟi nhóm vsv này là nguӗn muӕi nitrat. Trong ÿó NaNO3 làm cho môi trѭӡng kiӅm hoá tҥo ÿLӅu kiӋn thuұn lӧi cho sӵ tҥo thành xenlulaza. Cao ngô và cao nҩm men ( kӇ cҧ nѭӟc chiӃt nҩm men) cǊng có tác ÿӝng khác nhau ÿӃn khҧ năng sinh tәng hӧp xenlulaza tuǤ thuӝc giӕng vsv. Các muӕi amoni ÿã có tác dөng thұm chí ӭc chӃ quá trình sinh tәng hӧp vì chúng làm cho môi trѭӡng bӏ axit hoá gây ӭc chӃ quá trình sinh tәng hӧp thұm chí làm mҩt hoҥt tính enzyme ngay sau khi tҥo thành trong môi trѭӡng. 2.4.3. Nguӗn các nguyên tӕ khoáng và các yӃu tӕ (chҩt) kích thích sinh trѭӣng: - Muӕi khoáng rҩt cҫn thiӃt cho hoҥt ÿӝng cӫa vsv, ÿһc biӋt là ÿӕi vӟi các quá trình sinh tәng hӧp các enzyme kim loҥi. ĈӇ sinh tәng hӧp a-amylaza và glucoamylaza, nӗng ÿӝ MnSO4 thích hӧp nhҩt là 0,05%. NӃu thiӃu muӕi này và muӕi photphat kali thì vsv không thӇ sinh tәng hӧp ÿѭӧc dextrinaza. Hoҥt lӵc a-amylaza và dextrinaza ÿѭӧc nâng cao ӣ nӗng ÿӝ KH2PO4 1% và hoҥt lӵc glucoamylaza ӣ nӗng ÿӝ KCl 0,05%, dextrinaza ӣ Qӗng ÿӝ thích hӧp nhҩt là 0,15%. -Ion Mg 2+ có tác dөng sinh tәng hӧp và әn ÿӏnh các enzyme có hoҥt tính ӣ nhiӋt ÿӝ cao. Ĉһc biӋt Ca2+có trong thành phҫn cӫa a-amylaza (trong 1 phân tӱ gam a-amylaza Fӫa Asp. Oryzae có 20g Ca, cӫa Bac. Subtilis có 4g Ca). Trong môi trѭӡng nuôi cҩy Ca2+ nâng cao khҧ năng tәng hӧp a-amylaza, bҧo vӋ enzyme này khӓi sӵ ҧnh hѭӣng cӫa proteaza. -Lѭu huǤnh S vӟi nguӗn chӫ yӃu là các axit amin chӭa S nhѭ metionin, cystein, sistin, và các muӕi sunphat (CuSO4). Các muӕi khoáng có Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu ҧnh hѭӣng Trang: 16
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch ÿӃn khҧ nҳng sinh tәng hӧp xenlulaza. Trong ÿa sӕ trѭӡng hӧp biotin (VTM H) và mӝt sӕ VTM cǊng rҩt cҫn thiӃt cho quá trình sinh tәng hӧp enzyme . Khi lӵa chӑn môi trѭӡng cҫn chú ý ÿӃn cҧ thành phҫn ÿӏnh tính và ÿӏnh lѭӧng sao cho quá trình sinh tәng hӧp enzyme mong muӕn là cao nhҩt. Muӕn vұy ngѭӡi ta có thӇ sӱ Gөng mӝt sӕ phѭѫng pháp sau: 1) Phѭѫng pháp tӕi ѭu hoá quy hoҥch thӵc nghiӋm toàn phҫn (ÿӫ yӃu tӕ): ÿòi hӓi nhiӅu thӡi gian và không ÿѭӧc chính xác lҳm. 2) Phѭѫng pháp toán hӑc mô hình hoá thӵc nghiӋm: cho phép xác ÿӏnh nhanh chóng và ÿúng ÿҳn tӍ lӋ các thành phҫn môi trѭӡng nuôi cҩy và các yӃu tӕ công nghӋ bҧo ÿҧm cho hoҥt ÿӝng sӕng và sinh tәng hӧp enzyme cao nhҩt. 2.4.4. Các loҥi môi trѭӡng nuôi cҩy vi sinh vұt sinh tәng hӧp enzyme : Có thӇ chia làm 2 loҥi: môi trѭӡng tәng hӧp và môi trѭӡng tӵ nhiên (phӭc hӧp). - Môi trѭӡng tәng hӧp: là môi trѭӡng bao gӗm các chҩt vӟi liӅu lѭӧng xác ÿӏnh (qua tìm hiӇu, nghiên cӭu), chҷng hҥn nguӗn cacbon có thӇ là tinh bӝt, xenlulolaza, ÿѭӡng, axit, rѭӧu, nguӗn Nitѫ vô cѫ hoһc hӳu cѫ (axit amin, peptin ). Loҥi môi trѭӡng này ÿѭӧc sӱ dөng cho mөc ÿích nghiên cӭu (có khi nó mang tên nhà nghiên cӭu ra nó: Czêpk-Dobrovonxki, Hasen ). - Môi trѭӡng tӵ nhiên: thѭӡng dùng các lӑai phӃ liӋu, nguyên liӋu( ÿa sӕ trong ÿó là thӵc phҭm) có chӭa các nguӗn cacbon, nitѫ, khoáng(ÿa lѭӧng, vi lѭӧng), các yӃu tӕ sinh Wәng hӧp trѭӣng. Mһt khác, các nguyên liӋu này lҥi có sҹn, rҿ tiӅn nên ÿѭӧc sӱ dөng rҩt nhiӅu trong công nghiӋp sҧn xuҩt các chӃ phҭm enzyme vi sinh vұt. - Các nguyên liӋu dӇ chuҭn bӏ làm môi trѭӡng tӵ nhiên bao gӗm: cám và bӝt hҥt cӕc, Qѭӟc chiӃt ngô, dӏch ép hoa quҧ, rau, khô dҫu, bã rѭӧu, rӍÿѭӡng, sҧn phҭm phân huӹ nҩm men bia, trҩu, lõi ngô( ÿӇ làm chҩt ÿӝn, tҥo xӕp). Khi lӵa chӑn sӱ dөng môi trѭӡng cҫn chú ý ÿӃn các chҩt có tác dөng ÿLӅu hoà sinh tәng hӧp enzyme, ÿһc biӋt các chҩt cҧm ӭng. Bҵng thӵc nghiӋm, ngѭӡi ta thҩy rҵng chҩt cҧm ӭng (tăng cѭӡng sinh tәng hӧp enzyme) thѭӡng là cѫ chҩt chӫ yӃu, các sҧn phҭm thuӹ phân cӫa nó hoһc chҩt tѭѫng tӵ cѫ chҩt. Ӣ trên ta ÿã biӃt là chҩt cҧm ӭng thѭӡng kӃt hӧp vӟi chҩt trҩn áp repressor làm cho nó không hoҥt ÿӝng( mҩt khҧ năng kӃt hӧp vӟi gene ÿLӅu khiӇn operator). Nhѭ vұy, chҩt Fҧm ӭng phҧi ÿi vào bên trong tӃ bào do ÿó không thӇ là nhӳng chҩt ÿҥi phân tӱ nhѭ protein, tinh bӝt, xenluloza, pectin. Theo mӝt sӕ tác giҧ thì các cѫ chҩt này là các cѫ chҩt 'tiӅn cҧm ӭng', dѭӟi tác dөng cӫa enzyme gӕc chúng bӏ thuӹ phân mӝt phҫn tҥo thành chҩt có phân tӱ lѭӧng bé hѫn ÿӇÿóng vai trò là chҩt cҧm ӭng thӵc sӵ. Chҷng hҥn, tӯ năm 1972 Iurikievits cho rҵng chҩt cҧm ӭng thӵc sӵ cӫa a-amylaza không phҧi là tinh bӝt mà là sҧn phҭm thuӹ phân mӝt phҫn cӫa nó: erytrodextrin. Tѭѫng tӵ nhѭ vұy, chҩt cҧm ӭng Fӫa enzyme proteinaza là các polypeptin, protein có phân tӱ lѭӧng nhӓ. - Khi lӵa chӑn môi trѭӡng nuôi cҩy và ÿһc biӋt là chҩt cҧm ӭng cҫn xem xét cҭn thұn các yӃu tӕ chi phí, giá thành sҧn xuҩt ra sҧn phҭm. 2.5. Các phѭѫng pháp nuôi cҩy vi sinh vұt: 9Ӆ nguyên tҳc có 2 phѭѫng pháp nuôi cҩy vsv thu enzyme là: phѭѫng pháp nuôi cҩy EӅ mһt (còn gӑi là phѭѫng pháp nәi) và phѭѫng pháp bӅ sâu (còn gӑi là phѭѫng pháp Trang: 17
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch nuôi cҩy chìm), trong ÿó ӣ phѭѫng pháp bӅ sâu còn có thӇ chia ra 2 phѭѫng pháp cө thӇ Kѫn: là nuôi cҩy chìm 1 bѭӟc (1pha) và nuôi cҩy chìm 2 bѭӟc (2 pha). 2.5.1. Phѭѫng pháp nuôi cҩy bӅ mһt: - Phѭѫng pháp này rҩt thích hӧp ÿӇ nuôi cҩy các loҥi nҩm mӕc (sinh tәng hӧp các hӋ enzyme amylaza, xenlulaza, pectinaza, proteaza) do khҧ năng phát triӇn nhanh, mҥnh, nên ít bӏ tҥp nhiӉm. Khi nuôi, nҩm mӕc phát triӇn bao phӫ bӅ mһt hҥt chҩt dinh dѭӥng Uҳn, các khuҭn ty cǊng phát triӇn ÿâm sâu vào lòng môi trѭӡng ÿã ÿѭӧc tiӋt trùng, làm ҭm (khuҭn ty cѫ chҩt). Ĉӕi vӟi mӝt sӕ mөc ÿích ÿһc biӋt, ngѭӡi ta nuôi vsv trӵc tiӃp trên bӅ Pһt hҥt gҥo (sҧn xuҩt tѭѫng), hҥt ÿұu tѭѫng (ÿұu tѭѫng lên men - misô) ÿã ÿѭӧc nҩu chín trӝn hҥt cӕc còn sӕng (làm men thuӕc bҳc, men dân tӝc, làm tѭѫng). - Ngѭӡi ta thѭӡng dùng cám mì, cám gҥo, ngô mҧnh, bӝt ngô, mҧnh hҥt bo bo có chҩt phө gia là trҩu. Cám, trҩu, có bӅ mһt tiӃp xúc lӟn, mông, tҥo ÿѭӧc ÿӝ xӕp nhiӅu, không có nhӳng chҩt gây ҧnh hѭӣng xҩu ÿӃn sӵ phát triӇn cӫa nҩm mӕc. TӍ lӋ các chҩt phө gia (chҩt ÿӝn) phҧi bҧo ÿҧm so cho hàm lѭӧng tinh bӝt trong khӕi nguyên liӋu không ÿѭӧc thҩp hѫn 20%, có thӇ bә sung thêm nguӗn nitѫ vô cѫ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho (P2O5, H3PO4 kӻ thuұt), nitѫ hӳu cѫ và các chҩt kích thích sinh trѭӣng nhѭ malt, nѭӟc chiӃt ngô, nѭӟc lӑc bã rѭӧu. *Quy trình công nghӋ: Nguyên liӋu Trӝn Làm ҭm Thanh trùng bҵng nhiӋt Làm nguӝi, làm tѫi Gieo giӕng vsv Nuôi cҩy giӕng ChuyӇn vào dөng cө nuôi cҩy Nuôi cҩy, theo dõi, xӱ lý + Làm ҭm môi trѭӡng : Có ý nghƭa quan trӑng, trong ÿLӅu kiӋn sҧn xuҩt lӟn, hàm ҭm tӕi ѭu cӫa môi trѭӡng cám là 58-60%. Khi ÿѭӧc nuôi cҩy trong ÿLӅu kiӋn tiӋt trùng nghiêm ngһt thì sӁÿҥt hoҥt ÿӝ enzyme cao nhҩt khi hàm ҭm 65-68%. Tuy nhiên nӃu môi trѭӡng quá ҭm sӁ bӏ dính EӃt (khi hҩp thanh trùng, làm tѫi, khi nuôi cҩy), dӉ bӏ nhiӉm vi sinh vұt tҥp (bӏ lên men Uѭӧu, lên men dҩm ). ĈӇ làm ҭm có thӇ dùng nѭӟc trӝn vӟi nguyên liӋu (nhào) rӗi thanh trùng hoһc làm ҭm sѫ bӝ rӗi thanh trùng sau ÿó dùng nѭӟc vô trùng (nѭӟc ngѭng Wө, nѭӟc ÿun sôi ÿӇ nguӝi) ÿӇÿLӅu chӍnh lҥi ÿӝҭm cӫa khӕi nguyên liӋu. Cách sau có thӇ Trang: 18
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch rút ngҳn thӡi gian làm nguӝi, khӕng chӃÿѭӧc ÿӝҭm chính xác hѫn nhѭng ÿòi hӓi phҧi thanh trùng ӣ nhiӋt ÿӝ và áp suҩt sao hѫn. + Thanh trùng bҵng hѫi nhiӋt: Làm cho môi trѭӡng ÿѭӧc tinh khiӃt hѫn vӅ phѭѫng diӋn vsv và làm cho chín (biӃn hình) môi trѭӡng (tinh bӝt, protein). Thông thѭӡng ngѭӡi ta thanh trùng bҵng hѫi nѭӟc trӵc tiӃp ӣ nhiӋt ÿӝ 120- 1300C trong 2-3h. + Làm nguӝi và làm tѫi môi trѭӡng ÿӇ gieo giӕng: Khӕi môi trѭӡng vӯa hҩp xong còn nóng và dính bӃt. Vì vұy phҧi làm nguӝi và làm Wѫi ÿӇ thuұn tiӋn cho viӋc gieo giӕng và phân phӕi vào các dөng cө nuôi. Yêu cҫu thӡi gian này phҧi ngҳn ÿӇ hҥn chӃ nhiӉm khuҭn tӯ bên ngoài. NhiӋt ÿӝ yêu cҫu ÿҥt ÿѭӧc ÿӇ gieo giӕng là 35-390C. + Nuôi cҩy nҩm mӕc giӕng: Nhҵm ÿӫ lѭӧng bào tӱ giӕng cho toàn bӝ môi trѭӡng nuôi cҩy. Quy trình công nghӋ thӵc hiӋn tѭѫng tӵ nhѭ trong sҧn xuҩt lӟn nhѭng phҧi thӵc hiӋn các ÿLӅu kiӋn kӻ thuұt ÿһc biӋt và khҳc khe hѫn nhѭ: nguyên liӋu phҧi tӕt, giàu chҩt dinh dѭӥng hѫn, ÿLӅu kiӋn nuôi cҩy khӕng chӃ nghiêm ngһt hѫn, thӡi gian nuôi cҩy dài hѫn (gҫn gҩp ÿôi) ÿӇ nҩm Pӕc hình thành nhiӅu bào tӱ và ÿӅu. + TiӃn hành quá trình nuôi cҩy : Sau khi gieo giӕng và phân phӕi vào các dөng cө nuôi (mành hay khay ÿөc lӛ) rӗi chuyӇn vào phòng nuôi có ÿLӅu chӍnh nhiӋt ÿӝ và ÿӝҭm tѭѫng ÿӕi cӫa không khí (j) FǊng nhѭ mӭc ÿӝ thông khí. Quá trình nuôi cҩy nҩm mӕc kéo dài 33-48h/mҿÿѭӧc trҧi qua 3 giai ÿRҥn: *Giai ÿRҥn 1: Tӯ khi nuôi cҩy mӕc gӕng ÿӃn giӡ nuôi thӭ 10-12. Xҧy ra sӵ trѭѫng nӣ bào tӱ và xuҩt hiӋn cuӕng nҩm. ĈӇ bҧo ÿҧm sӵ nҧy mҫm nhanh và hҥn chӃ nhiӉm tҥp, Fҫn giӳÿӝҭm nguyên liӋu 55-60%, j=96-100%, T=30-32oC. *Giai ÿRҥn 2: kéo dài trong 10-18h. Nҩm mӕc phát triӇn mҥnh, lan khҳp bӅ mһt và trong toàn khӕi môi trѭӡng trѭӡng (khuҭn ty ăn sâu vào cѫ chҩt) dүn ÿӃn hiӋn tѭӧng kӃt bánh. Quá trìnhhô hҩp và toҧ nhiӋt mҥnh làm môi trѭӡng trѭӡng bӏ khô xӕp, tăng hàm o Oѭӧng CO2, nhiӋt ÿӝ phòng nuôi tăng lên ÿӃn 38-40 C. ĈӇ khӕng chӃ nhiӋt ÿӝ thích hӧp 28-30oC càn thông gió (quҥt) và bão hoà ҭm không khí phòng nuôi. Giai ÿRҥn 3: kéo dài trong 10-20h và ÿһc trѭng nhҩt vì tҥo ra enzyme nhiӅu nhҩt. &ѭӡng ÿӝ trao ÿәi chҩt giҧm ÿi chút ít, nhiӋt toҧ ra ít hѫn nên tӕc ÿӝ bӕc hѫi nѭӟc cӫa môi trѭӡng nuôi cҩy cǊng giҧm theo. Quá trình nuôi cҩy ÿѭӧc chҩm dӭt khi nҩm mӕc ÿҥt ÿӝ già chín sinh lý và bҳt ÿҫu tҥo thành bào tӱ. 2.5.2. Phѭѫng pháp nuôi cҩy chìm: - Vi sinh vұt ÿѭӧc nuôi cҩy trong môi trѭӡng lӓng vӟi cѫ chҩt chӫ yӃu trong ÿa sӕ trѭӡng hӧp là tinh bӝt. ChӍ có mӝt sӕ ít giӕng vsv dùng nguӗn cѫ chҩt cacbon là ÿѭӡng glucoza, saccharoza. Thӵc tӃ, trong mӝt sӕ trѭӡng hӧp ngѭӡi ta ÿѭӡng hoá sѫ bӝ tinh bӝt trѭӟc khi thanh trùng (bҳng chӃ phҭm enzyme amylaza). Khi ÿó ÿѭӡng maltoza ÿѭӧc tҥo thành là chҩt cҧm ӭng tӕt, môi trѭӡng trѭӡng bӏ giҧm ÿӝ nhӟt nên dӉ dàng cho quá trình khuҩy trӝn và sөc khí. -Mӝt sӕ loҥi môi trѭӡng dinh dѭӥng ÿӇ sҧn xuҩt chӃ phҭm enzyme amylaza dөng trong CNSX rѭӧu etylic nhѭ sau: Trang: 19
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch +Môi trѭӡng nuôi cҩy 40m3 cӫa Trung Quӕc: %ӝt khoai lang : 400kg %ӝt bánh mì : 240kg Cám : 160kg. NaNO3 : 1,2kg 1ѭӟc vӯa ÿӫ hàm lѭӧng chҩt khô:3,33% + Môi trѭӡng sҧn xuҩt thӱӣ nhà máy rѭӧu Hà Nӝi: 1ѭӟc bã rѭӧu trong : 100 phҫn %ӝt ngô mӏn :1,5-2 phҫn 1ѭӟc ÿѭӡng hoá tӯ ngô16% : 5-10 phҫn (NH4)2SO4 : 0,4-0,5 phҫn P2O5 : 0,4-0,5 phҫn MgO : 0,15-0,20 phҫn ĈLӅu chӍnh pH ÿҥt 5-5,5 - Phѭѫng pháp nuôi cҩy bӅ sâu ÿòi hӓi phҧi ÿѭӧc vô trùng tuyӋt ÿӕi ӣ các khâu vӋ sinh Wәng hӧp, thanh trùng thiӃt bӏ, thanh trùng môi trѭӡng dinh dѭӥng, thao tác nuôi cҩy , không khí cung cҩp cho quá trình nuôi cҩy . Các giai ÿRҥn cӫa quá trình nuôi cҩy chìm 1 bѭӟc (1pha) gӗm: chuҭn bӏ môi trѭӡng nuôi cҩy, nuôi cҩy nҩm mӕc giӕng, nuôi cҩy nҩm mӕc sҧn xuҩt. + Chuҭn bӏ môi trѭӡng nuôi cҩy : Sau khi ÿã phӕi trӝn ÿúng tӍ lӋ các thành phҫn sӁÿѭӧc khuҩy trӝn kӻ rӗi thanh trùng Eҵng hѫi nhiӋt (trӵc tiӃp hay gián tiӃp bҵng nӗi 2 vӓ), nhiӋt ÿӝ 118-125oC, thӡi gian 15- 60phút, sau ÿó ÿѭӧc làm nguӝi ÿӃn nhiӋt ÿӝ 30oC thì tiӃn hành gieo cҩy nҩm mӕc giӕng vào. + Nuôi cҩy nҩm mӕc giӕng: Ĉѭӧc tiӃn hành qua 2 cҩp ÿӝ (bѭӟc), phòng thí nghiӋm và men giӕng trung gian. Ӣ cҩp PTN ÿѭӧc thӵc hiӋn trong các bình cҫu, tiӋt trùng môi trѭӡng làm nguӝi, cҩy giӕng rӗi nuôi trên máy lҳc (150-200lҫn/phút). Nҩm mӕc sӱ dөng oxy không khí qua nút bông và quá trình lҳc, thӡi gian nuôi 46-50h. Ӣ cҩp phát triӇn giӕng trung gian ngѭӡi ta chuyӇn Qѭӟc giӕng PTN vào thiӃt bӏ nuôi ÿã chӭa sҹn môi trѭӡng tiӋt trùng và làm nguӝi. Nuôi Fҩy có sөc khí vô trùng vӟi lѭu lѭӧng 15-20m3/m3h, thӡi gian 36-40h. ThӇ tích dӏch men giӕng bҵng 10% so vӟi dӏch men sҧn xuҩt vӅ sau. + Nuôi cҩy nҩm mӕc sҧn xuҩt: Trong quá trình nuôi cҩy cҫn phҧi sөc khí vô trùng và khuҩy trӝn, tiӃp dҫu phá bӑt nӃu có hiӋn tѭӧng tҥo bӑt trào ra khӓi nӗi lên men. Thӡi gian nuôi 1-4 ngày tuǤ theo giӕng vi sinh vұt. ViӋc khӕng chӃ pH, chӃÿӝ sөc khí và bҧo ÿҧm vô trùng là nhӳng yӃu tӕ quan trӑng quyӃt ÿӏnh hiӋu quҧ quá trình. Chҷng hҥn nӃu môi trѭӡng ÿѭӧc thêm muӕi amôni + Fӫa NH4NO3 thì khi NH4 ÿӵѫc vi sinh vұt sӱ dөng sӁ chuyӉn môi trѭӡng vӅ axit. NӃu Vӵ axit hoá thөÿӝng này có ҧnh hѭӣng sҩu ÿӃn sinh tәng hӧp enzym thì cҫn phҧi bә sung CaCO3ÿӇ trung hoà hoһc duy trì tӵÿӝng pHopt cho sinh tәng hӧp. NӃu nguӗn NaNO3 thì - + khi vi sinh vұt sӱ dөng NO3 sӁ còn lҥi Na sӁ kiӅm hoá môi trѭӡng, lúc ÿó lҥi phҧi dùng axit ÿӇ trung hoà. Trӏ sӕ pH ban ÿҫu cӫa môi trѭӡng nuôi cҩy có ҧnh hѭӣng nhҩt ÿӏnh ÿӃn Trang: 20
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Vӵ tҥo thành enzym. Ví dө: ÿӕi vӟi enzym Į-amylaza thì pHopt cӫa cácloҥi vi khuҭn là 7, Fӫa các loҥi nҩm mӕc là 5.6–5.7. 2.5.3. Phѭѫng pháp nuôi cҩy chìm 2 bѭӟc: (lên men 2 pha) Vi sinh vұt ÿѭӧc nuôi trong thiӃt bӏÿҫu tiên (giai ÿRҥn ÿҫu, bѭӟc ÿҫu tiên, pha thӭ nhҩt) ÿӇ phát triӇn ÿӃn mӭc ÿӝ cҫn thiӃt, sau ÿó ÿѭӧc chuyӇn sang thiӃt bӏ lên men tiӃp theo (giai ÿRҥn sau, bѭӟc thӭ hai, pha thӭ hai) có thành phҫn khác vӟi thiӃt bӏÿҫu ÿӇ sinh Wәng hӧp enzym. Pha thӭ nhҩt ÿѭӧc gӑi là pha sinh trѭӣng (trophophase), pha thӭ hai ÿѭӧc gӑi là pha chӃ tҥo enzym (idiophase). ĈLӇn hình cho phѭѫng pháp này xuҩt phát tӯ viӋc phát minh quá trình lên men chҩt kháng sinh streptomixin bӣi xҥ khuҭn streptomyces griseus vào năm 1944 bӣi Schatz, Bugie và Waksman. Nguӗn gluxit mà giӕng xҥ khuҭn này ÿӗng hoá ÿѭӧc ÿӇ sinh tәng hӧp streptomixin là: glucoza, tinh bӝt, dextrin, mantoza, galactoza, mannoza. Nguӗn Nitѫ ÿѭӧc sӱ dөng là protein cӫa bӝt ÿұu nành, bӝt cá, men khô, bӝt hҥt bông, gluten bӝt mì (nhóm xҥ khuҭn sinh tәng hӧp kháng sinh streptomixin nói chung ÿӅu có hoҥt lӵc proteaza rҩt mҥnh ÿӇ thuӹ phân các protein nói trên thành các axit amin cҫn thiӃt). Nguӗn Nitѫ vô cѫ bao gӗm các muӕi amoni, photpho hoà tan. %ҧn thân quá trình lên men streptomixin là các quá trình lên men 2 pha ÿLӇn hình. Pha sinh trѭӣng mҥnh, bào tӱ nҭy chӗi và mӑc thành sӧi sau 6-8h. Pha thӭ 2, khuҭn ty phát triӇn và bҳt ÿҫu sinh tәng hӧp kháng sinh. Trong quá trình này (ӣ pha thӭ 2) ÿӗng thӡi Wҥo thành mӝt phӭc cӫa mannoza vӟi streptomixin gӑi là manozilostreptomixin có hoҥt tính kháng sinh kém hѫn 6 lҫn so vӟi streptomixin và có thӇ coi ÿây là tҥp chҩt không mong muӕn trong quá trình sinh tәng hӧp. Tuy nhiên phӭc này dѭӟi tác dөng cӫa enzym Į- manozilostreptomixinaza có tình D-manoza ÿӇ giҧi phóng streptomixin vào năm 1969 Inamine và các cӝng sӵÿã nghiên cӭu sҧn xuҩt enzym Į- manozilostreptomixinaza theo phѭѫng pháp nôi cҩy chìm 2 bѭӟc nhѭ sau: Pha thӭ nhҩt: TӃ bào streptomyces gricus ÿѭӧc nuôi trong môi trѭӡng dinh dѭӥng có khuҩy trӝn và sөc khí trong 17hӣ nhiӋt ÿӝ 280C ÿӇ tҥo nhiӅu bào tӱ. Sau ÿó bào tӱÿѭӧc Uӳa sҥch và chuyӇn sang thiӃt bӏ tiӃp theo. Pha thӭ 2: TiӃp tөc nuôi cҩy ÿӇ sinh tәng hӧp enzym Į- manozilostreptomixinaza trong 18-24h. Lúc này tӕc ÿӝ phát triӇn cӫa vi khuҭn chұm lҥi, nhѭng sӵ chuyӇn hoá phӭc chҩt manozidosteptomixin nhanh chóng diӉn ra dѭӟi tác dөng cӫa enzym thành kháng sinh streptomixin. 2.5.4. So sánh phѭѫng pháp nuôi cҩy vi sinh vұt sinh tәng hӧp enzym : - Phѭѫng pháp nuôi cҩy bӅ mһt có nhӳng ѭu nhѭӧc ÿLӇm sau: + Nӗng ÿӝ enzym tҥo thành cao hѫn nhiӅu lҫn so vӟi dӏch nuôi cҩy chìm sau khi ÿã tách tӃ bào vi sinh vұt. Trong công nghiӋp rѭӧu muӕn ÿѭӡng hoá 100kg tinh bӝt chӍ cҫn 5kg chӃ phҭm nҩm mӕc bӅ mһt nhѭng phҧi cҫn ÿӃn 100lít nҩm mӕc chìm ÿã lӑc bã và tӃ bào vi sinh vұt. + ChӃ phҭm dӉ dàng sҩy khô mà không làm giҧm ÿáng kӇ hoҥt tính enzym, chӃ phҭm khô, dӉ bҧo quҧn, vұn chuyӉn, nghiӅn nhӓ hoһc sӱ dөng trӵc tiӃp nӃu không cҫn khâu tách và làm sҥch enzym. Trang: 21
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch + Tӕn ít năng lѭӧng (ĈLӋn, hѫi nѭӟc, công nhân) thiӃt bӏ, dөng cө nuôi cҩy ÿѫn giҧn, có thӇ thӵc hiӋn ӣ qui mô gia ÿình, trang trҥi cǊng nhѭӣ qui mô lӟn ÿӃn 20T/ngày. + Nuôi cҩy trong ÿLӅu kiӋn không cҫn vô trung tuyӋt ÿӕi và trong quá trình nuôi cҩy QӃu có nhiӉm trùng phҫn nào, khu vӵc nào thì chӍ cҫn loҥi bӓ canh trѭӡng phҫn ÿó. + Tuy nhiên phѭѫng pháp bӅ mһt có năng suҩt thҩp, khó cѫ khí hoá, tӵÿӝng hoá, cҫn diӋn tích nuôi lӟn, chҩt lѭӧng chӃ phҭm ӣ các mҿ không ÿӗng ÿӅu. - Phѭѫng pháp nuôi cҩy bӅ sâu có nhӳng ѭu nhѭӧc ÿLӇm sau: + Phѭѫng pháp nuôi cҩy hiӋn ÿҥi (công nghӋ cao) dӉ cѫ khí hoá, tӵÿӝng hoá, năng suҩt cao, dӉ tә chӭc sҧn xuҩt tiӃt kiӋm diӋn tích sҧn xuҩt. + Có thӇ nuôi cҩy dӉ dàng các chӫng vi sinh vұt ÿӝt biӃn có khҧ năng sinh tәng hӧp enzym cao và lӵa chӑn tӕi ѭu thành phân môi trѭӡng, các ÿLӅu kiӋn nuôi cҩy, enzym thu ÿѭӧc tinh khiӃt hѫn, ÿҧm bҧo ÿLӅu kiӋn vӋ sinh, vô trùng. + Tuy nhiên do thu ÿѭӧc canh trѭӡng có nӗng ÿӝ enzym thҩp nên khi tách thu hӗi enzym sӁ có giá thành cao (có ÿһt trѭӟc). Tӕn ÿLӋn năng cho khuҩy trӝn, nӃu không bҧo ÿҧm vô trùng sӁ bӏ nhiӉm hàng loҥt, toàn bӝ gây tәn thҩt lӟn. 2.6. Tách và làm sҥch chӃ phҭm enzym : (xem sѫÿӗ tәng quát ӣ trang 200 cӫa giáo trình) - Mөc ÿích yêu cҫu: Các chӃ phҭm enzym ÿѭӧc sӱ dөng ӣ các dҥng khác nhau theo Pӭc ÿӝ tinh khiӃt (hoҥt ÿӝ riêng). Trong mӝt sӕ trѭӡng hӧp, canh trѭӡng nuôi cҩy vi sinh Yұt có chӭa enzym ÿѭӧc sӱ dөng trӵc tiӃp dѭӟi dҥng thô không cҫn tách tҥp chҩt nӃu chúng không gây ҧnh hѭӣng ÿáng kӇÿӃn sҧn phҭm và quy trình công nghӋ sau này (Ví Gө: sҧn xuҩt rѭӧu, nѭӟc chҩm thӵc vұt, da). CǊng có khi ngѭӡi ta cҫn sӱ dөng chӃ phҭm enzym tinh khiӃt trong công nghiӋp dӋt, công nghiӋp mҥch nha, y hӑc, nghiên cӭu khoa Kӑc. Enzym nói chung rҩt dӉ bӏ giҧm hoҥt tính dѭӟi tác dөng cӫa các tác nhân bên ngoài do ÿó khi tách và tinh chӃ enzym ÿӇ tránh sӵ biӃn hình protein ҧnh hѭӣng lӟn ÿӃn hoҥt tính enzym cҫn tiӃn hành nhanh chóng ӣ nhiӋt ÿӝ thҩp, ÿӝ pH thích hӧp không có mһt các chҩt gây biӃn hinh enzym. 2.6.1. Thu dӏch enzym : - Ĉӕi vӟi trѭӡng hӧp enzym còn nҵm trong tӃ bào (enzym nӝi bào nuôi bҵng phѭѫng pháp bӅ mһt) thì cҫn phҧi giҧi phóng enzym bҵng cách phá vӥ tӃ bào thu nhiӅu cách nhѭ: + NghiӅn nhӓ, nghiӅn vӟi cát, nghiӅn vӟi vөn thuӹ tinh, nghiӅn bi. + ĈӇ tӃ bào tӵ phân huӹ. + Dùng tác dөng cӫa siêu âm hoһc tҥo áp suҩt thҭm thҩu cao, trích ly (chiên) bҵng muӕi, dung dӏch muӕi trung tính, dung môi hӳu cѫ + KӃt tӫa enzym bҵng các chҩt ÿLӋn ly thích hӧp. - Ĉӕi vӟi trѭӡng hӧp enzym tiӃt ra môi trѭӡng (enzym ngoҥi bào nuôi theo phѭѫng pháp chìm), ngѭӡi ta thѭӡng tách sinh khӕi và cһn bã khoi canh trѭӡng bҵng cách Oӑc li tâm, lӑc ép có sӱ dөng tác nhân trӧ lӑc (diatomit, ÿҩt hoҥt tính) hoһc các tác nhân trӧ kӃt tӫa (Ví dө: hӛn hӧp CaCl2+(NH4)2SO4ĺ CaSO4Ļ: lҳng cһn kéo theo sinh khӕi nên lӑc dӉ hѫn) Trang: 22
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 2.6.2. Thu nhұn chӃ phҭm kӻ thuұt: ChӃ phҭm kӻ thuұt là chӃ phҭm enzym chѭa ÿѭӧc tinh chӃ; có thӇ chӭa mӝt vài loҥi enzym chӫ yӃu, mӝt sӕ loҥi protein không phҧi enzym, các chҩt әn ÿӏnh và các tҥp chҩt khác. Dӏch enzym thu ÿѭӧc ӣ trên thѭӡng có nӗng ÿӝ chҩt khô thҩp 4-6g/l, bѭӟc ÿҫu ngѭӡi ta cô ÿһc chân không ӣ nhiӋt ÿӝ 350C ÿӃn nӗng ÿӝ 15-20g/l rӗi tiӃp tөc xӱ lý nhѭ sau: - TiӃp tөc cô ÿһc chân không ӣ nhiӋt ÿӝ 40-45 0C ÿӇÿҥt nӗng ÿӝ chҩt khô 30-35g/l, Eә sung thêm chҩt bҧo quҧn nhѭ NaCl, glyxerin, sorbitol, benzoat ta sӁ thu ÿѭӧc chӃ phҭm enzym kӻ thuұt ӣ dҥng có thӇ bҧo quҧn ӣ nhiӋt ÿӝ thѭӡng ÿѭӧc 1-2 năm. - %ә sung thêm các chҩt әn ÿӏnh ÿӇÿҥt nӗng ÿӝ chҩt khô 30-40g/l rӗi sҩy phun ӣ nhiêt ÿӝ 120 0C (nhiӋt ÿӝ khí thҧi 60 0C), chӃ phҭm kӻ thuұt thu ÿѭӧc ӣ dҥng bӝt . - .Ӄt tӫa enzym băng các dung môi thích hӧp nhѭ: dung môi hӳu cѫ (etanol, izopropanol, axeton), dùng muӕi trung tính phә biӃn nhҩt là (NH4)2SO4 dung dӏch bão hoà. Sau khi li tâm tách kӃt tӫa có thӇ trӝn thêm các chҩt әn ÿӏnh rӗi sҩy khô và nghiӅn mӏn ÿӇ thu ÿѭӧc chӃ phҭm dҥng bӝt. 2.6.3. Thu chӃ phҭm enzym tinh khiӃt: ViӋc tinh chӃ enzym có thӇ tiӃn hành băng nhiӅu phѭѫng pháp qua nhiӅu giai ÿRҥn: - Hoà tan chӃ phҭm kӻ thuұt vào nѭӟc hoһc dung dӏch nuӕi CaCl2ӣ nӗng ÿӝ thích Kӧp hoһc dung dӏch ÿӋm, kӃt tӫa trӣ lҥi băng etanol, axeton hay (NH4)2SO4. Quá trình này cҫn tiӃn hành nhanh chóng ӣ nhiӋt ÿӝ thҩp ÿӇ tránh sӵ vô hoҥt enzym. Ngoài ra muӕi NaCl cǊng ÿѭӧc hay ÿѭӧc dùng ÿӇ kӃt tӫa các enzym nguӗn gӕc ÿӝng vұt. KӃt tӫa ӣ pH gҫn ÿLӇm ÿҷng ÿLӋn cӫa enzym. Sau khi kӃt tӫa các muӕi vô Fѫÿѭӧc loҥi ÿi băng phѭѫng pháp thҭm tích, thҭm thҩu ngѭӧc hoһc lӑc gel. - Tách enzym bҵng phѭѫng pháp hҩp phө chӑn lӑc: Cho dӏch enzym chҧy tӯ tӯ qua cӝt chҩt hҩp phө (thѭӡng là hydrat oxit-nhôm, silicagel) các enzym khác nhau sӁÿѭӧc hҩp phө vӟi khҧ năng khác nhau, sau ÿó dùng các dung dӏch ÿӋm thích hӧp ÿӇ chiӃt rút enzym ra khӓi cӝt. Phѭѫng pháp dùng ÿӇ làm ÿұm ÿһc enzym. - Tách enzym băng phѭѫng pháp trao ÿәi ion: 'ӵa vào sӵ trao ÿәi ion giӳa enzym có ÿLӋn tích vӟi các ion trái dҩu cӫa chҩt nhӵa khi cho dung dӏch enzym chҧy tӯ tӯ qua cӝt chӭa các chҩt nhӵa trao ÿәi ion. Sau khi cӝt ÿã no (hӃt hiӋu lӵc) cho dung dӏch rӳa (dung dӏch chҩt ÿLӋn giҧi) có nӗng ÿӝ tăng dҫn chҧy qua cӝt ÿӇÿҭy ra khӓi nhӵa các enzym vӯa liên kӃt vӟi chúng. Khi ÿó enzym nào có áp Oӵc (liên kӃt) vӟi nhӵa kém nhҩt sӁ bӏÿҭy ra khӓi cӝt nhӵa trѭӟc. Nhѭ vұy các enzym khác nhau sӁÿѭӧc chiӃt ra khӓi cӝt theo tӯng phҫn chiӃt khác nhau trong ÿó cӭa phҫn chiӃt chӭa enzym cҫn thu vӟi nӗng ÿӝ cao nhҩt. Các nhӵa trao ÿәi ion thѭӡng là các chҩt nhӵa tәng hӳu cѫ : Dowex, Amberlit, Wolfatit, Permuit, các dүn xuҩt cӫa xenluloza. Sau khi làm sҥch cҫn sҩy khô chân không ӣ nhiӋt ÿӝ thҩp hoһc sҩy thăng hoa. Enzym tinh khiӃt có hoҥt tính cao hѫn nhiӅu so vӟi chӃ phҭm ban ÿҫu. Nhѭng do quá trình làm Vҥch rҩt khҳc khe và tӕn kém nên loҥi này chӍÿѭӧc dùng trong y hӑc, trong nghiên cӭu khoa hӑc ÿӇ xác ÿӏnh khӕi lѭӧng phân tӱ, cҩu trúc enzym. Trang: 23
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Chѭѫng 3: KӺ THUҰT SҦN XUҨT CHӂ PHҬM TӮ HҤT CӔC NҬY 0ҪM (MALT) Malt là loҥi hҥt hoà thҧo (hҥt cӕc) nҭy mҫm trong nhӳng ÿLӅu kiӋn nhân tҥo (nhiӋt ÿӝ, ÿӝҭm, thӡi gian) xác ÿӏnh gӑi tҳc là quá trình ӫ malt. Mөc ÿích chính trong quá trình ӫ malt là trích luӻÿѭӧc mӝt lѭӧng lӟn các enzym (chӫ yӃu là enzym amylaza) trong hҥt, ÿѭӧc sӱ dөng trong các lƭnh vӵc sau: - Trong công nghiӋp sҧn xuҩt rѭӧu etylic (cӗn, rѭӧu etylic) tӯ nguyên liӋu tinh bӝt. Malt là tác nhân ÿѭӡng hoá tinh bӝt (phѭѫng pháp sҧn xuҩt rѭӧu này có tên là phѭѫng pháp maltaza hay phѭѫng pháp malt). Có thӇ dùng các loҥi hҥt nhѭ: ÿҥi Pҥch, lúa mҥch ÿen, yӃn mҥch, kê, ngô ÿӇ sҧn xuҩt malt loҥi này. - Trong công nghiӋp sҧn xuҩt bia malt vӯa là tác nhân ÿѭӡng hoá tinh bӝt vӯa là nguyên liӋu chính (cùng vӟi hoa houblon và nӭѫc) và có thӇ có nguyên liӋu thay thӃ (Không phҧi malt ÿҥi mҥch). Malt bia chӫ yӃu ÿѭӧc sҧn xuҩt tӯÿҥi mҥch, ngoài ra ngѭӡi ta có thӇ dùng mӝt tӹ lӋ malt thay thӃ nhѭ thóc mҫm. - Trong công nghiêp sҧn xuҩt mұt tinh bӝt (ÿѭӡng nha, mҥch nha): malt vӯa là tác nhân ÿѭӡng hoá tinh bӝt vӯa là nguyên liӋu chính. Malt loҥi này ÿѭӧc sҧn xuҩt tӯ lúa, lúa mì, ngô, ÿҥi mҥch, kê thұm chí tӯ cӫ khoai lang nҭy mҫm. Mҥch nha sҧn xuҩt tӯ malt vүn là ngon nhҩt, cho chҩt lѭӧng tӕt nhҩt. - Trong mӝt sӕ ngành sҧn xuҩt thӭc ăn sinh dѭӥng, thӭc ăn kiên (cho ngѭӡi bӋnh, ngѭӡi già, trҿ em, gia xúc, gia cҫm non). Malt ÿѭӧc dùng ÿӇ phӕi chӃ vào thӵc ÿѫn Fӫa thӭc ăn. Quá trình sҧn xuҩt malt bao gӗm các khâu sau: Thu nhұn, xӱ lý, làm sҥch, phân loҥi và bҧo quҧn hҥt, 5ӱa, xát trùng và ngâm hҥt. Ѭѫm mҫm (nҭy mҫm) ta sӁ thu ÿѭӧc malt tѭѫi. 6ҩy malt tѭѫi. ;ӱ lý và bҧo quҧn malt khô. 3.1. Nguyên liӋu ÿҥi mҥch: Ĉҥi mҥch là cây hҥt cӕc ӣ các nѭӟc ôn ÿӟi, có khoҧng 30 giӕng khác nhau nhѭng chӍ có mӝt giӕng có ý nghƭa kinh tӃ là ÿҥi mҥch mùa (Hordeum sativum) còn lҥi ÿӅu là ÿҥi Pҥch dҥi. HiӋn nay diӋn tích trӗng và sҧn lѭӧng ÿҥi mҥch trên thӃ giӟi ÿӭng vӏ trí thӭ 4 sau lúa mì, lúa, ngô. Thuӝc giӕng ÿҥi mҥch mùa có 130 loҥi khác nhau và ÿѭӧc chia làm 3 nhóm chính: ÿҥi mҥch nhiӅu hàng (6 hàng và 4 hàng)-Hordium hexatichum; ÿҥi mҥch 2 hàng (Hordium disstichum) và ÿҥi mҥch trung gian (H. intermedium). Nhóm có giá trӏ trong sҧn xuҩt malt và bia là ÿҥi mҥch nhiӅu hàng. Ĉҥi mҥch sau khi thu hoҥch ÿѭӧc phѫi sҩy ÿӃn ÿӝҭm dѭӟi 13% ÿӇ bҧo quҧn cùng giӕng nhѭ các hҥt hoà thҧo khác, cҩu tҥo hҥt ÿҥi mҥch gӗm vӓ trҩu, vӓ quҧ, vӓ hҥt, alѫrông, nӝi nhӫ và phôi. TӍ lӋ trung bình trong các phҫn nhѭ sau: Trang: 24
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Tên bӝ phұn hҥt % khӕi lѭӧng toàn hҥt 9ӓ trҩu 12 9ӓ quҧ 3,5 ¸ 4 9ӓ hҥt 2 ¸2,5 Alѫrông 12 ¸14 Phôi 2,5 ¸ 3 1ӝi nhǊ 64,5 ¸ 6,8 Thành phҫn hoá hӑc trung bình cӫa ÿҥi mҥch theo % chҩt khô nhѭ sau: %ӝ Protein Chҩtbéo tinh Pentosan Xenluloza Tro phұn hҥt (N*5,7) Eӝt +ҥt 13,4 2,0 54,0 9,0 5,7 3,0 9ӓ 7,1 2,1 8,2 20,0 22,6 10,0 Phôi 28,6 7,6 46,0 20,0 1,1 10,0 Khӕi lѭӧng 1000 hҥt ÿһc trѭng cho ÿӝ mҭy cӫa hҥt nҵm trong khoҧng 15 ÷ 60 gam và ngѭӡi ta chia thành các loҥi: Ĉҥi mҥch hҥt nhҽ: Khӕi lѭӧng 1000 hҥt tӟi 30 gam Ĉҥi mҥch tѭѫng ÿӕi nhҽ: Khӕi lѭӧng 1000 hҥt tӟi 31 ÷40 gam Ĉҥi mҥch nһng: Khӕi lѭӧng 1000 hҥt tӟi > 51gam Kích thѭӟc hҥt dài 8 ÷ 10 mm, rӝng 3 ÷ 4 mm, dày 2 ÷3 mm. ChӍ sӕ chҩt lѭӧng quan trӑng cӫa ÿҥi mҥch ÿӇ sҧn xuҩt malt và bia là ÿӝ nҩy mҫm và Qăng lӵc nҩy mҫm. Ngoài ra, ÿҥi mҥch còn ÿѭӧc ÿһc trѭng bӣi ÿӝ chiӃt và hàm lѭӧng protein. ÿҥi mҥch tӕt có ÿӝ chiӃt ÿҥt tӟi 82% và hàm lѭӧng protein không quá 12%. NӃu hàm lѭӧng ÿҥt quá 12 % thì ÿӝ chiӃt sӁ thҩp, bia sӁ bӏÿөc; còn nӃu hàm lѭӧng protein quá thҩp sӁ làm giҧm ÿӝ bӑt và vӏ bia. 3.2. Làm sҥch và phân loҥi hҥt: Khӕi hҥt có chӭa nhiӅu tҥp chҩt (bөi, tҥp chҩt nhҽ nhѭ cӓ, rѫm rҥ; tҥp chҩt nһng nhѭ Vӓi ÿá, vөn kim loҥi ) do ÿó cҫn phҧi ÿѭӧc làm sҥch trѭӟc khi ÿѭa vào sҧn xuҩt. Mһt khác, khӕi hҥt phҧi ÿҧm bҧo ÿӗng ÿӅu ÿӇ quá trình ngâm và nҩy mҫm ÿѭӧc thuұn lӧi và ÿӗng ÿӅu. Thông thѭӡng ngѭӡi ta làm sҥch và phân loҥi bҵng các hӋ thӕng sàng thích hӧp: - Sàng khí ÿӝng: dùng ÿӇ tách tҥp chҩt và phân loҥi hҥt theo chiӅu dày, chiӅu rӝng cӫa nó theo các tính chҩt khi ÿӝng (dùng quҥt). 1Ӄu hҥt ÿѭӧc phân loҥi theo chiӅu dày hҥt ÿӇ sҧn xuҩt malt bia, ngѭӡi ta ÿѭӧc 3 nhóm: + Loҥi I : bӅ dày hҥt > 2,5 mm Dùng ÿӇ sҧn xuҩt malt bia tӕt nhҩt. + Loҥi II : bӅ dày hҥt > 2,2 ¸ 2, 5 mm Dùng ÿӇ sҧn xuҩt malt bia tӕt nhҩt. + Loҥi III : bӅ dày < 2,2 mm Dphӕi liӋu, ÿѭӧc dùng ÿӇ làm viӋc khác. - Sàng ӕng (Trier): ĈӇ phân loҥi hҥt theo chiӅu dài - Tách tҥp chҩt kim loҥi dùng nam châm kiӅn trӕng. Trang: 25
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch - Sѫÿӗ công nghӋ làm sҥch và phân loҥi hҥt 3.3. 5ӱa, sát trùng và ngâm hҥt: 3.3.1. 5ӱa và sát trùng hҥt: +ҥt ÿѭӧc rӱa sҥch trong quá trình ngâm, các chҩt bҭn theo nѭӟc và tҥp chҩt nhҽ sӁ nәi lên ÿӇÿѭӧc tháo ra ngoài. Trong quá trình bҧo quҧn hҥt sӁ bӏ nhiӉm vi sinh vұt, trùng bӑ, Kҥt chӃt và hѭ hӓng khác. Vì vұy, khi ngâm ngѭӡi ta thѭӡng kӃt hӧp vӟi rӱa, sát trùng ÿӇ khӕi hҥt ÿѭӧc sҥch, ÿӗng nhҩt, kích thích sӵ nҩy mҫm. 0ӝt sӕ các hoá chҩt dùng ÿӇ sát trùng hҥt khi ngâm: 3 - CaOCl2, Ca(OCl)2, HCHO 40 %: 700 gam/m H2O 3 - H2SO4, KmnO4: 10 ¸ 15 gam/m H2O - Ca(OH)2: 2 ÷ 3 lit/100 gam hҥt Trong ÿó, Ca(OCl)2 sát trùng mҥnh, kích thích sӵ nҩy mҫm nên hay ÿѭӧc dùng. LiӅu Oѭӧng 40 g Ca(OCl)2 33% / 100 kg hҥt. Ca(OH)2 bão hoà chӍ dùng rӱa sát trùng lҫn thӭ 2, không ÿѭӧc cho vào nӗi ӣ giai ÿRҥn ngâm vì nó hay bám lên vӓ hҥt làm ҧnh hѭӣng ÿӃn chҩt lѭӧng cӫa malt và bia. Có thӇ 3 dùng H2O2 ÿӇ sát trùng và kích thích nҩy mҫm: liӅu lѭӧng 3 lit/m H2O. ChӃ phҭm Giberelia kích thích thӵc vұt ÿѭӧc sӱ dөng lҫn ÿҫu tiên ӣ nhұt Bҧn vào năm 1940 vӟi liӅu Oѭӧng 40 ÷ 200 mg/1 tҩn ÿҥi mҥch, rút ngҳn thӡi gian nҩy mҫm tӯ 8 ngày xuӕng còn 5 ngày, giҧm giá thành Malt 12 ÷ 15 %. Ӣ Anh, 90 % chӃ phҭm Giberelia ÿѭӧc dùng trong công nghiӋp malt. 3.3.2. Ngâm hҥt: - Mөc ÿích ÿӇ hҥt hút ÿӫ nѭӟc cҫn thiӃt ÿӇ chuҭn bӏ nҩy mҫm, nҩy mҫm và phát triӇn Pҫm. - BiӃn ÿәi cӫa hҥt khi ngâm: + Trѭӟc khi ngâm, hҥt có ÿӝҭm trung bình 13 % ÿӫÿӇ duy trì khҧ năng sӕng. + Khi ngâm, nѭӟc ngҩm (thҭm thҩu qua vӓ) vào hҥt, khi ÿӝҭm cӫa hҥt quá 15 % thì trong hҥt xuҩt hiӋn nѭӟc tө do, hҥt trѭѫng nӣ dҫn (thӇ tích hҥt tăng trung bình khoҧng 1,45 lҫn so vӟi ban ÿҫu). Nѭӟc tӵ do thúc ÿҭy các quá trình hoá sinh có liên quan ÿӃn hoҥt ÿӝng sӕng, hô hҩp và hoҥt hoá enzim. + BiӃn ÿәi hoá hӑc khi ngâm không ÿáng kӇ, hҥt hô hҩp vүn rҩt yӃu nên tiêu tӕn gluxit rҩt ít, mӝt lѭӧng nhӓ các chҩt hoà tan vào nѭӟc ngâm: ÿѭӡng, pentosan, chҩt khoáng, tiêu hao chҩt khô khoҧng 1 %. + Hҥt hút nѭӟc thí năng lӵc hô hҩp tăng, khi ngâm hҥt tiêu thө 63 mg O2/kg hҥt.h và thҧi ra 86 mg CO2/kg hҥt. nӃu không ÿӫ lѭӧng oxi hҥt sӁ hô hҩp yӃm khí tҥo ra C2H5OH, CO2, các axit hӳu cѫ Ĉa sӕ là các chҩt ÿӝc vӟi tӃ bào, kiӅm hãm quá trình sӕng bình thѭӡng, dүn ÿӃn phá huӹ cҩu trúc tӃ bào và hiӋn tѭӧng tӵ phân huӹ (gây hѭ hӓng hҥt, thӕi Uӳa, nhiӉm vi sinh vұt). + Tӕc ÿӝ ngâm nѭӟc phө thuӝc vào nhiӋt ÿӝ ngâm nѭӟc, mӭc ÿӝ thay nѭӟc, thông khí, kích thѭӟc cӫa hҥt. NhiӋt ÿӝ cӫa nѭӟc ngày càng cao thì nѭӟc thҩm vào tӃ bào ngày càng nhanh. Vì khi ÿó nhiӋt ÿӝ sӁ làm tăng sӵ trѭѫng nӣ các chҩt keo (protein, tinh bӝt, xenluloza, ), tăng vұn tӕc khuӃch tán (do chuyӇn ÿӝng nhiӋt), giҧm ÿӝ nhӟt, tăng ÿӝ hô Trang: 26
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Kҩp cӫa hҥt ÿӗng thӡi tăng khҧ năng nhiӉm và phát triӇn cӫa vi sinh vұt tҥp, nhu cҫu oxi Fӫa khӕi hҥt cǊng tăng lên nhiӅu. 'ӵa vào nhiӋt ÿӝ cӫa nѭӟc ngâm, ngѭӡi ta chia ra các chӃÿӝ ngâm nhѭ sau: ChӃÿӝ ngâm NhiӋt ÿӝ nѭӟc ngâm Ngâm lҥnh < 10 oC Ngâm thѭӡng 10 ¸ 15 oC Ngâm ҩm 20 ¸ 40 oC Ngâm nóng 50 ¸ 55 oC Trong ÿó chӃÿӝ ngâm thѭӡng ÿѭӧc sӱ dөng rӝng rãi nhҩt, ngâm ҩm ÿѭӧc sӱ dөng trong mùa ÿông, ngâm nóng thѭӡng kӃt hӧp vӟi ngâm thѭӡng hay ngâm ҩm ÿӇ xӱ lý hҥt (kiӇu ngâm 3 sôi 2 lҥnh). *Quá trình hút nѭӟc cӫa hҥt ÿҥi mҥch khi ngâm diӉn ra theo ÿӗ thӏ: Ĉӝҭm hҥt (%) 50 40 30 20 10 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Thӡi gian ngâm(h) Ĉӗ thӏ biӇu diӉn sӵ thay ÿәi ÿӝҭm cӫa hҥt khi ngâm Khi ÿӝҭm khӕi hҥt ÿҥt khoҧng 40 % thì tӕc ÿӝ hút nѭӟc cӫa hҥt ÿã bҳt ÿҫu giҧm. Sau 96 h ngâm ÿӝҭm khӕi hҥt ÿҥt cao nhҩt khoҧng 47%. Ĉây cǊng chính là mӭc ÿӝ ngâm Fӵc ÿҥi cҫn thiӃt. +Các thành phҫn khoáng trong nѭӟc ngâm ҧnh hѭӣng ÿӃn tӕc ÿӝ ngâm hҥt. Nѭӟc PӅm ngâm nhanh hѫn nѭӟc cӭng, tӕt nhҩt sӱ dөng nѭӟc có ÿӝ cӭng 7mg ÿѭѫng + Oѭӧng/lit. Iôn Ca2 liên kӃt vӟi polyphenol trong vӓ hҥt tҥo muӕi ít tan có cҩu trúc thӇ keo Wҥo thành bong bóng trên vӓ ngăn cҧn sӵ thҩm nѭӟc, muӕi Na2CO3 làm tăng vӏ malt cho bia. Các muӕi sҳt gây kӃt tӫa dҥng Fe(OH)3, tác dөng vӟi polyphenol làm cho hҥt có màn nâu. NaCl làm chұm quá trình ngâm và nҩy mҫm, nӗng ÿӝ muӕi này quá cao có thӇ giӃt chӃt mҫm. - Các phѭѫng pháp và chӃÿӝ công nghӋ ngâm hҥt: có nhiӅu phѭѫng pháp ngâm hҥt: Trang: 27
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch + Ngâm trong nѭӟc-không khí gián ÿRҥn: Hҥt lúc ÿѭӧc ngâm trong nѭӟc, lúc ÿѭӧc ngâm trong không khí, mӛi chu kǤ kéo dài 3 ÷ 6 h. Không khí nén ÿѭӧc thәi cҩp cho cҧ chu kǤ, mӛi lҫn thәi tӯ 3 ÷ 5 phút, cӭ 30 phút lҥi thәi khí mӝt lҫn. + Ngâm trong luӗng nѭӟc và không khí liên tөc: Dùng nѭӟc ÿã bão hoà không khí ÿѭӧc phun liên tөc vào bӇ ngâm hҥt (cҫn có thiӃt bӏ bão hoà không khí). Vӟi phѭѫng pháp này mӭc ÿӝ ngâm hҥt ÿѭӧc nhanh, rút ngҳn ÿѭӧc quá trình nҩy mҫm. + Ngâm hҥt trong luӗng nѭӟc phun: Khӕi hҥt ÿѭӧc phun nѭӟc liên tөc chҧy thҩm qua Oӟp hҥt tӯ trên xuӕng dѭӟi rӗi chҧy vào rãnh thoát nѭӟc. Nhѭ vұy nѭӟc chӍ lѭu lҥi trong Kҥt mӝt thӡi gain nhҩt ÿӏnh nào ÿó. Phѭѫng pháp này cho phép hҥt ÿѭӧc thông khí tӵ nhiên liên tөc, mҫm hҥt mau xuҩt hiӋn và phát triӇn. +Ngâm hҥt trong luӗng không khí - nѭӟc phun: Ĉây là phѭѫng pháp kӃt hӧp giӳa ngâm trong nѭӟc liên tөc và giӳ hҥt ӣ tҥng thái hiӃu khí (ÿәi mӟi không khí) bҵng cách hút khí cӫa khӕi hҥt. Sau khi rӱa xong, hҥt ÿѭӧc phun tѭӟi nѭӟc trong 15 phút. Sau ÿó hút không khí tӯ phía dѭӟi (bҵng quҥt hay bѫm hút) trong 15 phút rӕi ÿӇ yên trong không khí mӝt giӡ, rӗi Oҥi phun tѭӟi nѭӟc cӭ nhѭ thӃ cho ÿӃn khi hҥt ÿҥt ÿӝҭm yêu cҫu. ĈӇ sҧn xuҩt matl bia, mӭc ÿӝ ngâm ÿҥi mҥch khoҧng 42 ÷ 48 %. ĈӇ sҧn xuҩt matl ÿѭӡng hoá khi sҧn xuҩt rѭӧu etylic thì thӡi gian ngâm thѭӡng ngăn: ÿҥi mҥch, lúa mҥch, \Ӄn mҥch: 12 ÷ 18 h; mҥch ÿen: 12 ÷14 h, ngâm nѭӟc 15÷ 200C cho ÿӃn mӭc ÿӝ ngâm 38÷40 %. Hҥt kê, lúa là giӕng ѭa ҩm nên ngâm trong nѭӟc 25÷300C trong 22÷24hÿӃn khi ÿҥt ÿѭӧc mӭc ÿӝ ngâm 35÷37%. Thѭӡng quá trình ngâm kӃt thúc thì thҩy rӉ con xuҩt hiӋn. 3.4. 1ҭy mҫm: Thӵc tӃ quá trình nҩy mҫm có thӇ bҳt ÿҫu ӣ giai ÿRҥn ngâm khi mӭc ÿӝ ngâm hҥt ÿҥt 25 ( 30 %. Lúc ÿó các hӋ enzim tӯ trҥng thái “nghӍ” ÿѭӧc ÿánh thӭc trӣ lҥi hoҥt ÿӝng ӣ ÿLӅu kiӋn nhiӋt ÿӝ, ÿӝҭm thích hӧp. KӃt quҧ là các polyme dӵ trӳ không tan (tinh bӝt, protein, hemixenluloza, xenluloza) bӏ thuӹ phân mӝt phҫn (biӃn hình) thành các chҩt tan có khҧ năng nuôi sӕng mҫm và rӉ. Trong giai ÿRҥn ÿҫu cӫa quá trình nҩy mҫm, trong hҥt xҧy ra các quá trình sinh lý, hoá sinh tѭѫng tӵ nhѭ khi hҥt nҩy mҫm tӵ nhiên (trong ÿҩt khi gieo hҥt), trong dung dӏch dinh Gѭӥng (thuӹ canh), dѭӟi tác dөng cӫa ÿӝҭm, nhiӋt ÿӝ, khí CO2 trong không khí, phôi hҥt phát triӇn sӁ tҥo nên mҫm và rӉ phôi, chҩt dinh dѭӥng nuôi phôi hҥt ÿѭӧc lҩy tӯ nӝi nhǊ Fӫa hҥt. Ӟi ÿó, dѭӟi tác dөng cӫa hӋ enzim sӁ chuyӇn hoá các chҩt ӣ vӏ trí cao phân tӱ vӅ Gҥng các chҩt hoà tan ÿѫn giҧn ÿӇ phôi hҩp thөÿѭӧc. Tuy nhiên, khi phôi hҥt càng phát triӇn thì tiêu hao chҩt khô trong hҥt (chӫ yӃu ӣ nӝi nhǊ) càng lӟn. Bҵng cách khӕng chӃ, tác ÿӝng các ÿLӅu kiӋn công nghӋÿӇ phôi hҥt (mҫm và rӉ) phát triӇn mӝt cách hӧp lý nhҩt ÿӇ tiêu hao hàm lѭӧng chҩt khô là nhӓ nhҩt nhѭng cho phép tích luӻÿѭӧc nhiӅu enzim nhҩt (trӯ hӋ enzim oxy hoá). Ĉây là mөc ÿích chӫ yӃu cӫa quá trình sҧn xuҩt matl, và FǊng là ÿLӇm khác biӋt giӳa nҩy mҫm nhân tҥo và nҩy mҫm tӵ nhiên. Khi nҩy mҫm, trong hҥt ÿҥi mҥch sӁ xҧy ra các quá trình chӫ yӃu sau: - Quá trình sinh lý: Sӵ phát triӇn cӫa phôi xҧy ra ÿӗng thӡi vӟi sӵ hô hҩp và tәng hӧp Pӝt sӕ chҩt mӟi, mà quan trӑng nhҩt là mӝt sӕ enzim cҫn thiӃt. Trang: 28
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch - Quá trình sinh hoá: Thuӹ phân các chҩt dӵ trӳ trong nӝi nhǊ. - Quá trình hoá hӑc: Tác dөng tѭѫng hӛ giӳa các chҩt tҥo thành khi thuӹ phân, hình thành các chҩt thѫm, chҩt có vӏ matl. - Quá trình vұt lý: Vұn chuyӇn ҭm và các chҩt dӵ trӳ hoà tan tӯ nӝi nhǊÿi nuôi phôi và ngѭӧc lҥi. 3.4.1. 6ӵ hình thành và hoҥt ÿӝng cӫa các hӋ enzim ÿӗng thӡi nhӳng quá trình [ҧy ra trong quá trình nҭy mҫm: +ҥt ÿҥt ÿӝ chín và khô (W13%) thì các enzim trong hҥt ӣ dҥng liên kӃt (không hoҥt ÿӝng) nҵm trong tӃ bào cӫa hҥt. Trong quá trình nҩy mҫm chúng ÿѭӧc giҧi phóng ra ӣ Gҥng tӵ do hoҥt ÿӝng, ÿӗng thӡi hҥt cúng có khҧ năng hình thành nên nhӳng enzim hoҥt ÿӝng mӟi. - HӋ enzim oxy hoá - khӱ: Hoҥt ÿӝng cӫa hӋ enzim này là bѭӟc chuҭn bӏ ban ÿҫu cho quá trình hoá sinh tiӃp theo Fӫa sӵ nҩy mҫm. Có thӇ kӇ ÿӃn các enzim oxy hoá hѫn: oxydaza, peroxydaza và catalaza sҧn phҭm phҧn ӭng xúc tác ӣ quá trình hô hҩp cӫa hҥt bao gӗm: H2O, CO2 và O2. Cѭӡng ÿӝ hô hҩp 0 phө thuӝc rҩt nhiӅu vào nhiӋt ÿӝ và lѭӧng O2 tham gia. Trong khoҧng nhiӋt ÿӝ 10÷30 C, nhiӋt ÿӝ tăng sӁ làm tăng cѭӡng ÿӝ hô hҩp, ÿӗng thӡi hoҥt tính cӫa ÿa sӕ các enzim cǊng Wăng dүn ÿӃn làm tăng sӵ tәn thҩt chҩt khô. Quá trình hô hҩp kèm theo sӵ thҧi nhiӋt: 673 kcal/phân tӱ gam ÿѭӡng. Trong hҥt ngâm có 2÷3 % ÿѭӡng (tính theo hàm lѭӧng chҩt khô), trong quá trình nҩy Pҫm do thuӹ phân nên lѭӧng ÿѭӡng tăng thêm khoҧng 20%. Khoҧng 9÷10% lѭӧng ÿѭӡng tәn hao do hô hҩp, 3÷5% tәn hao do sӵ phát triӇn cӫa mҫm và rӉ, còn lҥi ÿi vào thành phҫn cӫa malt. Nhѭ vұy, ta thҩy quá trình hô hҩp tiêu thө mӝt lѭӧng ÿѭӡng khá lӟn nên lѭӧng nhiӋt toҧ ra nhiӅu. 0ӝt sӕ axit hӳu cѫ có sҹn và hình thành trong quá trình nҩy mҫm nhѭ: oxalic, xitric, malic, lactic, formic, axetic, propionic, NӃu oxi không cung cҩp ÿҫy ÿӫ (trҥng thái yӃm khí) ÿһc biӋt ӣ giai ÿRҥn ÿҫu cӫa quá trình nҩy mҫm sӁ xҧy ra hiӋn tѭӧng hô hҩp yӃm khí Wҥo nên rѭӧu etylic C2H5OH và CO2. NӃu hàm lѭӧng C2H5OH sinh ra lӟn ÿӃn mӭc ÿӝ nhҩt ÿӏnh sӁӭc chӃ tӃ bào sӕng và ÿình chӍ sӵ phát triӇn cӫa mҫm. TiӃp ÿó, các sҧn phҭm Wѭѫng hӛ cӫa rѭӧu và axetic là este tҥo ra trong malt tѭѫi có mùi ÿһc trѭng. ĈӇÿһc trѭng cho mӭc ÿӝ hô hҩp ngѭӡi ta dùng hӋ sӕ hô hҩp k=CO2/O2. Chҷng hҥn sӵ oxi hoá ÿѭӡng trong ÿLӅu kiӋn hiӃu khí dѭӟi tác dөng cӫa enzim oxydaza: C6H12O6 + 6O2 à 6 + 6H2O + 2322kJ CO K= 2 = 1 O2 Khi oxi hoá chҩt béo : K = 0,5 ; protein K = 0,8 Khi hô hҩp yӃm khí K > 1 6ӵ khác nhau giӳa quá trình ngâm và nҧy nҫm là ӣ chӛ hӋ sӕ hô hҩp k khi ngâm thѭӡng > 1 , khi nҩy mҫm K = 0,74-1,00. Tӯÿó ngѭӡi ta khҷng ÿӏnh không phҧi sӵ hao Wәn chҩt khô và lѭӧng nhiӋt thҧi ra do hô hҩp trong quá trình nҭy mҫm là hoàn toàn tӯ gluxit (tinh bӝt và ÿѭӡng) Trang: 29
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch - Enzim Sitaza: ÿây là tұp hӧp enzim gӗm sitoplastaza và sitaza chúng hoҥt ÿӝng ÿҫu tiên ngay khi hҥt vӯa nҭy mҫm và ÿѭӧc gӑi là quá trình sitoliza. Nhӳng enzim này phân Fҳt hemixenluloza và polisacarit khác ӣ dҥng gel ÿӇ hình thành các sҧn phҭm có gӕc C5, C8, Sӵ phân cҳt hemixenluloza nhӡ enzim sitaza khi nҩy mҫm ÿóng vai trò rҩt quan trӑng trong sҧn xuҩt malt. Nhӡÿó màng ngăn cách giӳa nӝi nhǊ và vӓ trҩu bӏ phá vӥ tҥo ÿLӅu kiӋn cho các enzim amylaza và proteaza dӉ dàng hoҥt ÿӝng trong lòng nӝi nhǊ. -Enzim amylaza: Nhóm enzim này trong ÿҥi mҥch nҩy mҫm bao gӗm Į-amylaza, ȕ- amylaza và amylofattaza tұp trung chӫ yӃu trong nӝi nhǊ, chӍ có mӝt sӕ ít trong màng ngăn giӳa nӝi nhǊ và vӓ trҩu. +Hoҥt tính Į-amylaza tăng sau khi nҩy mҫm 3÷6 ngày và hoҥt tính này ÿҥt ÿѭӧc Fӵc ÿҥi phө thuӝc nhiӋt ÿӝ nҩy mҫm: 0 Ӣ: tnm= 12÷14 C ĺ Hÿmax= 11÷12 ngày 0 tnm= 18÷20 C ĺ Hÿmax= 6÷7 ngày 0 tnm= 25÷28 C ĺ Hÿmax= 4÷5 ngày +ȕ-amylaza có sҹn trong hҥt ÿҥi mҥch ӣ dҥng liên kӃt và tӵ do. Trong quá trình Qҩy mҫm hoҥt tính ȕ-amylaza tӵ do tăng lên 3÷4 lҫn. +Amylophotphataza tӵ do không có trong ÿҥi mҥch mà chӍÿѭӧc hình thành sau ngày nҩy mҫm thӭ 2, sau 8 ngày thì ÿҥt cӵc ÿҥi nên hoҥt tínhü tăng 150÷200 lҫn. 6ӵ tăng hoҥt tính chung cӫa amylaza sau khi nҩy mҫm - kí hiӋu là DC (hoҥt lӵc diastaza) ÿѭӧc xác ÿӏnh bҵng lѭӧng ÿѭӡng maltose tҥo thành, có thӇ biӇu diӉn theo ÿѫn Yӏ Vindich-Cotback ( 0Wd ) hay theo ÿѫn vӏ Lintner (0L ) vӟi quan hӋ: oWd +16 o L= 3,5 Tác dөng cӫa amylaza ÿӃn các quá trình hoá sinh nhѭ nҩy mҫm và ÿһc biӋt trong quá trình ÿѭӡng hoáï sau này có ý nghƭa ÿӃn sӭc quan trӑng trong quá trình sҧn xuҩt bia Uѭӧu, mҥch nha. 0өc ÿích cӫa quá trình nҩy mҫm chӫ yӃu ÿӇ tích tө thұt nhiӅu amylaza hoҥt ÿӝng ÿӇ khi ÿѭӡng hoá chúng có thӇ chuyӇn tinh bӝt (cӫa chính malt và cӫa các nguyên liӋu thay thӃ malt) thành các sҧn phҭm trung gian (dextrin) và các ÿѭӡng nhѭ maltotriaza, maltotetroza, maltodextrin, glucoza, maltoza. Ngoài ra khi nҩy mҫm còn tҥo thành mӝt Oѭӧng ÿáng kӇÿѭӡng saccaroza và mӝt ít ÿѭӡng fructoza (tәng hӧp trong phôi). Tҩt cҧ các loҥi ÿѭӡng làm cho malt có vӏ ngӑt, hàm lѭӧng cӫa chúng trong malt tăng lên 3÷4 lҫn so vӟi trong hҥt ban ÿҫu ( trong hҥt ban ÿҫu có 2,3÷2,5% ÿѭӡng, trong malt tѭѫi có 8,5÷9% ÿѭӡng ). Trong thӡi gian nҩy mҫm có khoҧng 10% tinh bӝt bӏ biӃn ÿәi, trong ÿó khoҧng 4,5÷5% tinh bӝt bӏ hao tәn do hô hҩp và tҥo rӉ, mҫm phôi, lѭӧng tinh bӝt còn lҥi bӏ biӃn hình (thuӹ phân có mӭc ÿӝ) nhѭӣ trên ÿã trình bày. KӃt quҧ làm cho tính chҩt tinh bӝt Fӫa malt khác vӟi tinh bӝt ban ÿҫu: kích thѭӟc hҥt tinh bӝt giҧm, ÿӝ rӛng (xӕp) giӳa các Kҥt tinh bӝt tăng lên, tӍ lӋ Am/Ap cǊng có thay ÿәi, -Enzin proteaza: Có hoҥt tính trong hҥt ban ÿҫu không ÿáng kӇ nhѭng khi nҩy mҫm ÿã Wăng lên 4÷8 lҫn, tăng nhanh hѫn hoҥt tính amylaza và ÿҥt cӵc ÿҥi vào khoҧng ngày nҩy Trang: 30
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Pҫm thӭ 5. Sӵ thuӹ phân protein bҳt ÿҫu bҵng tác dөng cӫa proteinaza ÿӇ tҥo thành albumoza, polypeptit, pepton và sau ÿó dѭӟi tác dөng cӫa peptidaza tҥo thành các axit amin. Tuy nhiên sӵ biӃn ÿәi này thѭӡng không hoàn toàn (ÿӃn các sҧn phҭm cuӕi cùng là các axit amin) vì các ÿLӅu kiӋn nҩy mҫm (các thông sӕ nҩy mҫm) thѭӡng không phҧi là ÿLӅu kiӋn tӕi thích cho hoҥt ÿӝng cӫa hӋ enzim proteaza cӫa hҥt. 0 Chҷng hҥn: topt peptidaza < 50 C pHopt peptidaza = 7,6÷8 o topt proteinaza = 60 C pHopt peptidaza = 4,5 ¸ 5 0 tQҭy mҫm 60 C pH Kҥt= 6,8÷7 Tuy nhiên, vì nhiӋt ÿӝ nҩy mҫm tѭѫng ÿӕi thҩp và thӡi gian nҩy mҫm kéo dài sӁ có sӵ thuӹ phân protein tѭѫng ÿӕi sâu sҳc ÿӇ tҥo thành mӝt lѭӧng ÿáng kӇ các polypeptit và axit amin. Tác ÿӝng này chӍ diӉn ra vӟi nӝi nhǊ, trong khi protein ӣ lӟp ngăn cách nӝi nhǊ vӟi vӓ và cҧ phҫn vӓ malt thì không bӏ biӃn ÿәi cҧ trong các quá trình chӃ biӃn vӅ sau (sҩy malt tѭѫi, bҧo quҧn malt, nҩu và ÿѭӡng hoá khi sҧn xuҩt bia, mҥch nha). Chúng sӁ Wӗn tҥi trong bã malt khi lҳng, lӑc dӏch ÿѭӡng. 6ӵ thuӹ phân protein bӣi enzim proteaza làm tăng lѭӧng nitѫ hoà tan (albumiza, pepton, polypeptit, axit amin), mӝt phҫn các chҩt này dӉ bӏ kӃt tӫa khiÿun sôi dӏch ÿѭӡng (vӟi hoa hublon - tӭc quá trình hublon hoá trong sҧn xuҩt bia). Phҫn khác vүn tӗn tҥi ӣ Gҥng hoà tan, phҫn này ÿһc biӋt có giá trӏ trong sҧn xuҩt bia (là nguӗn nitѫ hӳu cѫ cho Qҩm nem, tҥo bӑt, kӃt tӫa ÿӇ tӵ làm trong, tҥo vӏ bia ) vӟi tӍ lӋ thích hӧp, nӃu quá cao thì bia dӉ bӏÿөc và ÿөc trӣ lҥi khi tӗn trӳ bia. 6ӵ biӃn ÿәi các sҧn phҭm thuӹ phân proteaza khi nҩy mҫm ÿҥi mҥch ÿѭӧc thӇ hiӋn trong bҧng 4 (trang 139-1) Qua bҧng này, ta thҩy trong khoҧng nӳa thӡi gian cӫa quá trình nҩy mҫm (tӯ ngày 1 ( 4), sҧn phҭm thuӹ phân protein tăng liên tөc, ÿӃn nӳa thӡi gian sau thì dӯng lҥi hoһc giҧm Gҫn. Có thӇ giҧi thích ÿLӅu này là do hoҥt tính cӫa enzim proteaza giҧm dҫn và sӁәn ÿӏnh, và mӝt phҫn sҧn phҭm thuӹ phân ÿѭӧc dùng vào viӋc tҥo mҫm và rӉ phôi (chiӃm 11÷12% Oѭӧng protein cӫa hҥt). ChӍ sӕ quan trӑng ÿһc trѭng cho quá trình thuӹ phân protein khi nҩy mҫm nói riêng và Pӭc ÿӝ thuӹ phân cӫa malt nói chung là lѭӧng nitѫ formol (lѭӧng sҧn phҭm nitѫ bұc thҩp ÿѭӧc tҥo thành có chӭa nhóm axit cacboxylic _COOH tӵ do nhѭ axit amin, peptic ). Hoҥt tính enzim proteaza ÿѭӧc xác ÿӏnh theo chӍ sӕ này (phѭѫng pháp chuҭn ÿӝ formol) Eҵng hiӋu sӕ cӫa lѭӧng nitѫ formol tәng cӝng (chung) khi ÿѭӡng hoá (tҥi thӡi ÿLӇm cҫn xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ enzim) và lѭӧng nitѫ formol ban ÿҫu. - Enzim esteraza: Xúc tác cho quá trình este hoá, trong ÿҥi mҥch chӫ yӃu là nhóm enzim photphotaza bao gӗm: fitaza, saccarofotfataza, glicero fotfataza, nucleotidaza và amylofotfataza. +BiӃn ÿәi quan trӑng ÿһc trѭng là sӵ thuӹ phân phitin dѭӟi tác dөng cӫa enzim fitaza ÿӇ giҧi phóng rѭӧu inozit, muӕi fotfat và axit fotforic tӵ do. +Saccaro fotfataza, glicero fotfataza, nucleotidaza thuӹ phân mӕi liên kӃt este cӫa các chҩt hӳu cѫ chӭa fotfat tѭѫng ӭng và giҧi phóng ra axit fotforic tӵ do. Trang: 31
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch +Amylofotfataza cҳt gӕc axit fotforic cӫa phân tӱ amylopectin. Do kӃt quҧ cӫa quá trình tích tө và biӃn ÿәi enzim mà lѭӧng các chҩt hoà tan (chҩt chiӃt) tăng ÿáng kӇ: ban ÿҫu chӍ có 6,5÷8%, khi nҩy mҫm tăng lên 26% (tính theo chҩt khô) nhѭng do tәn hao hô hҩp và tҥo mҫm nên còn lҥi trong malt là 14÷15%. &ѭӡng ÿӝ hô hҩp và các quá trình biӃn ÿәi hoá sinh khi ѭѫm mҫm phө thuӝc vào mӭc ÿӝ thông khí, tӭc là phө thuӝc vào tӍ lӋ O2 /CO2 trong khӕi hҥt ÿang ѭѫm mҫm. Trong khoҧng nӱa ÿҫu thӡi kì ѭѫm, xҧy ra sӵ tích luӻ enzim lӟn nhҩt thì sӵ thông khí là cҫn thiӃt (ngày 1÷4). Sau ÿó nên dӯng thông khí ÿӇ giӳ lѭӧng CO2 lҥi (nӗng ÿӝ không quá 20% trong hӛn hӧp khí) ÿӇ hҥn chӃ tӕi ÿa sӵ hô hҩp cӫa phôi (nhҵm hҥn chӃ sӵ hao hөt Wӕi ÿa do hô hҩp). Không khí thәi cho khӕi hҥt cҫn có ÿӝҭm W=98 ÷100% và nhiӋt ÿӝ phҧi bé hѫn nhiӋt ÿӝѭѫm 2÷30C. 3.4.2. Ĉһc ÿLӇm ѭѫm mҫm cӫa các loҥi hҥt khác nhau: Nhѭ trên ÿã nói, vӟi mөc ÿích sӱ dөng malt khác nhau mà ngѭӡi ta dùng các loҥi hҥt khác nhau ÿӇ sҧn xuҩt vӟi chӃÿӝ công nghӋ phù hӧp. - Trong sҧn xuҩt malt dùng làm tác nhân ÿѭӡng hoá trong công nghӋ rѭӧu etylic thì chҩt lѭӧng malt ÿѭӧc ÿáng giá bҵng hoҥt tính tәng quát cӫa hӋ enzim amylaza. NӃu ѭѫm 0 Pҫm ӣ nhiӋt ÿӝ 14÷16 C trong ttg trong thӡi gian dài thì sӁ tích luӻÿѭӧc rҩt nhiӅu các enzim Įȕ_amylaza, dextrinaza. Chҷng hҥn: Ĉҥi mҥch 10 ngày, yӃn mҥch 10÷12 ngày, Pҥch ÿen 7÷8 ngày, kê 5÷6 ngày. -Trong sҧn xuҩt bia, ÿӇ sҧn xuҩt malt sáng màu (malt vàng) ngѭӡi ta ѭѫm mҫm ӣ nhiӋt ÿӝ không quá 180C. ĈӇ sҧn xuҩt malt ÿen (malt caramen) ngѭӡi ta ѭѫm mҫm ӣ nhiӋt ÿӝ cao hѫn nhѭng không vѭӧt quá 250C, thӡi gian ѭѫm dài hѫn ÿӇ quá trình thuӹ phân tinh Eӝt và protein ÿѭӧc sâu hѫn. - Trong sҧn xuҩt mҥch nha, malt cǊng là tác nhân ÿѭӡng hoá (chính thӭc hoһc bә sung - ÿѭӡng hoá sѫ bӝ), nӃu yêu cҫu thӡi gian ѭѫm mҫm dài hѫn, ӣ nhiӋt ÿӝ cao hѫn lúa :12 ngày, kê: 7 ngày, ngô: 8 ngày, to=28÷320C. 3.4.3. Các phѭѫng pháp nҩy mҫm: - Nҭy mҫm không thông gió: Ĉây là phѭѫng pháp cәÿLӇn hiӋn vүn còn sӱ dөng nhiӅu trong các cѫ sӣ sҧn xuҩt malt bia cǊng nhѭ malt mҥch nha, năng suҩt tӯ loҥi rҩt nhӓ ÿӃn rҩt lӟn (vài trăm tҩn hҥt / ngày). Sàn ѭѫm mҫm bҵng xi măng phҷng, nhҹn, hѫi nghiêng ÿӇ dӉ thoát nѭӟc. Trong phòng ѭѫm cҫn ÿһt quҥt ÿҭy, quҥt hút ÿӇ lѭu thông không khí và hӋ thӕng ÿLӅu hoà nhiӋt ÿӝ nhân tҥo (nӃu sàn ѭѫm chìm mӝt nӳa sӁÿѭӧc lӧi vӅ nhiӋt ÿӝÿLӅu hoà nhѭng khó thoát Qѭӟc và vұn hành). +ҥt sau khi ngâm ÿѭӧc ÿә thành ÿӕng trên sàn rӗi san ÿӅu thành lӟp dày ban ÿҫu khoҧng 40 cm, sau ÿó giҧm dҫn cho ÿӃn 10÷12 cm ӣ giai ÿRҥn cuӕi. Thѭӡng xuyên ÿҧo trӝn lӟp malt, thông gió ÿӇÿXәi CO2 và cung cҩp không khí mӟi. Có thӇ chia làm 3 thӡi kì nҩy mҫm nhѭ sau: + Thӡi kì 1: (2 ngày ÿҫu) tăng dҫn nhiӋt ÿӝÿӃn 13÷140C, ÿҧo trӝn 2÷3 lҫn / ngày. + Thӡi kì 2: (3 ngày tiӃp theo):nhiӋt ÿӝ khӕi hҥt tăng nhanh do hô hҩp mҥnh. NhiӋt ÿӝ cao nhҩt cho phép ÿӕi vӟi malt vàng 16÷17 0C, malt ÿen 19÷200C, ÿҧo trӝn 3÷4 lҫn / ngày. Trang: 32
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch + Thӡi kì 3: (2 ngày cuӕi) cѭӡng ÿӝ hô hҩp và nҩy mҫm giҧm, ÿҧo trӝn 2÷3 lҫn / ngày. RӉ mҫm băng 1/5 lҫn chiӅu dài hҥt, mҫm dài 3/4 lҫn chiӅu dài hҥt. - Nҩy mҫm thông gió trong ngăn: Phòng nҩy mҫm gӗm các ngăn hӣ hình chӳ nhұt: dài 10÷15 m, rӝng 3÷4 m, cao 1,8÷2 m, ÿáy hѫi nghiêng ÿӇ dӉ thoát nѭӟc, cách ÿáy 60 cm ÿһt mӝt lѭӟi sàn có lӛ vӟi diӋn tích Oӛ 15÷20 % diӋn tích sàn, mӛi ngăn có thӇ chӭa ÿѭӧc 10÷12 tҩn hҥt khô. +ҥt ngâm xong ÿә vào các ngăn rӗi san ÿӅu theo chiӅu dày cӫa lӟp malt trong ngày Qҩy mҫm, lѭӧng nѭӟc ngâm thӯa trong hҥt theo lӛ lѭӟi sàn xuӕng ÿáy rӗi ra ngoài. Malt ÿѭӧc ÿҧo trӝn nhӡ máy ÿҧo trөc vít xoҳn thҷng ÿӭng. Thәi không khí khô vào lӟp hҥt (qua sàn ÿáy) sau 18÷20h thì thәi không khí lҥnh và ҭm rӗi ÿҧo trӝn. ChӃÿӝ làm viӋc cӫa ngăn nҩy mҫm xem ӣ bҧng sau. (bҧng 5-trang 115). Sau khi nҩy mҫm xong, malt tѭѫi ÿѭӧc vұn chuyӇn ÿӃn lò sҩy (nӃu ÿӇ sҧn xuҩt bia hay Pҥch nha), hoһc máy nghiӅn sӳa malt (làm tác nhân ÿѭӡng hoá trong sҧn xuҩt rѭӧu, tinh Eӝt). - Nҩy mҫm thông gió trong thùng quay: ThiӃt bӏ là thùng hình trө bҵng thép, ÿһt nҵm ngang trên hai giá ÿӥ và quay ÿѭӧc trên hai giá này nhӡ ÿӝng cѫ quay thùng vӟi hӋ thӕng truyӅn ÿӝng bánh răng. Có hai loҥi thùng quay: kín và hӣ. Trong ÿó, thông dөng hѫn là loҥi thùng quay kín, chiӅu dài thùng 4÷6 m, ÿѭӡng kính 2,3÷3 m ÿҧm bҧo ÿӇ nҩy mҫm ÿѭӧc 10÷12 tҩn hҥt khô. (xem hình 47 trang 156). +ҥt ngâm xong ÿѭӧc ÿѭa vào qua các cӱa phía trên thùng rӗi phân bӕÿӅu trên lѭӟi thép. Không khí lҥnh và ҭm thәi vào thùng qua các lӟp malt ÿang quay theo thùng rӗi theo các ӕng góp ra ngoài thùng (nhӡ quҥt ÿҭy - hút). Thӡi gian nҩy mҫm 7 ( 10 ngày, tӕc ÿӝ quay thùng 2,5÷3 h/vòng. Sau khi nҩy mҫm xong cho thùng quay vào vӏ trí ngѭӧc vӟi lúc nҥp hҥt rӗi mӣ cӱa chҳn ÿӇ tháo hҥt ra qua chính cӱa nҥp ban ÿҫu. - Nҩy mҫm theo phѭѫng pháp bán liên tөc và liên tөc: (xem tài liӋu tham khҧo) - Ĉánh giá chҩt lѭӧng malt tѭѫi: Chҩt lѭӧng malt tѭѫi ÿѭӧc ÿánh giá qua phѭѫng pháp phân tích cҧm quan, hoҥt ÿӝ enzim và thành phҫn hoá hӑc và thѭӡng ÿѭӧc gҳn liӅn vӟi mөc ÿích sӱ dөng malt (sҧn xuҩt rѭӧu, bia hay mҥch nha). Malt tѭѫi tӕt có mùi dѭa chuӝt, nӃu malt có mùi chú, vӏ thiu có thӇ do malt bҭn, bӏ nhiӉm VSV, khi nҩy mҫm không ÿúng chӃÿӝ công nghӋ. Hҥt malt phҧi mӅm, nӃu hҥt còn cӭng hay nhào nát thì coi nhѭ phҭm chҩt xҩu. <Ӄu tӕ quan trӑng ÿӇÿáng giá chҩt lѭӧng malt là tӍ lӋ nҩy mҫm và chiӅu dài, ÿӝ lӟn Fӫa mҫm, rӉ. Malt tӕt có tӍ lӋ nҩy mҫm trên 85%, ÿӕi vӟi malt vàng chiӅu dài mҫm 2/3÷3/4 chiӅu dài hҥt, malt ÿen có chiӅu dài mҫm 1/2÷1 chiӅu dài hҥt, rӉ dài 1,2÷2 cm. ChӍ tiêu quan trong cӫa malt là hoҥt tính enzim. Sau ÿây là bҧng chӍ tiêu hoҥt tính enzim ÿӕi vӟi malt dùng cho sҧn xuҩt rѭӧu. 7ӕt Khá Trung bình Loҥi malt AC DC AC DC AC DC (g/g.h) (mg/g.h) (g/g.)h (mg/g.h) (g/g.h) (mg/g.h) Trang: 33
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Ĉҥi mҥch >6 >35 4-6 25-35 3-4 15-25 5 >45 3-5 35-45 2-3 25-35 Malt ÿen và lúa mǤ >7 >35 4-7 25-35 3-4 15-25 Kê >3 >100 2-3 70-100 1-2 50-70 Ghi chú: AC - hoҥt tính amylaza: khҧ năng thuӹ phân tinh bӝt thành mantoza và các dextrin không làm ÿәi màu dung dӏch iӕt, ÿѫn vӏ =g tinh bӝt / g malt trong 1 h ӣ nhiӋt ÿӝ 30 oC. DC - Nhӡ khҧ năng thuӹ phân các dextrin thành maltoza, ÿѫn vӏ = g dextrin / g malt ӣ nhiӋt ÿӝ 300C. Chҩt lѭӧng malt dùng ÿӇ sҧn xuҩt bia trѭӟc hӃt là hoҥt tính amylaza (AC) ÿѭӧc biӇu thӏ bҵng lѭӧng maltoza tҥo thànhtӯ tinh bӝt dѭӟi tác dөng cӫa enzim có trong 100 g malt vàng tѭѫi tӕt có AC bҵng 300 - 400, malt ÿen tѭѫi tӕt có AC = 400 - 500. 3.5. 6ҩy malt: Malt tѭѫi có ÿӝҭm cao (42 - 45%) nên không thӇ bҧo quҧn ÿѭӧc (trӯ malt tѭѫi dùng) trong sҧn xuҩt rѭӧu sӁÿѭӧc ÿem ÿi nghiӅn thành sӳa malt - là chӃ phҭm enzim ÿѭӡng hoá. Mһt khác, mùi vӏ và thành phҫn hoá hӑc, cҩu trúc cӫa malt tѭѫi không thích hӧp cho viӋc sҧn xuҩt bia (trong mҥch nha) nhѭ: hҫu nhѭ không có chҩt màu, chҩt thѫm (thұm chí có chҩt thѫm phҧn tác dөng vӟi bia), thành phҫn protein có thӇ làm giҧm ÿӝ bӅn hoá lý cӫa bia (bia dӉ bӏÿөc, bӑt không bӅn), không có tính chҩt nghiӅn vӥ thành bӝt Vҧ lҥi malt vӕn là nông sҧn chӃ biӃn có thӏ trѭӡng toàn cҫu (thѭѫng mҥi thӃ giӟi) nên nhҩt thiӃt phҧi sҩy malt. Khi sҩy phҧi chú ý ÿӃn giӳ lҥi ÿѭӧc ÿӫ lѭӧng enzim (ÿã tích luӻÿѭӧc trong quá trình Qҩy mҫm) cho sҧn xuҩt bia (hay mҥch nha). Muӕn vұy khi xây dӵng ÿӗ thӏ sҩy malt phҧi hiӇu rõ quan hӋ giӳa nhiӋt ÿӝ sҩy và ÿӝҭm cӫa malt (có tính ÿӃn ÿӝ bӅn cӫa enzim do nhiӋt ÿӝ và ÿӝҭm. Ĉӝҭm malt khi sҩy càng cao thì enzim vô hoҥt càng nhanh). Ví dө: Khi sҩy malt vàng: ӣ giai ÿRҥn hҥt có ÿӝҭm 30% thì nhiӋt ÿӝ sҩy cho phép là 400C. khi sҩy ӣ nhiӋt ÿӝ 500C thì ÿӝҭm malt phҧi giҧm còn12%. NӃu nhiӋt ÿӝ sҩy tăng ÿӃn 600C thì ÿӝҭm malt còn 8%. Malt ÿen có thӇ sҩy ӣ nhiӋt ÿӝ cao hѫn malt vàng, tuy nhiên nhiӋt ÿӝ sҩy không ÿѭӧc quá 1040C ÿӇ không phá huӹ nhiӅu enzim . Khi malt có ÿӝҭm cao, nӃu tăng nhiӋt ÿӝ sҩy cao sӁ tҥo nên malt dҥng keo khô vì ӣ khoҧng nhiӋt ÿӝ 60 oC xҧy ra hiӋn tѭӧng hӗ hoá tinh bӝt, nӃu tiӃp tөc nâng nhiӋt thì tinh Eӝt chuyӇn sang trҥng thái thoái hoá - tҥo thành hҥt cӭng. Trong khi ÿó, mӝt sӕ protein bӏ tác dөng bӣi enzim proteaza sӁ hoà tan và thҩm vào hҥt tinh bӝt và chuyӇn sang dҥng keeo khi bӏ mҩt nѭӟc. Malt dҥng keo khô do tinh bӝt và protein bӏ biíen hình nên giҧm ÿӝ hoà tan, giҧm ÿӝ chiӃt. 3.5.1. Nhӳng biӃn ÿәi cӫa malt trong quá trình sҩy: Theo ÿӝ tăng dҫn cӫa nhiӋt ÿӝ khi sҩy mà ta có thӇ chia ra làm 3 thӡi kì nhѭ sau: - Thӡi kì sinh lí: nhiӋt ÿӝ sҩy tăng dҫn và ÿҥt ÿӃn 450C: malt và rӃ vүn tiӃp tөc phát triӇn, ÿӝҭm còn khoҧng 30%, sӵ biӃn ÿәi do thuӹ phân, do enzim vүn tiӃp tөc. -Thӡi kì men (enzim ): NhiӋt ÿӝ sҩy tăng dҫn tӯ 45 - 700C: Các quá trình sӕng bӏ ngӯng lҥi: không hô hҩp, mҫm rӉ không còn phát triӇn nhѭng sӵ thuӹ phân và nhӳng Trang: 34
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch biӃn ÿәi khác trong nӝi nhǊ vүn xҧy ra rҩt mҥnh vì nhiӋt ÿӝ tӕi thích cӫa ÿa sӕ men nҵm trong khoҧng 45 - 600C. Ӣ thӡi kì này, ÿӝҭm cӫa malt ÿen tӯ 20 - 300C, cӫa malt vàng còn 10 %. -Thӡi kì hoá hӑc: NhiӋt ÿӝ sҩy tăng tӯ 70 -1050C: Ӣ nhiӋt ÿӝ > 750C thì các hoҥt ÿӝng Fӫa enzim bӏ ngӯng trӋ vì mӝt sӕ enzim bӏ vô hoҥt mӝt phҫn (do nhiӋt ÿӝ cao), sӕ cào lҥi Eӏ các chҩt keo cӫa hҥt hҩp thө và chuyӇn sang trҥng thái không hoҥt ÿӝng. Ví dө: Ӣ nhiӋt ÿӝ > 400C, enzim peptidaza ngӯng hoҥt ÿӝng, ӣ nhiӋt ÿӝ 600C các enzim sitaza và phytaza mҩt hoҥt tính và enzim amylaza giҧm hҷn hoҥt tính. Riêng ÿӕi vӟi enzim proteinaza do khҧ năng chӏu nhiӋt rҩt lӟn nên hoҥt tính giҧm rҩt ít khi sҩy malt vàng. Thӡi kì hoá hӑc ÿѭӧc ÿһc trѭng bҵng sӵ tҥo thành các chҩt thѫm, sӵ biӃn hình protein, Vӵ làm yӃu hay vô hoҥt tӯng phҫn các enzim. Quá trình quan trӑng nhҩt xҧy ra trong quá trình sҩy là phҧn ӭng melanoidin do tác Gөng tѭѫng hӛ giӳa nhӳng chҩt chӭa nhóm cacbonyl (-COO) vӟi nhӳng chҩt có nhóm amin (-NH2). KӃt quҧ malt sҩy trӣ nên có màu tӕi (sүm) hѫn, có mùi vӏÿһc trѭng cӫa malt bia (hay malt mҥch nha). Theo Hydge, quá trình tҥo melanoit trong khi sҩy malt có thӇ tiӃn triӇn theo 3 giai ÿRҥn: + Giai ÿRҥn ÿҫu: cô ÿһc (nâng cao nӗng ÿӝ) các chҩt ÿѭӡng và axit amin do mҩt Qѭӟc khi sҩy ÿӇ tҥo thành các tinh thӇ không màu. + Giai ÿRҥn giӳa: xҧy ra sӵ khӱ hydro, bҿ gҧy phân tӱÿѭӡng, phân tӱ axit amin ÿӇ Wҥo thành các chҩt không màu hoһc có màu vàng nhҥt, có tính khӱ mҥnh, tiêu biӇu là mӝt Vӕ chҩt nhѭ:CH(OH)C(OH)CHO, hydroquinon (khi bӏ khӱ hydro chúng trӣ vӅ dҥng quinon ban ÿҫu). Nhӳng chҩt khӱ này cùng vӟi nhӳng chҩt khӱ ÿѭӧc tҥo thành trong các quá trình nҩu bia (ÿѭӡng hoá, ÿun sôi dӏch ÿѭӡng vӟi hoa hublon) ÿóng vai trò rҩt quan trӑng trong quá trình oxy hoá - khӱ cӫa công nghӋ bia. Chúng trӵc tiӃp Wҥo nên mùi vӏ, ÿӝ bӑt cho bia, là các chҩt bҧo vӋ chӕng lҥi sӵ oxy hoá, chӕng lҥi sӵ kӃt Wӫa keo làm cho bia ÿөc + Giai ÿRҥn cuӕi: tҥo thành nhӳng chҩt có màu sүm. 7ӕc ÿӝ phҧn ӭng melanoit phө thuӝc vào nhiӋt ÿӝ, pH, thӡi gian, thành phҫn các chҩt tham gia. Trong sӕ các axit amin tham gia mҥnh nhҩt là glixin và alanin, sҧn phҭm melanoit cӫa chúng cho màu rҩt ÿұm và có mùi bia, cho mùi thѫm mҥnh hѫn cҧ là valin và loxin, phenylalanin và valin cho sҧn phҭm có màu tӕi, mùi hoa hӗng nhҽ, lѫxin cho Vҧn phҭm nhҥt màu và có mùi bánh mǤ rõ. Trong sӕ các ÿѭӡng tham gia phҧn ӭng melanoit theo thӭ tӵ là: arabinoza > glucoza > galactoza > fructoza, trong ÿó các pentoza Pҥnh nhҩt là ÿѭӡng cexitoza. Thành phҫn nguyên tӕ cҧu melanoit nhѭ sau: C= 54 - 60%, O= 31,3 - 35,1%, H=4,9 - 5,2, N= 3,5 - 5,3% Chúng có chӭa các nhóm -CO, -COOH, -OH, M § 1480. Ttrong ngành bia, melanoit có ý nghƭa rҩt quan trӑng: gây màu và mùi thѫm ÿһc biӋt, do có khҧ năng hoҥt ÿӝng bӅ Pһt rҩt mҥnh nên là nhӳng chҩt tҥo bӑt tӕt, ÿóng vai trò bҧo vӋ các keo ÿӇ ngăn cҧn sӵ NӃt tӫa keo không bӅn vӳng, có khҧ năng khӱ mҥnh làm tăng ÿӝ bӅn, chӕng hiӋn tѭӧng ÿөc bia do bӏ oxy hoá. 3.5.2. Các phѭѫng pháp và chӃÿӝ công nghӋ sҩy malt: - Lò sҩy nҵm ngang hai tҫng hoҥt ÿӝng tuҫn hoàn: Trang: 35
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Ĉây là loҥi lò sҩy cәÿLӇn vӟi phѭѫng pháp sҩy ÿӕi lѭu cѭӥng bӭc, hiӋn nay vүn ÿѭӧc Vӱ dөng rҩt phә biӃn ӣ nhӳng nѭӟc có sҧn xuҩt malt. Ĉây là mӝt toà nhà cao 20 - 25 m hình vuông hay chӳ nhұt có 5 tҫng vӟi các chӭc năng: tҫng 1 ÿһt lò ÿӕt, tҫng 2 là buӗng nhiӋt có ÿһt clorifer, tҫng 3 la buӗng trӝn không khí ÿҿ sҩy, tҫng 4 là mӝt sàng lѭӟi và Wҫng 5 là mӝt mһt sàng sҩy trên cùng có ӕng hút và quҥt hút ÿӇ thҧi ҭm ra ngoài. Sàng sҩy làm bҵng lѭӟi thép ÿan dày vӟi diӋn tích lӛ chiӃm 30 - 35% diӋn tích sàng. + TiӃn hành sҩy malt vàng: Malt tѭѫi nhӡ gàu tҧi chuyӇn lên sàng sҩy trên vӟi chiӅu dày lӟp malt 14 - 22 cm. tăng nhiӋt ÿӝ sҩy ÿӅu ÿһn sau 6 giӡÿҥt 30 - 350C, ÿӝҭm còn 2%. Sau 6 h tiӃp tөc ÿҥt 500C, ÿӝ ҭm xuӕng còn 8 - 10 %. Nhѭ vұy phҫn lӟn ҭm cӫa malt ÿѭӧc tách ra tҥi ÿây. ĈLӅu kiӋn quan trӑng ÿӇ thu ÿѭӧc malt vàng chҩt lѭӧng tӕt là nhiӋt ÿӝ sҩy không ÿѭӧc quá 400C khi ÿӝҭm chѭa hҥ xuӕng dѭӟi 12 - 14%. Sau 12h sҩy ӣ sàng trên, malt ÿѭӧc chuyӇn xuӕng tiӃp tөc sҩy kiӋt ӣ sàng dѭӟi. Sau 11 - 12h, nhiӋt ÿӝ sҩy tѭng lên 55 - 800C, ÿӝҭm còn 2,5 - 3,3%. Sau khi sҩy xong, malt ÿѭӧc Gӗn ÿӕng lҥi ÿӇ chuyӇn sang khâu gia công tiӃp tөc. ChӃÿӝ sҩy malt vàng (xem ӣ bҧgn 6 - trang 170 cӫa giáo trình). + TiӃn hành sҩy malt ÿen: Malt ÿen sҩy lâu hѫn và phӭc tҥp hѫn malt vàng. Ĉҫu tiên malt tѭѫi cǊng ÿѭӧc ÿә vào và trҧi ÿӅu lên sàng sҩy trên vӟi lӟp malt dày 22 -30 cm. Giai ÿRҥn ÿҫu dài 14h tăng nhanh nhiӋt ÿӝÿӃn 40 0C, ÿӝҭm xuӕng 20%. Trong 3- 5h tiӃp theo tăng ÿӃn nhiӋt ÿӝ 60 - 650C, tăng cѭӡng ÿҧo trӝn. Sau 24h thì sҩy xong ӣ sàng trên, malt sӁ ÿѭӧc chuyӇn xuӕng sҩy ӣ sàng dѭӟi. TiӃp tөc thӡi kì sҩy thӭ nhҩt trong 9 - 10h ӣ nhiӋt ÿӝ 50 -550C, ÿӝ ҭm xuӕng còn 8 - 10%.Thӡi kì thӭ hai nhiӋt ÿӝ tăng lên: trong 4 - 6h nhiӋt ÿӝ tiӃp tөc ÿҥt 750C, ÿӝҭm xuӕng còn 5%, trong 3 - 4h. Sau nhiӋt ÿӝ tăng dҫn lên 100 -1050C cho ÿӃn khi sҩy xong vӟi hàm ҭm cuӕi cùng ÿҥt 1,5 - 2%. Vì malt ÿen sҧn xuҩt lâu hѫn, hao tӕn chҩt khô nhiӅu hѫn nên giá thành malt ÿen và bia ÿen ÿҳt hѫn malt vàng và bia vàng. ĈӇ phҫn nào hҥ giá thành, ngѭӡi ta sҧn xuҩt mӝt Vӕ loҥi malt ÿһc biӋt nhѭ malt cafê, malt mecan ÿӇ thay thӃ mӝt phҫn hay toàn bӝ malt ÿen khi sҧn xuҩt bia ÿen. ChӃÿӝ sҩy malt ÿen (xem bҧng 7 - trang 171 cӫa giáo trình). - Lò sҩy nҵm ngang mӝt tҫng: Ĉây là loҥi lò sҩy tѭѫng ÿӕi mӟi theo phѭѫng pháp sҩy ÿӕi lѭu cѭӥng bӭc. Tӭc là tác nhân sҩy là không khí nóng ÿѭӧc thәi cѭӥng bӭc qua lӟp malt có ÿӝ dày 8 - 10cm mà không ÿҧo trӝn. TiӃn hành sҩy theo phѭѫng pháp ngѭӧc chiӅu tƭnh ÿӇ tiӃt kiӋm nhiӋt và ÿҥt ÿӝҭm cuӕi cùng cӫa malt. Nghƭa là tác nhân sҩy ban ÿҫu ÿѭӧc ÿem ÿi sҩy cho lӟp malt ÿã ÿѭӧc sҩy khô bҵng sàng thӭ hai bӕc hѫi tác nhân sҩy mang ҭm cӫa chính sàng ÿҫu tiên này. Sau khi malt sҩy xong chuyӇn ÿi gia công tiӃp thì lҥi chuyӇn malt tѭѫi ÿӃn ÿӇ sҩy sѫ bӝ tiӃp tөc (ÿәi chiӅu tác nhân sҩy) - Lò sҩy hoҥt ÿӝng liên tөc: Trên cѫ sӣ nhӳng loҥi thiӃt bӏ sҩy hҥt kiӇu tháp ÿӇ lӧi dөng tính tӵ chҧy cӫa khӕi hҥt, ViӋn Hàng Lâm Nông NghiӋp latvia (mӝt nѭӟc Cӝng Hoà thuӝc Liên Xô cǊ) ÿã thiӃt kӃ và ӭng dөng thiӃt bӏ sҩy malt hoҥt ÿӝng liên tөc kiӃu tháp, gӑi tҳt là LCXA. Tháp sҩy cao Trang: 36
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 15 m ÿѭӧc chia thánh 3 khu chính: khu tiӃp nhұn và sҩy sѫ bӝ malt tѭѫi, khu sҩy và khu Fҩp nhiӋt - thu nhұn sҧn phҭm. Cҩu tҥo cӫa lò sҩy xem hình 51 - trang 173 cӫa giáo trình. ThiӃt bӏ sҩy làm viӋc nhѭ sau: Malt tѭѫi ÿѭӧc gàu tҧi chuyӇn lên bonke chӭa và tҥi ÿây nó ÿѭӧc sҩy nóng sѫ bӝӣ nhiӋt ÿӝ 30 0C, ÿӝҭm ban ÿҫu cӫa malt tѭѫi khoҧng 44%. Nhӡ các van ÿLӅu chӍnh, malt Wӵ rѫi thành ÿѭӡng liên tөc xuӕng thân tháp. Tҥi ÿây ÿѭӧc chia thành 4 vùng nhiӋt sҩy (không khí nóng qua calorifer ÿѭӧc trӝn vӟi không khí ngoài trӡi nhӡ quҥt rӗi cҩp cho các vùng sҩy), malt ÿi qua các vùng sҩy này và ÿҥt ÿѭӧc ÿӝҭm sau ÿây: Vùng sҩy NhiӋt ÿӝ không khí oC Ĉӝҭm cӫa malt % Ban ke sҩy sѫ bӝ (malt tѭѫi) 30 44 Vùng sҩyI 50 26 Vùng sҩy II 67 12 Vùng sҩy III 81 6 Vùng sҩy IV 85 3 Malt liên tөc chҧy qua các cӱa thu, vào ban ke chӭa ӣÿáy rӗi nhӡ vít tҧi ra ngoài. 7әng thӡi gian vұn chuyӇn nguyên liӋu, sҧn phҭm và sҩy trong khoҧng 9,5 - 10h (thӡi gian sҩy 8 h), có thӇ tӵÿӝng hoá hoàn toàn quá trình sҩy. 3.6. Tách mҫm, rӉ, bҧo quҧn malt: - Tách mҫm, rӉ malt: 0ҫm và rӉ malt khô có tính hút nѭӟc mҥnh, có vӏÿҳng khó chӏu, vì vұy phҧi tách bӓ Pҫm rӉÿӇ hҥn chӃ sӵ hút ҭm, làm ÿҽp mӝt hàng malt, ÿҧm bҧo chҩt lѭӧng malt, ÿӇ nҩu bia không gây nên vӏÿҳng khó chӏu. Tách mҫm và rӉ malt phҧi tiӃn hành ngay sau khi Vҩy, vì nӃu ÿӇ lâu rӉ sӁ hút ҭm trӣ nên dai rҩt khó tách khӓi malt. ĈӇ tách mҫm và rӉ malt ngѭӡi ta dùng thiӃt bӏ cҳt là mӝt lѭӟi thép hình trө quay chұm và ÿһt hѫi nghiêng trong mӝt thùng kín, lӛ lѭӟi có kích thѭӟc 25x15 mm. Bên trong có trөc quay cùng chiӅu nhѭng nhanh hѫn, trên có gҳn các quҥt có các lá thép nhӓ mép hѫi cong ÿӇ cҳt mҫm, rӉ (xem hình ӣ sách tham khҧo). Khi quay thùng thì mҫm, rӉ sӁ bӏ cҳt cùng vӟi hҥt ra ngoài lѭӟi, rӕi nhӡ quҥt hút bөi mҫm, rӉ ra ngoài. - Bҧo quҧn malt: +ҥt malt và nhҩt là vӓ trҩu sau khi sҩy rҩt khô và dòn, thành phҫn chѭa әn ÿӏnh, nên QӃu ÿem ÿi sҧn xuҩt bia thì sӁ không tӕt lҳm (khi nghiӅn dӉ bӏ nát vӓ trҩu nên khi nҩu khó lӑc, dӏch ÿѭӡng có thӇ lên men chұm, bia kém bӅn). Vì vұy ngѭӡi ta thѭӡng bҧo quҧn malt sau khi sҩy xong ít nhҩt là 3 -4 tuҫn, nhiӅu nhҩt ÿӃn 2 năm. Trong quá trình Eҧo quҧn nhѭ vұy, ÿӝҭm malt tăng lên 5 -6% nên vӓ trҩu trӣ nên dai hѫn, hҥt dҿo hѫn, thӇ tích hҥt tăng lên chút ít, malt sӁәn ÿӏnh vӅ thành phҫn hoá hӑc và hoҥt tính enzim. 7ӕt nhҩt là malt ÿѭӧc bҧo quҧn trong thùng sҳt tây, ÿӏnh kì thông gió, nhiӋt ÿӝ bҧo quҧn 200C. Ӟi nѭӟc ta hiӋn nay, toàn bӝ lѭӧng malt cho sҧn xuҩt bia ÿӅu phҧi nhұp khҭu nên thѭӡng ÿã qua quá trình bҧo quҧn, chuyên chӣ (bҵng tàu thuӹ) rҩt lâu, bҧo quҧn trong Trang: 37
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Qѭӟc nhiӋt ÿӟi ÿӝҭm cao nên ÿӝҭm cӫa malt khi ÿem sҧn xuҩt bia thѭӡng cao ÿӃn 8-9%, nên malt bӏ giҧm chҩt lѭӧng nhiӅu. - Ĉánh giá chҩt lѭӧng malt khô: Ĉҥi mҥch ban ÿҫu 100lit 100kg ÿӝҭm 15% Malt sau khi sҩy 90lit 75kg ÿӝҭm 2% Malt sau khi bҧo 100lit 78kg ÿӝҭm 4% quҧn +Cҧm quan: Màu sҳc: Malt vàng : vàng tѭѫi Malt ÿen : tӕi sүm, vӓ óng ánh Kích thѭӟc, hình dáng tѭѫng tӵ nhѭÿҥi mҥch Mùi vӏ: Ĉһc trѭng cho tӯng loҥi malt Malt vàng : ngӑt dӏu Malt ÿen : vӏ cafê, ngӑt mҥnh + Ĉӝ sҥch: Không lүn tҥp chҩt +ҥt vӥ tӕi ÿa 0,5% +ҥt không nҩy mҫm: 5% + ChӍ sӕ cѫ hӑc: * Dung trӑng: Malt rҩt nhҽ: 480 - 500 g/l Malt nhҽ: 500 - 530 g/l Malt trung bình: 530 - 560 Malt nһng: >560 g/l * Trӑng lѭӧng 1000 hҥt: 25 - 38 g * ChӍ sӕ hoá sinh và hoá hӑc: xem giáo trình (trang 181, 182) 3.7. .ӻ thuұt sҧn xuҩt mӝt sӕ loҥi malt ÿһc biӋt: ĈӇ làm tăng chҩt lѭӧng bia, sҧn xuҩt nhӳng loҥi bia ÿһc biӋt, ngѭӡi ta thѭӡng dùng nhӳng loҥi malt chҩt lѭӧng ÿһc biӋt sau ÿây: - Malt caramen: dùng ÿӇ sҧn xuҩt bia ÿen làm cho bia có vӏ caramen, mùi thѫm mҥnh, màu cánh gián, tҥo bӑt tӕt. Malt caramen ÿѭӧc chӃ biӃn tӯ malt tѭѫi hay malt khô nhӡ quá trình ÿѭӡng hoá phө và sҩy ӣ nhiӋt ÿӝ cao hѫn ÿӃn 110 – 1700C. Ngѭӡi ta dùng malt tѭѫi hay malt khô có ÿӝ chiӃt cao (hoҥt lӵc enzim cao) tѭӟi nѭӟc 10 – 15 lit/100g - ÿӇ yên 12h ÿӇ diӉn ra quá trình thuӹ phân nhӳng chҩt nӝi tҥi trong malt, sau ÿó malt ÿѭӧc sҩy trong lò ÿһc biӋt có khҧ năng nâng nhiӋt ÿӝ sҩy lên ÿӃn 1700C, thӡi gian sҩy 2 – 3h. 7ӯ 100g malt khô thѭӡng sӁ thu ÿѭӧc 90 – 95 kg malt caramen, dung trӑng 400 – 450 g/l, ÿӝҭm 5 – 6 %. - Malt cà phê: chӃ biӃn tӯ malt vàng có quá trình ÿѭӡng hoá phө và sҩy ӣ nhiӋt ÿӝ cao 220 – 2250C. Malt ngâm vào nѭӟc nhiӋt ÿӝ 700C trong 12h ÿӇ tҥo thӫ phuӹ phân chҩt màu. Sҩy ӣ nhiӋt ÿӝ cao trong 2 – 2,5h, hҥ nhanh nhiêt ÿӝ sau khi sҩy. Hҥt malt phҧi có Trang: 38
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch màu giӕng màu hҥt cà phê rang, mùi thѫm cà phê rang. Tӯ 100kg malt thѭӡng thu ÿѭӧc 85 – 90 kg malt cà phê dung trӑng 400 – 450 g/l, ÿӝҭm sau khi sҩy 2 – 3%. - Malt melanoit: còn gӑi là malt meland ÿѭӧc chӃ biӃn tӯ ÿҥi mҥch có hàm lѭӧng proteincao (>12%). Nҭy mҫm ӣ nhiӋt ÿӝ cao 200C trong giai ÿRҥn cuӕi 24h, ӫÿӕng sau 1 – 2 ngày ÿӇ nhiӋt ÿӝ tăng lên 50 – 520C, tiӃp tөc ӫ trong 16 – 24h. Sau ÿó tiӃn hành sҩy nhѭ sҩy malt ÿen. Trang: 39
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Chѭѫng 4: SҦN XUҨT ENZIM TӮ THӴC VҰT Enzim tӯ thӵc vұt cǊng chiӃm mӝt tӹ lӋ thích ÿáng trong công nghӋ sҧn xuҩt và sӱ Gөng enzim nói chung. Mӝt sӕ loҥi enzim ÿã ÿѭӧc sӱ dөng nhiӅu trong y hӑc, thӵc phҭm và công nghiӋp. Ĉһc biӋt trong nghiên cӭu khoa hӑc ngѭӡi ta rҩt chú trӑng chiӃt tách và xác ÿӏnh cѫ chӃ tác dөng cӫa các enzim trong các mô thӵc vұt nhѭ nhóm enzim glycoxydaza, nhóm enzim oxy hoá khӱ polyphenoloxydaza (EPPO) ÿã mang lҥi nhӳng giá trӏ lý thuyӃt và thӵc tiӉn rҩt cao trong thӡi gian gҫn ÿây. 4.1. 6ҧn xuҩt ureaza tӯÿұu rӵa: Chi hӑÿұu Canavalia ӣ châu phi, ӣ ViӋt Nam có loài Canavalia ensifomis - ÿѭӧc gӑi là cây ÿұu rӵa, ÿұu tҩc; hҥt dùng chӳa bӋnh lui hàn, nҩc cөt, yӃu thұn. Trong hҥt ÿұu rӵa, hàm lѭӧng ureaza có thӇ ÿҥt ÿӃn 20% chҩt khô do ÿó ÿay là nguӗn nguyên liӋu quan trӑng ÿӇ thu nhұn ureaza. - VӅ mһt ӭng dөng: ureaza ÿѭӧc sӱ dөng trong y tӃÿӇ xác ÿӏnh hàm lѭӧng urê trong huyӃt, bàng quan, có trong thành phҫn cӫa thuӕc chһng thұn nhân tҥo. Trong chӃ biӃn Pӝt sӕ loҥi cá có mùi khai (ÿXӕi, nhám, mұp) thì dùng ureaza ÿӇ khӱ mùi khai rҩt hiӋu quҧ.Ureaza có thӇ xúc tác thuӹ phân urê cҧ trong và ngoài tӃ bào (có thӇ). (NH2)2CO + H2O ureaza 2NH3 + CO2 + ChiӃt xuҩt lҩy enzim: NghiӅn kӻ bӝt ÿұu trong dung dӏch HCl 0,4% có thêm EDTA (trilon B, complexon III) 5.10-3 M và L.cystein 5.10-3 M. Sau ÿó ly tâm tách bã lҩy dӏch chiӃt. + Xӱ lý nhiӋt: Nâng nhiӋt nhanh ÿӃn 600C, giӳ trong 30 phút ÿem ly tâm tách bӓ cһn NӃt tӫa. + Siêu lӑc: dӏch ly tâm ÿѭӧc lӑc qua màng siêu lӑc ÿӇ loҥi bӓ peptit và polypeptit có trӑng lѭӧng phân tӱ bé (M>500) + KӃt tӫa bҵng axeton: 'ӏch lӑc ÿѭӧc xӱ lý bҵng axeton lҥnh (tӹ lӋ 1:1), ly tâm tách kӃt tӫa. Phҫn kӃt tӫa ÿem hoà tan trong trisbuffer 0,1M, pH = 7 chӭa EDTA và L.cystein 5.10-3 M. +Sҳc ký trao ÿәi ion 'ӏch enzim ÿѭӧc chҥy sҳc ký trao ÿәi ion trên cӝt chӭa DEAE – xenluloza vӟi gradien Qӗng ÿӝ NaCl tӯ 0 – 1M. Phân ÿRҥn chӭa enzim ÿѭӧc sҩy thăng hoa (ÿông khô) vӟi chҩt sacaroza làm chҩt әn ÿӏnh vӟi tӹ lӋ 2,5mg/1mg enzim. ChӃ phҭm thu ÿѭӧc có hoҥt tính tăng 25 lҫn so vӟi ban ÿҫu và hiӋu suҩt thu hӗi 43%. Xem bҧng 8 cӫa giáo trình (trang 186). Mӝt sӕ thông sӕ cӫa quá trình thu nhұn ureza Wӯÿұu rӵa. 4.2. Thu nhұn bromelain tӯ dӭa: - Giӟi thiӋu quҧ dӭa: tên latinh: Bromelia ananas-L: thuӝc chi dӭa ăn quҧ. Ngoài ra còn có chi dӭa dҥi (ÿӇ lҩy sӧi ). Trang: 40
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Bromelain có nhiӅu trong phӃ liӋu dӭa nhѭ vӓ, lõi, chӗi, lӛi ÿҫu. Giӟi thiӋu ÿһc ÿLӇm chӃ phҭm Bromelain (Xem quá trình trang 187-189). Nguyên tҳc chung ÿӇ thu nhұn Bromelain. PhӃ liӋu dӭa làm dұp chiӃt lӑc ly tâm kӃt tӫa ly tâm lӑc chӃ phҭm kӻ thuұt Sҳc ký trao ÿәi ion sҩy thăng hoa sҧn phҭm tinh khiӃt . Ghi chú: kӃt tӫa bҵng (NH4)2SO2 lҥnh hay axeton lҥnh tӍ lӋ 1:1. - Thu nhұn Bromelain bҵng phѭѫng pháp nhanh sӱ dөng CMC. Thu nhұn Bromelain bҵng phѭѫng pháp mô tҧ nhѭӣ trên ÿòi hӓi thӡi gian lâu, khó Oӑc, lѭӧng dӏch lӟn, khó bҧo quҧn. HiӋn nay mӝt sӕ nhà nghiên cӭu ÿã dùng phѭѫng pháp nhanh tách Bromelain bҵng CMC. Cho phép thu ÿѭӧc Bromelain bӝt trҳng có hoҥt tính cao, thӡi gian nhanh, ÿѫn giҧn nhѭ sau: + Công nghӋ chӃ tҥo CMC (xem giáo trình trang 191). Chú ý : có thӇ thay vҧi màn (hay gҥt) bҵng bông nón ( Xenluloxa ~ 100%). + Tách chiӃt Bromelain tӯ dӏch chiӃt dӭa bҵng CMC. CMC ÿѭӧc tҭm ѭӟt bҵng dung dӏch ÿӋm photphat 0,05 M, pH= 6,1. Cho dӏch chӗi dӭa ( chӗi dӭa ĺ nghiӅn ĺ ép lӑc ĺQѭӟc dӏch) vào, thӍnh thoҧng khuҩy trӝn. Emzim Bromelain sӁ hҩp thө lên bӅ mһt cӫa CMC. Sau 2 giӡ lҩy ra vҳt nѭӟc loҥi bӓ cһn bҭn bám vào CMC, rӱa trôi các prôtêin không phҧi enzim bҵng ÿӋm photphat ӣ pH=6,5. Sau ÿó cho phҫn hҩp thө lҫn 1. Dung dӏch phҫn hҩp thө là ÿӋm photphat pH=7,1, NaCl 0,5 N khuҩy trӝn. Sau 2 giӡ lҩy ra vҳt ÿѭӧc dung dӏch ÿұm dһc chӭa bromelain. TiӃp tөc phҫn Kҩp thө nhѭ lҫn thӭ hai rӗi gӝp chung dӏch chiӃt cӫa cҧ hai lҫn kӃt tӫa enzim bҵng axeton hay còn lҥnh. 9ӟi phѭѫng pháp này hiӋu xuҩt thu hӗi ÿҥt 0,1% so vӟi chӗi dӭa tѭѫi, chӃ phҭm có hoҥt tính 24 ÿѫn vӏ (mg chӃ phҭm enzim. So vӟi phѭѫng pháp kӃt tӫa tӯ ban ÿҫu bҵng (NH4)2SO4 thì ÿӝ sҥch cao hѫn hai lҫn, thӡi gian nhanh hѫn, tiӃn hành thuұn lӧi hѫn. - Mӝt sӕӭng dөng cӫa chӃ phҭm bromelain: + Thuӹ phân gan bò: Gan bò ÿѭӧc xӱ lý bҵng chӃ phҭm bromelain trong10 giӡӣ 1-55 0C, sau ÿó vô hoҥt enzim ӣ 100 0C trong 3-4 phút. Dӏch ÿӵoc lӑc và ÿông khô thành dҥng bӝt là chӃ phҭm hӛn hӧp axit amin y tӃ (sҧn xuҩt các dӏch truyӅn ÿҥm y tӃ). Thành phҫn axit amin Fӫa chӃ phҭm thuӹ phân gan bò bӣi bromelain ÿѭӧc trình bày ӣ bҧng 12 (trang 193 cӫa giáo trình). +Sӱ dөng bromelain làm ÿông sӳa: ĈӇ làm ÿông sӳa trong phѭѫng pháp truyӅn thӕng (trong CN-SX photphat) ngѭӡi ta sӱ Gөng renin thu ÿѭӧc tӯ ngăn thӭ 4 cӫa dҥ dày bê. HiӋn nay, lѭӧng renin chѭa ÿáp xӭng ÿӫ nhu cҫu cӫa công nghӋ. Trong nhӳng năm gҫn ÿây xu hѭӟng sӱ dөng proteaza thӵc Yұt ÿӇ thay thӃ mӝt phҫn renin trong chӃ biӃn phomat ÿang ÿѭӧc phát triӇn. Trong ÿó Trang: 41
CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch ÿáng kӇ nhҩt là 2 loҥi chӃ phҭm: ficin tӯ cây cӑ ficus và bromelain tӯ dӭa. KӃt quҧӭng Gөng xem bҧng 13 (trang 194 cӫa giáo trình) + Sӱ dөng bromelain ÿӇ thu nhұn các chҩt ӭc chӃ proteaza. Trong mӝt sӕ loҥi cѫ quan ÿӝng vұt, thӵc vұt tӗn tҥi các chҩt ӭc chӃ enzim, trong ÿó có chҩt ӭc chӃ proteaza, chúng có bҧn chҩt protein nhѭ enzim. ĈLӇn hình nhѭ trong các hҥt hӑÿұu: ÿұu tѭѫng, ÿұu xanh, ÿұu ván, hҥt mít, nӝi tҥng cӫa mӵc nang, ÿӍa, trong Gӭa (tӗn tҥi song song vӟi bromelain). Các chҩt ӭc chӃ thѭѫng tác ÿӝng mҥnh lên mӝt sӕ enzim, trong ÿó có cҧ enzim trong ÿѭӡng tiêu hoá (cӫa ngѭӡi và ÿӝng vұt) nhѭ: ficin, bromelain, tripxin. ĈӇ thu hӗi ÿѭӧc các chҩt ӭc chӃ này, ngѭӡi ta dùng phѭѫng pháp hiӋn ÿҥi, hiӋn nay là dùng enzim cӕÿӏnh. Bromelain sau khi thu nhұn bҵng CMC nhѭ trên ÿѭӧc cӕÿӏnh trong gel sepharoza rӗi nhӗi vào tҥo ra cӝt phҧn ӭng. Dӏch nghiӅn, lӑc phӃ liӋu dӭa ÿѭӧc cho chҥy qua cӝt này: ÿҫu tiên ӣ pH photphat 4,6, sau ÿó pH = 7,6 – 7,8, tiӃp ÿó xҧy ra quá trình liên kӃt giӳa bromelain vӟi các chҩt ӭc chӃ. Thu hӗi chҩt ӭc chӃ Eҵng NaOH 0,01N + NaCl 0,1N vӟi pH = 11,5 – 12; có ÿӑtinh sҥch, hoҥt tính cao (xem Eҧng 14 trang 195 cӫa giáo trình). Ngoài ra bromelain có sӱ dөng trong quá trình làm PӅm thӏt, sҧn xuҩt nѭӟc mҳm ngҳn ngày, bӝt cá. - Thu nhұn papain tӯ nhӵa ÿu ÿӫ: Cây ÿu ÿӫ (carica papaya.L), quҧ dùng làm thӵc phҭm. nhӵa quҧ ÿu ÿӫ làm thuӕc giun, chai chân, mөn cѫm, sѭng khӟp, eczema. RӉ làm thuӕc cҫm máu, sӓi thұn. Hoa 0 chӳa ho, viêm cuӕng phәi, lá chӳa ung thѭ phәi. Papain có M = 20.700, top = 80 C, pHop = 5 – 5,5. Bӏӭc chӃ và mҩt hoҥt tính bӣi H2O2, Iodoaxetat, I2, fericianua. Ĉѭӧc hoҥt hóa Eӣi -CN, cystein, H2S và glutation. + Thu nhұn papain thô: Dùng các loҥi quҧÿu ÿӫ còn non, ÿu ÿӫ già (chѭa chín), dùng khăn lau sҥch vӓ, lҩy dao cҥo sҥch nhӳng ÿѭӡng không quá sâu, hӭng nhӵa (catex) vào cӕc rӗi làm khô bҵng các phѭѫng pháp khác nhau, ta thu ÿѭӧc chӃ phҭm papain thô có hoҥt tính nhѭ bҧng 15 (trang 196 cӫa giáo trình). .Ӄt quҧ cho thҩy hoҥt tính papain sau khi chiӃt tách cao hѫn khi ÿã ÿӇ 3 tháng. Phѭѫng pháp phѫi nҳng cho kӃt quҧ hoҥt ÿӝ enzim thҩp nhҩt, sҩy chân không dung môi (axeton hay rѭӧu etylic lҥnh) cho hoҥt tính cao nhҩt. ChӃ phҭm cҫn bҧo quҧn lҥnh 6 – 100C mӟi duy trì hoҥt tính. + Thu nhұn papain thѭѫng phҭm: Ngâm papain thô hoà tan nhӵa tѭѫi (catex) trong nѭӟc cҩt có bә sung glyxerin ÿӇ tăng ÿӝ hoà tan, lӑc qua vҧi màn. KӃt tӫa bҵng axeton lҥnh vӟi tӹ lӋ 2:1 so vӟi thӇ tích dӏch Oӑc. Ly tâm lҥnh lҩy kӃt tӫa, sҩy 45 – 500C (sҩy chân không hay phѫi khô), ÿem nghiӅn thành bӝt. Ӣ nѭӟc ta hiӋn nay viӋn công nghӋ sinh hӑc ÿã sҧn xuҩt thành công chӃ phҭm papain thѭѫng mҥi dҥng ÿông khô. Bҧng 16 so sánh hoҥt tính (trang197) cӫa papain thѭѫng mҥi quӕc tӃ vӟi papain tѭѫi và ÿông khô ViӋt Nam. KӃt quҧ ÿLӋn di ÿó (trên gel Trang: 42