›
›

Khóa luận Nghiên cứu xác định axit hữu cơ trong lá cây sống đời (Kalanchoe Pinnata) ở xã Hoà Liên, huyện Hoà Vang, thành phố Đà Nẵng

pdf 56 trang ngocly 1900
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu xác định axit hữu cơ trong lá cây sống đời (Kalanchoe Pinnata) ở xã Hoà Liên, huyện Hoà Vang, thành phố Đà Nẵng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_xac_dinh_axit_huu_co_trong_la_cay_song.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu xác định axit hữu cơ trong lá cây sống đời (Kalanchoe Pinnata) ở xã Hoà Liên, huyện Hoà Vang, thành phố Đà Nẵng

  1. 1 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA HÓA NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH AXIT HỮU CƠ TRONG LÁ CÂY SỐNG ĐỜI (KALANCHOE PINNATA) Ở XÃ HOÀ LIÊN, HUYỆN HOÀ VANG, THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN SU PHẠM Giáo viên hướng dẫn : GS.TS Đào Hùng Cường Sinh viên thực hiện : Trương Văn Cương – 08SHH Đà Nẵng - Năm 2012
  2. 2 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây sống đời, tên khoa học là Kalanchoe pinnata (Lamk.) Pers, họ Crassulaceae, có các tên gọi khác nhƣ cây thuốc bỏng, trƣờng sinh, diệp sinh căn. Nó vừa là cây cảnh, vừa là một cây thuốc đƣợc sử dụng từ lâu đời trong y học cổ truyền không chỉ ở Việt Nam mà cả trên thế giới. Có thể sử dụng tất cả bộ phận của cây sống đời nhƣng chủ yếu là dùng lá. Cây sống đời phân bố ở khu vực châu Á, Thái Bình Dƣơng, Caribe. Nó cũng phân bố rộng rãi ở Việt Nam. Cây sống đời dễ trồng, là cây mọc hoang dã, chỉ cần bẻ hoặc cắt một lá già cắm xuống đất là đƣợc. Cây sống đời có tác dụng chữa các bệnh tiêu thũng, giảm đau, sinh cơ, viêm phế quản, viêm khớp, bóng nƣớc, bỏng và các công dụng nhƣ kháng khuẩn, làm lành các vết thƣơng, lỡ loét, viêm tấy, cầm máu, ức chế miễn dịch, bảo vệ gan, thận, an thần, chống tác nhân gây đột biến, làm thuốc giải độc. Trên thế giới các loài thuộc chi Kalanchoe rất đƣợc chú trọng nghiên cứu trong các lĩnh vực: chiết tách, xác định thành phần các hợp chất hữu cơ, nghiên cứu tính kháng khuẩn chống độc tế bào [12]. Ở nƣớc ta cho đến nay chƣa có nghiên cứu nào mang tính cơ bản về thành phần, tính chất, khả năng ứng dụng, công nghệ khai thác các hợp chất hoá học có trong lá sống đời. Để góp phần vào nguồn tƣ liệu về loài cây sống đời cũng nhƣ phát triển những tác dụng chữa bệnh tuyệt vời của nó, tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu xác định axit hữu cơ trong lá cây sống đời (Kalanchoe pinnata) ở xã Hoà Liên, huyện Hoà Vang, thành phố Đà Nẵng”. 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần axit hữu cơ trong lá cây sống đời. Từ đó đóng góp vào nguồn thông tin, tƣ liệu khoa học về cấy sống đời, tạo cơ sở khoa học phát huy những tác dụng chữa bệnh của nó. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Đối tƣợng: lá cây sống đời hái ở xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang, TP. Đà Nẵng. - Phạm vi nghiên cứu:
  3. 3 + Xác định một số chỉ số nhƣ độ ẩm, hàm lƣợng tro của lá tƣơi. + So sánh, xác định tổng lƣợng axit chiết đƣợc bằng các dung môi khác nhau từ các phƣơng pháp chiết khác nhau. + Định danh một số axit bằng phổ GC-MS. + Thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxi hóa của dịch chiết lá tƣơi. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1. Nghiên cứu lý thuyết - Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tƣ liệu, sách báo trong và ngoài nƣớc. - Trao đổi kinh nghiệm với các chuyên gia, thầy cô giáo và đồng nghiệp. 4.2. Phƣơng pháp thực nghiệm - Phƣơng pháp lấy mẫu, thu hái và xử lý mẫu; - Phƣơng pháp xác định các chỉ số vật lý và hóa học: xác định độ ẩm bằng phƣơng pháp trọng lƣợng, xác định hàm lƣợng tro bằng phƣơng pháp tro hóa mẫu; - Phƣơng pháp chiết: ngâm kiệt, chƣng ninh, chiết soxhlet bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau; - Phƣơng pháp chuẩn độ axit – bazơ để định lƣợng các axit hữu cơ phân cực; - Phƣơng pháp xác định thành phần hóa học, định danh và xác định cấu trúc các cấu tử chính bằng phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS); - Thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxi hóa của dịch chiết lá tƣơi. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5.1. Ý nghĩa khoa học Cung cấp thông tin khoa học về thành phần axit và công dụng phối hợp của nó trong lá cây sống đời góp phần nâng cao giá trị sử dụng của cây sống đời và làm tƣ liệu cho những nghiên cứu sau này. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn - Giúp cho việc ứng dụng lá cây sống đời ở phạm vi rộng một cách khoa học hơn. - Giải thích một cách khoa học một số kinh nghiệm, bài thuốc dân gian, ứng dụng của lá cây sống đời.
  4. 4 6. Cấu trúc luận văn Luận văn này có 46 trang trong đó phần mở đầu 3 trang, kết luận kiến nghị 1 trang, tài liệu tham khảo có 3 trang. Luận văn có 7 bảng, 28 hình và đồ thị. Nội dung chia thành 3 chƣơng: Chƣơng 1: Tổng quan (12 trang) Chƣơng 2: Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu (5 trang) Chƣơng 3: Kết quả và thảo luận (22 trang)
  5. 5 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU CÂY SỐNG ĐỜI - Cây sống đời hay còn gọi là cây bỏng, lá bông, trƣờng sinh, diệp sinh căn, đà bất tử , vừa là cây cảnh, vừa là một cây thuốc chữa bệnh hàng ngày đơn giản và hiệu quả. - Tên Khoa học: Kalanchoe pinnata (Lamk.) Pers. 1805 (CCVN, 1:967) [2] - Cây sống đời thuộc: + Lớp: Magnoliopsida + Bộ: Saxifragales + Họ: thuốc bỏng (Crassulaceae) + Chi: Kalanchoe. Bao gồm khoảng 33 chi chứa khoảng 1.400 loài Hình 1.1. Cây sống đời 1.2. PHÂN BỐ Cây sống đời là một loại cây tự nhiên ở khu vực của châu Á, Thái Bình Dƣơng và vùng Caribe. Nó cũng phân bố rộng rãi ở Việt Nam[12]. Lí do chủ yếu mà nó đƣợc phân bố rộng rãi nhƣ vậy là nó có khả năng sống ở nhiều vùng khí hậu khác nhau và chúng ta có thể dễ dàng trồng nó trong vƣờn. 1.3. ĐẶC ĐIỂM CÂY SỐNG ĐỜI Cây sống đời dễ trồng, là cây mọc hoang dã, chỉ cần bẻ hoặc cắt một lá già cắm xuống đất là đƣợc và hoa của cây sống đời màu tím hồng khá đẹp nên sống đời đƣợc trồng nhiều làm cây cảnh và đƣợc trồng trong chậu hoa nhỏ và dùng để trang trí trong nhà.
  6. 6 Cây sống đời có thân thảo rỗng, cao 0,5-1 mét; có hai loại lá: một loại lá to và một loại lá nhỏ. Lá mọc đối thành hình chữ thập, lá dày có khí nguyên; mép lá có răng cƣa tù, to, mặt lá bóng có cuống dài từ 2-5 cm. Hoa mọc ở ngọn hoặc kẽ lá, màu tím hồng, rủ chúc xuống nhƣ đèn lồng. Hoa nở vào tháng 3-5, có quả vào tháng 4-6. [28] Cây sống đời có vị nhạt, hơi chua chua, chát chát, rất dễ uống khi ốm đau lại có tính mát, rất tốt dùng trong tiêu thũng, chỉ thống, sinh cơ. Sống đời còn dùng làm thuốc giải độc và chữa bỏng. 1.4. CÔNG DỤNG CÂY SỐNG ĐỜI Các nƣớc trên thế giới đã sử dụng cây sống đời từ lâu với nhiều mục đích phong phú. Tại Brazil sử dụng chữa áp-xe, các bệnh vòm họng, viêm phế quản, viêm khớp, bóng nƣớc, bỏng, những cục chai, viêm kết mạc, ho, viêm da, bệnh da liễu, đau tai, eczema, phù, sốt, bệnh tăng nhãn áp, nhức đầu, nhiễm trùng, viêm, côn trùng đốt, các vấn đề đƣờng ruột, ngứa, sỏi thận, rối loạn bạch huyết, lở loét miệng căng thẳng, nhiễm trùng hô hấp, bệnh thấp khớp, vấn đề về da, đau răng, bệnh lao, ung thƣ, loét, suy tiết niệu, mụn cơm, ho gà, vết thƣơng, và sử dụng nhƣ thuốc an thần. Tại Ecuador ngƣời bản địa sử dụng nƣớc tách từ lá cho xƣơng bị gãy, vết bầm tím bên trong, sử dụng chữa nhức mỏi, tiêu chảy, các vấn đề về da. Tại Ấn Độ sử dụng chữa cảm giác khó chịu bụng, sôi, vết bầm tím, bệnh tả, cầm máu sát trùng vết cắt, bệnh tiểu đƣờng, tiêu chảy, kiết lỵ, đầy hơi, nhức đầu, sỏi thận, khó tiêu, côn trùng cắn, ghẻ, lở loét, suy tiết niệu, vết thƣơng. Tại Mexico sử dụng chữa các bệnh nhiễm trùng mắt, nhức đầu, viêm nhiễm, rối loạn kinh nguyệt, nổi mụn, vết thƣơng. Tại Nicaragua sử dụng chữa đau nhức, bỏng, cảm lạnh, ho, sốt, nhức đầu, đau, nhiễm trùng đƣờng hô hấp. Tại Nigeria sử dụng chữa ho, đau tai, eczema, viêm, nổi mụn. Tại Peru sử dụng chữa các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, bóng nƣớc, gãy xƣơng, viêm phế quản, ung thƣ (ung thƣ hạch), viêm kết mạc, ho, đau tai, nhiễm trùng mắt, động kinh, viêm quầng, sốt, khí đốt, nhức đầu, ợ nóng, viêm, các vấn đề đƣờng ruột, đau nửa đầu, buồn nôn, vấn đề về da, lở loét, viêm niệu đạo. Tại Nam Mỹ sử dụng chữa bệnh suyễn, đau tai, đau đầu, ức chế các khối u. Tại Mỹ sử dụng chữa thủy đậu, sốt, đau bụng Những loài khác nhau của cây sống đời đƣợc sử
  7. 7 dụng nhiều trong y học tại Đông Dƣơng và quần đảo Philippines. Lá và vỏ cây là thuốc bổ đắng, chất làm se cho ruột, giảm đau, tống hơi trong ruột, hữu ích trong điều trị tiêu chảy và ói mửa. Nó đƣợc ứng dụng để chữa trị bên ngoài lẫn bên trong, điều trị cho tất cả các loại đau và viêm, nhiễm vi khuẩn, virus và bệnh nấm, nhiễm trùng, leishmaniasis, đau tai, nhiễm trùng hô hấp trên, viêm loét dạ dày, cảm cúm, sốt, điều trị vết cắt, vết thƣơng, trĩ, chứng rong kinh, sự đổi màu của da, bóng nƣớc, loét tróc vảy, mắt, bỏng, tiêu chảy, kiết lỵ, đau đầu, ói mửa, viêm cấp tính và viêm phế quản [15] Ở Việt Nam, lá cây sống đời cũng đƣợc sử dụng trong nhiều bài thuốc dân gian: - Say rƣợu: Ăn 10 lá sống đời, sau 10 phút sẽ khỏi say. - Viêm họng: Ăn 10 lá sống đời, chia làm 10 lần trong ngày (sáng 4 lá, chiều 4 lá, tối 2 lá). Nên nhai ngậm và nuốt cả bã. Dùng trong 3 ngày là khỏi. - Mất sữa: Sáng và chiều mỗi lần ăn 8 lá sống đời, sau 2 ngày sẽ có sữa. - Mất ngủ: Chiều và tối ăn mỗi lần 8 lá sống đời, giấc ngủ sẽ đến sớm. - Viêm xoang mũi: Giã nát 2 lá sống đời, lấy nƣớc thấm vào bông, nút hố mũi bên viêm. Ngày làm 4-5 lần. Nếu viêm cả 2 bên thì sáng nút một bên chiều nút một bên. - Trĩ nội: Mỗi ngày dùng 10 lá sống đời (sáng 4 lá, chiều 4 lá, tối 2 lá) nhai nuốt bớt nƣớc, bã bỏ vào gạc vải, đắp lên hậu môn. Trƣớc khi đắp thuốc phải làm vệ sinh hậu môn bằng nƣớc pha muối. Sau 20-45 ngày sẽ khỏi. - Kiết lỵ (viêm đại tràng): Mỗi ngày ăn 20 lá sống đời (sáng 8 lá, chiều 8 lá, tối 4 lá). Trẻ 5-10 tuổi dùng liều bằng nửa ngƣời lớn. Ăn 5 ngày là khỏi. 1.5. CÁC TÁC DỤNG DƢỢC LÝ CỦA CÂY SỐNG ĐỜI Cây sống đời từ lâu đã đƣợc biết đến nhƣ cây thuốc và đƣợc đánh giá cao trên thế giới nhƣ là một nguồn phong phú của khả năng trị bách bệnh. Phần lá và phần rễ đều có tác dụng chữa trị cao [20]. Sống đời Kalanchoe giàu ancaloit, triterpenes, glycosides, flavonoid, steroid và chất béo. Đặc biệt lá có chứa một nhóm các hóa chất gọi là bufadienolides. Nó có cấu trúc và hoạt động tƣơng tự nhƣ hai glycosides tim khác, digoxin và digitoxin (thuốc dùng để điều trị lâm sàng của suy tim sung
  8. 8 huyết và điều kiện liên quan). Gần đây các nhà hóa học Nhật Bản phát hiện khả năng kháng khuẩn gây bệnh sốt rét ở lá sống đời tuy nhiên vẫn chƣa chứng minh thành phần nào có tác dụng chính trong công dụng này. Nhiều bài thuốc cổ truyền của Kalanchoe Pinnata đã đƣợc giải thích bởi các nghiên cứu lâm sàng đƣợc tiến hành cho đến nay. Nó đƣợc sử dụng làm thuốc giảm đau, chống dị ứng, chống phản vệ (làm giảm phản ứng dị ứng), chống viêm, antitumorous, antiulcerous, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng histamine, kháng siêu vi, trầm cảm hệ thần kinh trung ƣơng, giải nhiệt (giảm sốt) gastroprotective (bảo vệ dạ dày), ức chế miễn dịch (ngăn chặn một số tế bào miễn dịch), immunomodulator (điều biến một số tế bào miễn dịch overactive), vết thƣơng do côn trùng, giãn cơ, thuốc an thần [27]. 1. Kháng khuẩn: Sự hiện diện của các hợp chất phenolic chỉ ra rằng cây sống đời có khả năng chống vi khuẩn. Lá và nƣớc ép lá tƣơi đã đƣợc chứng minh vai trò quan trọng trong hoạt động kháng khuẩn đối với Staphylococcus, E. coli, Shigella, Bacillus và Pseudomonas [11]; 2. Chống ung thƣ: Các lá có chứa một nhóm chất gọi là bufadienolides. Nó có cấu trúc và tác động tƣơng tự nhƣ hai glycoside tim khác là digoxin và digitoxin (thuốc đƣợc sử dụng để điều trị lâm sàng của suy tim sung huyết và một số bệnh liên quan). Bufadienolides của Kalanchoe đã chứng minh trong nghiên cứu lâm sàng có tính kháng khuẩn, phòng ngừa ung thƣ [21]. Bersaldegenin-1,3,5-orthoacetate ức chế sự tăng trƣởng một số tế bào ung thƣ; 3. Chống giun kí sinh: Trích xuất nƣớc ép lá Kalanchoe đã đƣợc chứng minh ngăn ngừa và điều trị leishmaniasis (một bệnh ký sinh trùng phổ biến ở các nƣớc nhiệt đới đƣợc truyền qua vết thƣơng hở) ở cả ngƣời và động vật [16]; 4. Chống côn trùng: Bryophyllin A cho thấy hoạt động mạnh mẽ chống lại ấu trùng côn trùng của tằm [22]; 5. Chống dị ứng: Công dụng truyền thống của Kalanchoe trong trị bệnh hô hấp và ho có thể đƣợc giải thích bằng các nghiên cứu chứng minh rằng nƣớc ép lá có tiềm năng chống histamine và chống dị ứng. Trong một nghiên cứu (với chuột và
  9. 9 lợn guinea) nƣớc ép lá đã có thể bảo vệ chống lại các chất hóa học gây ra phản ứng phản vệ và tử vong do chọn lọc ngăn chặn các thụ thể histamine trong phổi; 6. Chống viêm: Các nghiên cứu trên cơ thể đã khẳng định rằng Kalanchoe có thể làm giảm sốt, kháng viêm, giảm đau và tác dụng giãn cơ. Hiệu ứng chống viêm của nó đã đƣợc giải thích một phần do tăng khả năng hệ miễn dịch [24]; 7. An thần: Trong các nghiên cứu trên động vật kalanchoe cung cấp trích xuất an thần. Công dụng này do một phần trích xuất lá làm tăng nồng độ của một chất truyền thần kinh trong não gọi là GABA (gamma aminobutyric axit) [13]; 8. Phòng, chống loét: Trích xuất lá bảo vệ chuột khỏi loét, gây cảm ứng nhƣ căng thẳng, aspirin, ethanol và histamine và giảm căng thẳng Hyper [16]. Các lá cây có chứa hydroxyproline chữa lành những vết thƣơng [18]; 9. Chất chống oxi hóa: Lá cây có chứa hợp chất phenolic nhƣ axit phenolic và Quercetin là chất chống oxy hóa [9], [24]; 10. Chống kí sinh trùng sốt rét: Những nghiên cứu gần đây tập trung làm sáng tỏ khả năng chữa bệnh sốt rét của lá sống đời, tuy nhiên vẫn chƣa cho kết quả rõ ràng nhất thành phần nào có công dụng chính cho tác dụng này [8], [23]. 11. Chống tác nhân gây đột biến: Obaseiki-et al Ebor điều tra rằng lá chiết bằng dung môi hữu cơ đã hoạt động ức chế đột biến gây ra bởi hoạt động của ethyl methanesulfonate TA100 S. typhimurium hoặc TA1002 và cũng hoạt động chống lại tác động ngƣợc gây ra bởi 4nitro-phenylenediamine-o và 2-aminofluorene tại TA98. 12. Bảo vệ gan và thận: Nƣớc ép của lá tƣơi đƣợc sử dụng rất hiệu quả để điều trị vàng da ở khu vực Bundelkhand của Ấn Độ. Có tác dụng bảo vệ hiệu quả trong việc giảm gentamicin gây ra ở thận chuột, nó có thể bao gồm chất chống oxy hóa và các hoạt động khử các gốc oxi hoá. 1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HÓA HỌC THỰC VẬT CỦA CHI KALANCHOE Cho đến nay trên thế giới tìm ra khoảng 33 chi Kalanchoe trong đó có gần 1400 loài. Riêng Việt Nam có trên 10 loài thuộc chi Kalanchoe. Toàn cây đƣợc sử dụng nhƣng lá đƣợc dùng phổ biến hơn cả.
  10. 10 Thành phần hóa học của lá có các hợp chất phenolic bao gồm axit p-cumaric, syringic, axit caffeic, p-hydroxybenzoic. Các axit nhƣ axit malic, isocitric, citric, succinic, fumaric, pyruvic, oxalacetic, lactic, oxalic và một số axit hữu cơ khác. Ngoài ra còn có các glucosid flavonoic nhƣ quercetin 3-diarabinosid, kaempferol 3- glucosid [27]. Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, tác giả làm rõ thành phần cách trích xuất và công dụng một số axit có trong lá cây sống đời. Công dụng nhóm axit trong bảo quản thực phẩm và diệt khuẩn bởi vì các hiệu ứng của chúng với vi khuẩn. Nguyên tắc cơ bản quan trọng về cơ chế hoạt động của các axit hữu cơ với vi khuẩn là axit hữu cơ không phân li có thể xâm nhập vào thành tế bào vi khuẩn và làm gián đoạn sinh lý bình thƣờng của một số loại vi khuẩn mà chúng ta gọi là nhạy cảm với pH, có nghĩa là chúng không thể chịu đƣợc một sự thay đổi pH lớn bên trong và ngoài cơ thể. Trong số đó có vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella spp. C.perfringens, Listeria monocytogenes, và Campylobacter. Khi khuếch tán thụ động của các axit hữu cơ vào các vi khuẩn, nơi mà độ pH là gần hoặc trên trung tính, các axit sẽ phân li và giảm pH bên trong vi khuẩn, sẽ làm giảm hoặc ngừng sự phát triển của vi khuẩn. Mặt khác, phần anion của các axit hữu cơ không thể thoát khỏi các vi khuẩn trong mẫu phân ly của nó sẽ tích tụ trong các vi khuẩn và phá vỡ nhiều chức năng trao đổi chất, dẫn đến tăng áp suất thẩm thấu, không tƣơng thích với sự tồn tại của vi khuẩn. Dựa vào cấu tạo gốc R gắn vào -COOH có thể chia axit thành các nhóm sau: 1.6.1. Nhóm axit phenolic Hợp chất phenolic là một lớp các hợp chất hữu cơ bao gồm một nhóm hidroxyl (-OH) gắn với một nhóm hydrocacbon thơm. Mặc dù tƣơng tự nhƣ các hợp chất ancol nhƣng lớp phenol có các thuộc tính duy nhất chỉ chúng có do nhóm hidroxyl không liên kết với nguyên tử cacbon no. Chúng có tính axit tƣơng đối cao do vòng thơm kết hợp mạnh với nguyên tử ôxy và liên kết tƣơng đối lỏng lẻo giữa nguyên tử ôxy này với nguyên tử hiđrô trong nhóm hidroxyl. Tính axit của nhóm hidroxyl trong các phenol nói chung nằm trong khoảng trung gian giữa các rƣợu và các axit cacboxylic (pKa của chúng thông thƣờng nằm trong khoảng 10 - 12).
  11. 11 Axit phenolic bao gồm nhóm hydroxyl gắn trực tiếp trên cacbon thơm và gốc axit cacboxylic. Trong thực vật nó tồn tại dạng đơn chất, este, ete Chúng tạo thành một nhóm đa dạng bao gồm các axit hydroxybenzoic phân phối rộng rãi và hydroxycinnamic. Hợp chất axit hydroxycinnamic dạng thƣờng gặp nhất là este đơn giản với hydroxy axit cacboxylic hoặc glucose. Hợp chất axit hydroxybenzoic có mặt chủ yếu ở các hình thức glucosides. Axit phenolic là chất chuyển hóa thực vật. Hợp chất phenolic rất cần thiết cho sự tăng trƣởng và sinh sản của thực vật, và đƣợc sản xuất nhƣ một phản ứng bảo vệ thực vật “bị thƣơng” chống lại tác nhân gây bệnh. Gần đây các nhà khoa học quan tâm đến axit phenolic bắt nguồn từ vai trò bảo vệ tiềm năng của nó, thông qua uống nƣớc ép trái cây và rau quả tƣơi, chống lại các bệnh gây ra bởi tác nhân oxy hóa nhƣ: bệnh tim mạch vành, đột quỵ, và ung thƣ [9]. 1.6.1.1. Axit caffeic Danh pháp: 3 - (3,4-dihydroxyphenyl 2- propenoic axit) Công thức cấu tạo: công thức phân tử C9H8O4, cấu tạo nhƣ (Hình 1.2) là một Hình 1.2. Axit caffeic hydroxycinamic axit, một hợp chất hữu cơ tự nhiên, rắn, màu vàng. Nó bao gồm tính chất nhóm chức phenolic và acrylic. Nó đƣợc tìm thấy trong nhiều thực vật vì nó là một trung gian quan trọng trong sự sinh tổng hợp lignin, một trong những nguồn gốc của sinh khối. Hóa sinh axit caffeic: đƣợc kiểm nghiệm nhƣ một chất có khả năng điều hòa hệ miễn dịch và khả năng ức chế chất oxi hóa gây ung thƣ. Axit Caffeic tốt hơn các chất chống oxy hóa khác, bằng chứng việc giảm sản xuất aflatoxin hơn 95 % [16]. Trong nghiên cứu tƣơng tự, khi có liều lƣợng cao chất chống oxy hóa kết hợp với axit caffeic, cho thấy sự sụt giảm đáng kể trong sự tăng trƣởng của các khối u ruột kết ở những con chuột đồng [25]. 1.6.1.2. Axit ferulic Danh pháp: 3-(4-hydroxy-3-methoxy- Hình 1.3. Axit ferulic
  12. 12 phenyl) prop-2-enoic Công thức cấu tạo: Công thức phân tử C10H10O4. Công thức cấu tạo nhƣ (Hình 1.3). Axit ferulic tinh khiết là một chất bột màu vàng. Axit Ferulic thuộc về nhóm axit hydroxycinnamic. Đặc biệt cấu trúc hóa học tƣơng tự curcumin một hợp chất chiết từ nghệ vàng có hoạt tính chống ung thƣ rất cao. Hóa sinh axit ferulic: Giống nhƣ nhiều hợp chất phenolic khác nó là một chất chống oxi hóa đã đƣợc thử nghiệm trong ống nghiệm (nghĩa rằng nó phản ứng với các gốc tự do ví dụ các gốc tự do chứa oxi (ROS). ROS và các gốc tự do liên quan đến phá hủy hay thay đổi cấu trúc DNA, ung thƣ, tăng tốc lão hóa tế bào [19]. Axit ferulic có thể có hoạt động kháng u trực tiếp chống lại ung thƣ vú và ung thƣ gan [6]. Nếu sử dụng kết hợp axit ascorbic, vitamin E và axit ferulic có thể làm giảm sự lão hóa da do căng thẳng và tái tạo da do tái tạo colagen [10]. Axit ferulic đƣợc đánh giá cao nhƣ một tiền chất sản xuất hƣơng liệu tổng hợp vanillin. 1.6.1.3. Axit protocatechuic Danh pháp: Axit 3,4-đihydroxybenzoic. Công thức cấu tạo: Axit Protocatechuic (PCA) Công thức phân tử C7H6O4 công thức cấu tạo nhƣ (Hình 1.4). Nó là một loại axit phenolic. Nó có tác dụng lên cả tế bào bình thƣờng và ung thƣ đƣợc nghiên cứu trong ống nghiệm [14]. Hình 1.4. Axit protocatechuic PCA đã đƣợc báo cáo để kích thích quá trình apoptosis của các tế bào bạch cầu của con ngƣời, cũng nhƣ HSG1 tế bào ác tính từ khoang miệng của con ngƣời [7]. Nhƣng PCA đƣợc tìm thấy có tác dụng hỗn hợp các khối u da chuột TPA gây ra [17]. Tùy thuộc vào số lƣợng PCA và thời gian trƣớc khi ứng dụng, PCA có thể làm giảm hoặc tăng cƣờng khối u phát triển [23]. PCA đã đƣợc báo cáo để tăng sự phát triển và ức chế quá trình apoptosis của tế bào thần kinh gốc. 1.6.2. Axit béo Axit béo là axit cacboxylic có mạch dài hydrocacbon (số Cacbon từ 12 đến 22) và gốc - COOH. Công thức chung là R-(CH2)n-COOH. Phản ứng với glycerol
  13. 13 để tạo thành lipid (chất béo hoà tan trong các thành phần của tế bào sống). Một số axit béo đã tìm thấy trong chi Kalanchoe là axit panmitic, axit arachidic, axit Behenic Axit Arachidic, công thức phân tử C20H40O2, công thức cấu tạo: CH3(CH2)18COOH. Nó đƣợc sử dụng nhƣ một chất bôi trơn và là một chất nhũ hóa trong các chế phẩm công nghiệp. Ngoài ra đƣợc sử dụng trong sản xuất dƣợc phẩm, xà phòng, mỹ phẩm, và đóng gói thực phẩm, đƣợc sử dụng nhƣ một chất làm mềm và phân tán. Axit Behenic công thức phân tử: C22H44O2, công thức cấu tạo: CH3(CH2)20COOH. Nó thƣờng đƣợc sử dụng làm kem dƣỡng ẩm và làm mềm tóc. Axit behenic cũng đƣợc sử dụng trong các loại dầu bôi trơn nhƣ chất hãm bốc hơi dung môi trong tẩy sơn. Amide chống bọt trong sản xuất chất tẩy rửa, đánh bóng sàn và giảm sự chảy nhão của nến. Axit Panmitic công thức phân tử C16H32O2, công thức cấu tạo: CH3(CH2)14COOH. Thƣờng sử dụng làm xà phòng, dầu nhờn, dầu thực phẩm. Nó là một chất kích thích giúp ăn ngon miệng. Trong cơ thể, axit béo bão hòa làm tăng huyết thanh lipoprotein dẫn đến cholesterol trong máu cao tuy nhiên axit béo thiết yếu đƣợc sử dụng chủ yếu để sản xuất các chất nội tiết tố, nhƣ điều chỉnh một loạt các chức năng, bao gồm áp lực máu, đông máu, nồng độ lipid máu, đáp ứng miễn dịch, và phản ứng viêm nhiễm trùng vết thƣơng. Khai thác axit béo: dựa vào tính chất không tan trong nƣớc nhƣng tan nhiều trong dung môi không phân cực nhƣ ete dầu hỏa, hexan Trong thực vật axit béo có thể tồn tại dạng tự do hoặc dạng este. Do đó ta sử dụng dung môi không phân cực chiết tách axit béo ở dạng tự do cũng nhƣ dạng este ra khỏi lá. Sau đó sử dụng kiềm (KOH) chiết lại axit, este này đi vào pha nƣớc dƣới dạng muối Kali. Sử dụng axit mạnh nhƣ H2SO4 đặc hoặc HCl đặc tách ra dƣới dạng axit tự do không tan trong nƣớc. 1.6.3. Axit hữu cơ phân cực Một số axit hữu cơ phân cực đã đƣợc tìm thấy trong lá sống đời là: Axit malic, axit citric, axit isocitric.
  14. 14 1.6.3.1. Axit malic Công thức phân tử: C4H6O5. Danh pháp: 2-hydroxibutan-1,4-dioic, công thức cấu tạo nhƣ (Hình 1.5).Có vai trò quan trọng giúp cây quang hợp trong bóng tối. Ban ngày axit này sẽ Hình 1.5. Axit malic giúp cây quang hợp trong bóng tối và giảm dần, về đêm cây sẽ tổng hợp lại axit này nên ta thƣờng thấy buổi sáng lá sẽ rất chua và về chiều khi lƣợng axit này cạn lá sẽ hết chua và có vị chát. Hóa sinh axit malic có tác dụng tăng lực, chống mệt mỏi, bảo vệ gan, thận, tim mạch. Ngoài ra còn có tác dụng tẩy mờ vết thâm trên da do ánh sáng. Trong công nghiệp thực phẩm axit malic thƣờng đƣợc dùng tạo dƣ vị chua cho thực phẩm. 1.6.3.2. Axit citric Danh pháp: axit 3-hydroxipent-1,3,5-trioic Axit citric có công thức phân tử: C6H8O7. Công thức cấu tạo nhƣ (Hình 1.6). Là một axit hữu Hình 1.6. Axit citric cơ yếu. Nó sử dụng nhƣ một chất bảo quản tự nhiên và cũng đƣợc sử dụng để bổ sung vị chua cho thực phẩm hay các loại nƣớc ngọt. Trong hóa sinh học, nó là tác nhân trung gian quan trọng trong chu trình axit citric và vì thế nó xuất hiện trong trao đổi chất của gần nhƣ mọi sinh vật. Nó cũng đƣợc coi là tác nhân làm sạch về mặt môi trƣờng và đóng vai trò của chất chống oxi hóa. Làm mềm nƣớc: Khả năng của axit citric trong chelat các kim loại làm cho nó trở thành hữu ích trong xà phòng và các loại bột giặt. Bằng sự chelat hóa các kim loại trong nƣớc cứng, nó làm cho các chất tẩy rửa này tạo bọt và làm việc tốt hơn mà không cần phải làm mềm nƣớc. Theo kiểu tƣơng tự, axit citric đƣợc dùng để tái sinh các vật liệu trao đổi ion dùng trong các chất làm mềm nƣớc bởi nó kết tủa các ion kim loại đã tích lũy nhƣ là các phức chất citrat. Công dụng khác: Axit citric đƣợc sử dụng trong công nghệ sinh học và công nghiệp dƣợc phẩm để thụ động hóa các hệ thống ống dẫn cần độ tinh khiết cao (thay cho việc sử dụng axit nitric). Axit nitric bị coi là nguy hiểm và khó xử lý khi sử dụng cho mục đích này, trong khi axit citric thì không.
  15. 15 Axit citric là thành phần hoạt hóa trong một số dung dịch tẩy rửa vệ sinh nhà bếp và phòng tắm. Dung dịch với hàm lƣợng 6% axit citric sẽ loại bỏ các vết bẩn do nƣớc cứng từ thủy tinh mà không cần phải lau chùi. Trong công nghiệp nó đƣợc dùng để đánh tan lớp gỉ trên bề mặt thép. Axit citric đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ là chất đệm để làm tăng độ hòa tan của heroin nâu. Các túi nhỏ chứa axit citric sử dụng một lần cũng đƣợc sử dụng nhƣ là tác nhân xui khiến để buộc những ngƣời dùng heroin phải đổi các kim bẩn của mình lấy các kim tiêm sạch nhằm làm giảm khả năng lan truyền AIDS và bệnh viêm gan. Các chất axit hóa khác sử dụng cho heroin nâu là axit ascorbic, axit axetic và axit lactic; khi không có chúng, những ngƣời sử dụng ma túy thƣờng thay thế chúng bằng nƣớc chanh hay dấm. Axit citric là một trong các hóa chất cần thiết để tổng hợp HMTD, một chất nổ nhạy nhiệt, nhạy ma sát và nhạy va chạm tƣơng tự nhƣ axeton peroxit. Axit citric cũng dùng nhiều trong sản xuất rƣợu vang nhƣ là chất thay thế hay bổ sung khi các loại quả chứa ít hay không có độ chua tự nhiên đƣợc sử dụng. Nó chủ yếu đƣợc sử dụng cho các loại rƣợu vang rẻ tiền do giá thành thấp của sản xuất. Khi sử dụng với tóc, axit citric mở lớp ngoài cùng (còn gọi là lớp cutin) ra. Khi lớp cutin mở ra, nó cho phép có sự thâm nhập vào sâu hơn của các chất vào chân tóc. Nó có thể đƣợc sử dụng trong một số loại dầu gội đầu để rửa sạch các chất sáp và thuốc nhuộm từ tóc. Axit citric cũng đƣợc sử dụng nhƣ là nƣớc rửa lần hai (sau nƣớc hiện hình) trong xử lý phim chụp ảnh trƣớc khi dùng nƣớc định hình. Nƣớc rửa đầu tiên thƣờng hơi kiềm nên nƣớc rửa có tính axit nhẹ sẽ trung hòa nó, làm tăng hiệu quả của việc rửa ảnh so với dùng nƣớc thƣờng. Axit citric cũng đƣợc dùng nhƣ là một trong các thành phần hoạt hóa trong sản xuất các mô kháng virus. Axit citric cũng đƣợc sử dụng nhƣ là tác nhân làm chín chính trong các công đoạn đầu tiên trong sản xuất phó mát mozzarella. Vài lƣu ý khi sử dụng: Axit citric đƣợc hầu hết các quốc gia và tổ chức quốc tế công nhận là an toàn để sử dụng trong thực phẩm. Tuy nhiên, việc tiếp xúc với
  16. 16 axit citric khô hay đậm đặc có thể gây ra kích ứng da và mắt, vì thế bảo hộ lao động nên đƣợc sử dụng khi tiếp xúc với axit citric. Việc sử dụng quá nhiều axit citric cũng dễ làm tổn hại men răng. Tiếp xúc gần với mắt có thể gây bỏng và làm mất thị giác. Đôi khi hàm lƣợng quá cao axit citric có thể gây tổn hại cho tóc, do nó mở lớp cutin của tóc. Nó có thể làm mất các chất cần thiết cho tóc và làm tóc bị bạc màu.[26]
  17. 17 Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Lá sống đời đƣợc hái tại xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng. Tên khoa học: Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers. 1805 (CCVN, 1:967) [2] Thuộc họ thuốc bỏng: Crassulaceae. Chi: Kalanchoe. Hình 2.1. Cây sống đời 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phân tích trọng lƣợng Phƣơng pháp phân tích trọng lƣợng là phƣơng pháp phân tích định lƣợng dựa vào kết quả cân khối lƣợng của sản phẩm hình thành sau phản ứng kết tủa bằng phƣơng pháp hoá học hay bằng phƣơng pháp vật lý. Do chất phân tích chiếm một tỷ lệ xác định trong sản phẩm đem cân nên dựa vào khối lƣợng của sản phẩm đem cân dễ dàng suy ra lƣợng chất phân tích trong đối tƣợng phân tích.[1] Quá trình phân tích một chất theo phƣơng pháp trọng lƣợng: - Chọn mẫu và gia công mẫu - Tách trực tiếp chất cần xác định hoặc các thành phần của nó khỏi sản phẩm phân tích dƣới trạng thái tinh khiết hoá học. Tuy nhiên trong nhiều trƣờng hợp việc làm này rất khó khăn, nhiều khi không thực hiện đƣợc, do đó chất cần xác định thƣờng đƣợc tách ra thành kết tủa dƣới dạng hợp chất có thành phần xác định. Để làm đƣợc điều đó ta thực hiện nhƣ sau: đƣa mẫu vào dung dịch (phá mẫu) và tìm cách tách chất nghiên cứu khỏi dung dịch (làm phản ứng kết tủa hay điện phân). - Xử lý sản phẩm đã tách bằng các biện pháp thích hợp (rửa, nung, sấy ) rồi đem cân để tính kết quả. Áp dụng phƣơng pháp trọng lƣợng để xác định các yếu tố sau: 2.2.1.1. Xác định độ ẩm của nguyên liệu Dựa trên nguyên tắc sấy đến khối lƣợng không đổi. Độ ẩm % ( ) của nguyên liệu ẩm: m m  0 1 .100 m0
  18. 18 Trong đó, m0 : khối lƣợng tƣơi trƣớc khi sấy m1 : khối lƣợng lá sau khi sấy 2.2.1.2. Xác định hàm lượng tro của nguyên liệu Dựa trên nguyên tắc tro hoá hoàn toàn mẫu bằng cách nung trong lò nung ở khoảng 8000C. mm % Tro = 01 m0 Trong đó: m0 : khối lƣợng lá khô trƣớc khi tro hoá (g) m1 : khối lƣợng tro (g) 2.2.1.3. Xác định khối lượng các axit béo Dựa trên cơ sở các axit béo không tan trong nƣớc nên sẽ bị tách ra khỏi dung môi là nƣớc và ta đem cân lƣợng axit béo đó. 2.2.2. Phƣơng pháp chiết tách 2.2.2.1. Chiết đơn giản một lần Chiết đơn giản một lần nhiệt độ thƣờng hay còn gọi chƣng ninh, ngâm kiệt. Khi sử dụng nhiệt độ cao ta đun nóng hợp chất với dung môi trong bình cầu có sinh hàn hồi lƣu, lọc nóng hoặc để lắng cho trong rồi chắt. Khi thao tác với những lƣợng chất nhỏ, ta dùng ống nghiệm có lắp sinh hàn ngón tay hoặc lắp ống sinh hàn không khí.[3] Trong đề tài này phƣơng pháp chƣng ninh đƣợc sử dụng đối với lá sống đời tƣơi trong dung môi nƣớc. Phƣơng pháp ngâm kiệt: đối với lá sống đời khô trong dung môi ete. 2.2.2.2. Chiết đơn giản, nhiều lần Chiết nhiều lần có ƣu điểm chiết kiệt hơn 1 lần. Trong trƣờng hợp này ta thƣờng sử dụng ống Soxhlet. Nó bao gồm một bình cầu, một thiết bị chiết và một ống sinh hàn hồi lƣu. Dung môi ở trong bình cầu đƣợc làm bốc hơi từng phần, dung môi đƣợc ngƣng tụ nhỏ vào chất đƣợc chiết đựng trong một cái túi bằng giấy lọc và sau đó lại chảy vào bình. Trong quá trình đó cấu tử cần đƣợc tách đƣợc làm giàu thêm trong dung môi ở bình cầu. Hình 2.2. Soxhlet
  19. 19 Trong luận văn này phƣơng pháp chiết Soxhlet đƣợc sử dụng đối với lá sống đời khô dung môi CHCl3 và lá sống đời tƣơi dung môi C2H5OH. 2.2.3. Phƣơng pháp chuẩn độ axit – bazơ Nguyên tắc: Xác định hàm lƣợng axit tổng số trong lá sống đời theo tiêu chuẩn TCVN 4589-88 [1]. Nhỏ dung dịch NaOH 0,1N từ buret xuống dung dịch cần xác định đã tẩy màu và một ít phenolphtalein cho đến khi dịch thử có màu hồng nhạt bền vững. 2.2.4. Phƣơng pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS)  Định nghĩa Cơ sở để tách sắc kí khí là sự phân bố của mẫu thử giữa hai pha. Một pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc lớn và pha động là khí thấm qua bề mặt pha tĩnh đó. Nếu pha tĩnh là rắn gọi là sắc kí khí rắn (gas solid chromatography – GSC), quá trình này chủ yếu là hấp phụ. Nếu pha tĩnh là lỏng có sắc kí khí – lỏng (gas liquid chromatography – GLC), chất lỏng bọc quanh một chất rắn trơ gọi là chất mang tạo nên một lớp phim mỏng. Cơ sở cho sự tách ở đây chính là phân bố của mẫu trong và ngoài lớp phim mỏng.[4]  Ứng dụng - Áp dụng đối với các mẫu bốc hơi và ổn định nhiệt đến vài trăm °C. Không biến đổi cấu trúc khi nhiệt lên đến dƣới 3000C; - Có khả năng phát hiện và phân tích rất nhiều chất và hỗn hợp; - Đƣợc ứng dụng rộng rãi để tách và xác định các cấu tử trong các mẫu từ nhiều chủng loại khác nhau.  Chu trình hoạt động Mẫu (sample) phân tích đƣợc chạy theo chu trình Hình 2.3 - Đƣa vào bộ phận nạp mẫu (heated injector) - Di chuyển qua một cột phân tách (seperating column) nhờ một dòng khí mang trơ (inert carrier gas) - Phát hiện và ghi lại dƣới dạng các peaks khi các cấu tử đi ra khỏi cột.
  20. 20 Hình 2.3. Cấu trúc khối một máy sắc kí khí * Hệ thống tiêm mẫu Có hai chế độ nạp mẫu : - Không chia dòng (split): Cách thông dụng nhất là sử dụng một tiêm mẫu vi lƣợng (microsyringe) thƣờng dùng cột nhồi. - Chia dòng (splitless): Cột mao quản đòi hỏi một lƣợng mẫu nhỏ hơn tiêm vào cột nên trong trƣờng hợp này sử dụng hệ thống chia dòng mẫu. * Cột sắc kí Có nhiều cột tách khác nhau thỏa mãn mục đích nghiên cứu khác nhau - Cột nhồi (packed column): Chất hấp phụ nhồi vào cột. Sử dụng cho lƣợng mẫu lớn. Cột nhồi chứa các hạt chất mang rắn phủ một lớp pha tĩnh lỏng hoặc bản thân hạt rắn là pha tĩnh. Trong cột nhồi kích thƣớc hạt đồng nhất sẽ làm giảm chiều cao cột và tăng độ phân giải. Kích thƣớc hạt nhỏ cải thiện hiệu quả cột. - Cột mao quản (open-tubular): Pha tĩnh phủ vào mặt trong cột. Sử dụng dung lƣợng thấp mẫu. Cột mao quản có độ phân giải cao hơn, thời gian ngắn hơn độ nhạy cao hơn cột nhồi. Tuy nhiên cột mao quản nạp mẫu khó khăn. * Detector khối phổ (MS) Máy khối phổ là một detector vạn năng cho phân tích định tính, định lƣợng cho các chất sắc kí khí lẫn sắc kí lỏng. Chất nghiên cứu đƣợc ion hoá trong pha khí
  21. 21 ngƣng tụ dƣới chân không bằng những phƣơng pháp thích hợp thành những ion (ion phân tử, ion mảnh ) có số khối khác nhau, sau đó những ion này đƣợc phân tách thành những dãy ion theo cùng số khối m (chính xác là theo cùng tỷ số khối trên điện tích ion, m/e) và xác suất có mặt của mỗi dãy ion có cùng tỉ số m/e đƣợc ghi lại trên đồ thị có trục tung là xác suất có mặt (hay cƣờng độ), trục hoành là tỉ số m/e gọi là khối phổ đồ. Phổ khối lƣợng đƣợc ghi lại dƣới dạng phổ vạch hay bảng, trong đó cƣờng độ các vạch đƣợc đo bằng phần trăm so với đỉnh có cƣờng độ cao nhất. Đỉnh ion phân tử thƣờng là đỉnh cao nhất, tƣơng đƣơng với khối lƣợng phân tử của hợp chất khảo sát.[3]
  22. 22 Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 3.1.1. Xử lý nguyên liệu, xác định tổng axit trong lá sống đời tƣơi, khô bằng phƣơng pháp chuẩn độ và cân Lá sống đời tƣơi Xử lí nguyên liệu Xác định Xác định độ ẩm lƣợng tro Soxhlet Chƣng ninh, C2H5OH, 8giờ H2O, 8 giờ Bã Dịch Bã Dịch + KOH 0,1N, Đuổi + KOH 0,1N, Tẩy màu dung môi đun 2 giờ, đun 2 giờ, bằng than ngâm 1 ngày ngâm 1 ngày hoạt tính Tẩy màu Lọc lấy dịch Lọc lấy dịch bằng than Chuẩn độ bằng NaOH hoạt tính 0,01N Axit hóa Axit hóa HCl đặc HCl đặc Chuẩn độ Xác định bằng NaOH Lọc, sấy, cân Lọc, sấy, cân 0,01N axit phân cực Xác định Xác định Xác định axit béo axit phân axit béo cực
  23. 23 ôhk áL Ngâm kiệt, ete dầu Soxhlet bằng hỏa, 10 ngày đêm, CHCl 8 giờ. nhiệt độ phòng 3, Bã Dịch Chiết kiệt bằng KOH 0,5N Soxhlet Chiết kiệt C2H5OH, 8 bằng Axit hóa bằng HCl đặc giờ KOH 0,5N Lắc kĩ với CHCl nhằm Dịch Axit hóa 3 HCl đặc chuyển RCOOH vào CHCl3 Đuổi hết dung môi CHCl3. Đuổi dung môi Hòa cặn vào H2O cất Lọc, sấy, cân Tẩy màu Lọc, sấy, cân Chuẩn độ phần không tan phần dịch Xác định Chuẩn độ axit béo bằng NaOH 0,01N Xác định Xác định axit axit béo phân cực Xác định axit phân cực
  24. 24 3.1.2. Định danh và thành phần axit trong dịch chiết lá sống đời bằng phổ GC- MS Lá tƣơi Chiết kiệt 100ml Soxhlet với C2H5OH KOH 0,1N, 2h. 96o trong 8h. Dịch muối Dịch màu xanh RCOOK Axit hóa bằng Kiềm hóa bằng HCl đậm đặc, dƣ KOH 0,1N Chiết kiệt bằng Đuổi dung môi, thu cắn etyl axetat Axit hóa bằng HCl Chạy phổ đậm đặc dƣ GC-MS- Mẫu 1 Chiết kiệt bằng etyl axetat Chạy phổ GC-MS- Mẫu 2 3.1.3. Thử hoạt tính sinh học dịch chiết H2O Dịch chiết chƣng ninh với H2O Kháng vi khuẩn, Chống oxi hóa kháng nấm Peroxydaza
  25. 25 3.2. TIẾN HÀNH THỰC NGHIỆM 3.2.1. Thu nguyên liệu Cây đƣợc lấy tại xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng. Cách lấy lá: chọn lá còn nguyên không bị dập, rách. Lá còn mọng nƣớc, lá màu xanh thẫm, mép và cuống lá màu tím. Hái lá vào buổi sáng sớm. Bảo quản: Lá đựng trong thùng giấy, không ẩm ƣớt và khi chuyên chở tránh va đập mạnh làm dập lá. 3.2.2. Xử lí nguyên liệu Lá tƣơi: Nguyên liệu đƣợc chuẩn bị trƣớc mỗi lần chiết. Thu hái lá vào buổi sáng sớm, lá tƣơi, màu xanh thẫm, bỏ lá vàng úa và chọn những lá có kích cỡ và màu sắc gần nhƣ nhau. Loại bỏ sơ bộ những tạp chất bằng cách cho lá Hình 3.1. Lá sống đời tươi, cắt nhỏ vào một chậu rửa lớn và cho nƣớc vào ngập lá. Dùng tay vuốt trên từng mặt lá, rửa lại 3 lần rồi vớt lá ra rổ có lỗ to để rút hết nƣớc. Lá tƣơi sau khi rửa sạch thì đƣợc cắt nhỏ dọc theo sống lá tạo mẫu hình sợi để khi chiết dịch ra triệt để hơn. Lá khô: Nguyên liệu ban đầu là lá tƣơi đã rửa sạch. Sấy khô trong 800C ở 10 phút để loại men, sau đó sấy ở 600C cho đến khô. Làm nguội trong bình hút ẩm. Bảo quản trong hộp nhựa cho những lần chiết sau. Hình 3.2. Bột lá sống đời sấy khô, xay nhỏ 3.2.3. Xác định một số đại lƣợng vật lí 3.2.3.1. Xác định độ ẩm Dụng cụ, thiết bị: Cốc thủy tinh để đựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích. Cách tiến hành: Để xác định độ ẩm trong lá sống đời thì sau khi thu hái về ngoài việc loại bỏ những lá bị hƣ tổn, ta chỉ chọn những lá già vừa phải, không quá non, có màu xanh thẫm.
  26. 26 Sau khi chọn đƣợc lá tiến hành làm sạch và làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Cân khoảng 10g lá sống đời tƣơi cho vào cốc sứ đã đƣợc sấy khô và biết khối lƣợng chính xác. Cho cốc thuỷ tinh có chứa lá vào tủ sấy và sấy ở 100oC. Sau khi sấy khoảng 3 giờ, ta lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc thuỷ tinh nguội hẳn thì tiến hành cân tính khối lƣợng trên cân phân tích. Sau đó, cứ khoảng 30 phút ta lại tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi. Độ ẩm của lá tƣơi đƣợc tính theo công thức ở mục 2.2.1.1. 3.2.3.2. Xác định hàm lượng tro trong lá sống đời Dụng cụ, thiết bị: Cốc sứ đựng mẫu, lò nung, bình hút ẩm, cân phân tích. Cách tiến hành: Cân khoảng 5g lá đã đƣợc sấy khô cho vào cốc sứ đã sấy khô và biết chính xác khối lƣợng. Cho cốc sứ có chứa lá vào lò nung và tăng dần nhiệt độ, nhiệt độ nung sau cùng ở 800oC. Sau thời gian tro hóa khoảng 6 giờ, ta thấy lá đã đƣợc tro hoá gần nhƣ hoàn toàn. Lúc này tro có dạng bột mịn, màu trắng. Dùng kẹp dài lấy cốc sứ ra khỏi lò nung và cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và tính khối lƣợng. Sau cân 30 phút ta tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi hoặc sai số 0,001g thì dừng quá trình tro hoá. Hàm lƣợng tro trong lá khô đƣợc tính theo công thức ở mục 2.2.1.2. 3.2.4. Xác định tổng lƣợng axit hữu cơ Lá tƣơi: Để tăng diện tích tiếp xúc của lá với dung môi cho quá trình chiết tách đạt hiệu suất cao, lá đƣợc rửa sạch, để ráo tự nhiên, cắt khúc, chẻ nhỏ dọc theo sống lá tạo mẫu hình sợi. Vì lá tƣơi rất mọng nƣớc nên sau khi cắt sợi ta giã dập bằng chày sứ. Làm nhƣ vậy thì chiết đƣợc hầu hết các chất trong lá. Lá khô: Lá tƣơi sau khi tuyển chọn, làm sạch, sấy trong tủ sấy ở nhiệt 80 0C trong vòng 10 phút để khử hết men, sau đó sấy ở 600C trong vòng khoảng 72 giờ cho đến khi lá khô, giòn tan. Làm nguội trong bình hút ẩm, bảo quản trong bình khô, kín gió.
  27. 27 3.2.4.1. Chiết Soxhlet trong dung môi C2H5OH Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá tƣơi đã rửa sạch để ráo nƣớc tự nhiên, lá đƣợc cắt sợi, gói vào giấy lọc, cho vào phần thân Soxhlet. Cho 200ml C2H5OH vào bình cầu, lắp sinh hàn cẩn thận, chiết trong 8 giờ, bằng bếp điện. Thu đƣợc dịch màu xanh đậm và bã màu trắng (Hình 3.3) Dịch chiết đƣợc cô cạn bay bớt dung môi, sau đó thêm H2O cất cho đạt thể tích khoảng 150ml và khoảng 4g bột mịn than hoạt tính đã hoạt hóa ở 500C trong 6 giờ. Ngâm hỗn hợp trên trong nƣớc ấm khoảng 30 phút, sau đó lọc bằng giấy lọc Whatman No1, than hoạt tính đƣợc rửa lại 2 lần bằng nƣớc cất để thu hồi hết axit. Kết quả dịch chiết sau khi xử lý bằng than hoạt tính bị mất màu hoàn toàn (Hình 3.4). Dịch chiết đƣợc trộn chung và định mức thể tích xác định 200ml. Chuẩn độ dịch trên với NaOH 0,01N để xác định axit phân cực. Bã sau khi chiết với cồn, ngâm trong 50ml dung dịch KOH 0,1N khuấy đều, đun trong 2 giờ rồi ngâm trong 1 ngày đêm. Lọc bỏ bã bằng giấy lọc, cô cạn còn khoảng 20ml, để nguội. Axit hóa bằng HCl đậm đặc đến dƣ. Làm lạnh, để qua đêm, lọc trên phễu buchner sử dụng giấy lọc Whatman No1, rửa kết tủa bằng nƣớc lạnh, làm khô, cân xác định đƣợc khối lƣợng axit béo. Hình 3.3. Bã rắn, dịch trước tẩy màu Hình 3.4. Dịch chiết sau khi tẩy màu
  28. 28 3.2.4.2 . Chưng ninh trong H2O Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá tƣơi đã rửa sạch để ráo tự nhiên, lá đƣợc cắt sợi dọc theo sống lá, giã dập cho vào bình cầu thủy tinh 500ml đã rửa sạch, sấy khô. Thêm 200ml H2O cất, lắp sinh hàn hồi lƣu, chƣng ninh trong 8 giờ ở nhiệt độ 900C bằng bếp điện, lọc thu lấy dịch chiết. Ta đƣợc dịch màu vàng nâu (Hình 3.5) và bã. Dịch chiết thêm khoảng 4g than hoạt tính đã hoạt hóa. Ngâm hỗn hợp trên trong nƣớc ấm khoảng 30 phút, sau đó lọc bằng giấy lọc Whatman No1, than hoạt tính đƣợc rửa lại 02 lần để thu hồi hết axit. Kết quả dịch chiết sau khi xử lý bằng than hoạt tính bị mất màu hoàn toàn. Dịch chiết đƣợc trộn chung và định mức thể tích xác định 200ml. Chuẩn độ dịch trên với NaOH 0,01N nhằm xác định axit phân cực mạnh (Hình 3.6). Bã đƣợc ngâm trong 50ml dung dịch KOH 0,1N khuấy đều, đun trong 2 giờ, nhiệt khoảng 600C rồi ngâm trong 1 ngày đêm. Sau đó lọc bằng giấy lọc. Cô cạn còn khoảng 30ml, để nguội, thêm HCl đặc đến dƣ vào. Làm lạnh, để qua đêm, lọc trên phễu buchne sử dụng giấy lọc Whatman No1, rửa kết tủa bằng nƣớc lạnh, làm khô, cân xác định đƣợc khối lƣợng axit béo. Hình 3.5. Dịch sau chưng ninh Hình 3.6. Dịch axit chuẩn độ bằng NaOH
  29. 29 3.2.4.3. Ngâm kiệt trong ete dầu hỏa Cân bằng cân phân tích khoảng 10g lá khô dạng bột mịn, cho vào cốc thủy tinh nút nhám 250ml. Đong chính xác 100ml ete dầu hỏa, khuấy đều, ngâm trong 7 ngày đêm. Đậy nút nhám cẩn thận vì ete dễ bay hơi. Sau 7 ngày lọc lấy dịch ete, thêm tiếp 30ml ete dầu hỏa vào ngâm lần 2 trong 3 ngày đêm thu lấy dịch, rửa lại bã bằng ete. Sau đó gộp chung dịch 3 lần chiết, bã để khô tự nhiên. Thu dịch chiết có màu nâu, chuyển toàn bộ dịch chiết vào bình tam giác có nút nhám, thêm vào đấy 50ml dung dịch KOH 0,5N, lắc kĩ nhiều lần (cẩn thận nút nhám bật ra khi lắc) chuyển toàn bộ vào phễu chiết, để qua 2 ngày đêm. Sau đó chiết lấy phân đoạn trong KOH, phân đoạn ete tiếp tục thêm KOH tiến hành chiết nhƣ cũ để chiết kiệt axit trong ete thành muối RCOOK trong pha nƣớc (Hình 3.7). Gộp hai lần dịch chiết lại cô cạn còn khoảng 40ml, thêm đến dƣ HCl đặc vào khuấy đều, cọ đũa thủy tinh vào thành cốc tạo muồi kết tủa, dùng đá làm lạnh vì độ tan axit béo trong nƣớc lạnh ít hơn nƣớc nóng, để qua đêm (Hình 3.8). Ngày hôm sau lọc kết tủa trên phễu buchne bằng giấy lọc Whatman No1, rửa kết tủa bằng nƣớc lạnh. Làm khô cả giấy lọc và mẫu sau đó cân, trừ đi khối lƣợng giấy ban đầu ta xác định đƣợc khối lƣợng axit béo trong mẫu. Hình 3.7. Chiết dịch ngâm với KOH Hình 3.8. Axit hóa bằng HCl đặc
  30. 30 Bã rắn để khô tự nhiên sau đó chiết Soxhlet bằng 150ml dung môi C2H5OH trong 8 giờ. Dịch chiết đƣợc cô cạn bay bớt dung môi, sau đó thêm H2O cất cho đạt thể tích 50ml và khoảng 4g than hoạt tính đã hoạt hóa. Ngâm hỗn hợp trên trong nƣớc ấm khoảng 30 phút. Dịch chiết sau tẩy màu đƣợc định mức thể tích xác định 200ml sau đó chuẩn độ dịch trên với NaOH 0,01N để xác định lƣợng axit phân cực mạnh. 3.2.4.4. Chiết Soxhlet trong dung môi CHCl3 Cân bằng cân phân tích khoảng 10g mẫu lá khô dạng bột mịn, chiết với 150ml 0 CHCl3 tiến hành chiết ở nhiệt độ 80 C trong vòng 8 giờ bằng bếp điện. Thu dịch chiết có màu vàng nâu, chiết kiệt dịch bằng KOH 0,1N nhằm chuyển tất cả axit trong clorofom thành muối kali trong nƣớc. Chiết nhiều lần, lắc kĩ, nhẹ nhàng tránh tạo bọt, để qua đêm rồi lấy phân đoạn trong nƣớc (Hình 3.9). Axit hóa dịch muối kali bằng HCl đặc nhằm chuyển axit dạng muối thành dạng axit tự do. Lắc dịch sau axit hóa với CHCl3 nhằm chuyển axit dạng tự do vào CHCl3. Đuổi dung môi thu cắn. Hòa cắn vào nƣớc cất thu rắn và dịch. Lọc rắn rửa sấy cân xác định axit béo không tan trong nƣớc (Hình 3.10). Dịch nƣớc định mức, chuẩn độ xác định axit phân cực mạnh. Hình 3.9. Dịch CHCl3 được chiết KOH Hình 3.10. Kết tủa axit béo 3.2.5. Định danh xác định thành phần axit dựa vào phổ GC-MS
  31. 31 Tiến hành chiết 2 mẫu, một mẫu lá tƣơi trong dung dịch KOH và lá tƣơi trong ancol etylic. Sử dụng phổ GC-MS định danh những axit phân cực yếu có mặt trong các dịch chiết. 3.2.5.1. Chưng ninh trong KOH Cân trên cân phân tích khoảng 50g mẫu lá tƣơi đã rửa sạch để ráo tự nhiên, lá đƣợc cắt sợi dọc theo sống lá, giã nhỏ cho vào bình cầu thủy tinh 500ml đã rửa sạch, sấy khô. Thêm 200ml KOH 0,1N, lắp sinh hàn hồi lƣu, chƣng ninh trong 2 giờ bằng bếp điện, lọc thu lấy dịch chiết. Ta đƣợc dịch màu xanh đậm. Axit hóa dịch này bằng HCl đậm đặc. Chiết lại bằng etyl axetat thu mẫu 1 (Hình 3.11). Chạy phổ GC-MS dịch này. 3.2.5.2. Chiết bằng C2H5OH Cân trên cân phân tích khoảng 50g mẫu lá tƣơi đã chuẩn bị đƣợc chiết với 250ml C2H5OH vào bình cầu, lắp sinh hàn cẩn thận, chiết trong 8 giờ, bằng bếp điện. Thu đƣợc dịch màu xanh đậm và bã màu trắng. Dịch chiết đƣợc kiềm hóa bằng KOH, sau đó cô cạn đuổi dung môi thu cắn. Hòa tan cắn trên bằng HCl đậm đặc đến dƣ. Chiết lại với etyl axetat thu mẫu 2 (Hình 3.12). Chạy phổ GC-MS dịch này. Hình 3.11. Mẫu 1 Hình 3.12. Mẫu 2 3.2.6. Thử hoạt tính sinh học dịch chiết H2O Chƣng ninh lá tƣơi trong nƣớc, tẩy màu, định mức, chuẩn độ đƣợc nồng độ axit 0,1N. Tiến hành thử hoạt tính sinh học của dịch chiết axit trong lá cây sống đời
  32. 32 bao gồm hoạt tính kháng sinh vật kiểm định và hoạt tính chống oxy hoá peroxydaza tại phòng thử hoạt tính sinh học - Viện hóa học. 3.2.6.1. Thử hoạt tính kháng sinh vật kiểm định Những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở ngƣời do ATCC cung cấp gồm: - Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+) thƣờng không gây bệnh. - Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thƣơng, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng. - Escherichia coli: gram (-), gây một số bệnh về đƣờng tiêu hoá nhƣ viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn. - Pseudomonas aeruginosa: gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đƣờng tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột. - Candida albicans: nấm men, thƣờng gây bệnh tƣa lƣỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa. - Lactobacillus fermentum: gram (+), là loại vi khuẩn đƣờng ruột lên men có ích, thƣờng có mặt trong hệ tiêu hoá của ngƣời và động vật. Tiến hành nuôi cấy trong các môi trường: MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth), TSA ( Tryptic Soy Agar ) cho vi khuẩn; SAB, SA cho nấm. Phương pháp thử: phƣơng pháp pha loãng đa nồng độ. Đây là phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua giá trị thể hiện hoạt tính là IC50 (nồng độ ức chế 50%) - Mẫu ban đầu đƣợc pha loãng trong DMSO và nƣớc cất vô trùng thành một dãy 05 nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất là 128 g/ml, tiếp theo là 32 g/ml, 8g/ml, 2g/ml, 0,5g/ml. - Chuẩn bị dung dịch thử vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 5.105CFU/ml - Lấy 10  l dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã đƣợc pha loãng, thêm 200 l dung dịch vi khuẩn và nấm, ủ ở 37oC. Sau 24h, đọc giá trị MIC bằng mắt
  33. 33 thƣờng. Giá trị MIC đƣợc xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 đƣợc tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data. 3.2.6.2. Thử khả năng chống oxi hóa Phƣơng pháp thử với enzym peroxydaza máu ngƣời (Aleccenco)  Nguyên liệu + Máu tƣơi đƣợc chống đông bằng ADC (Citrate dextrose adenine), pha loãng 10-20 lần bằng nƣớc cất. Chia thành các ống nhỏ 0,5-1ml. Dùng cho thí nghiệm cất trong tủ lạnh -80oC. Khi dùng pha loãng thêm 25- 50 lần bằng đệm phản ứng. + H2O2 0,2N hay 2% + Indigo: chuẩn bị dung dịch stock-80oC: 0,1N. Pha loãng 100 lần đƣợc dung dịch phản ứng 0,001N.  Chất thử + Pha loãng bằng DMSO: dịch gốc 20mg/ml, tiếp theo pha loãng 1:4 tạo thành 1 dãy 5 nồng độ. + Pha loãng bằng đệm: tạo một dãy 5 nồng độ mới từ dãy nồng độ trên bằng cách pha loãng 7,8 lần với đệm.  Phản ứng + 50 l đệm axetat natri pH 4,7 0,1N + 10l chất thử pha trong DMSO và đệm phản ứng. + 60 l enzyme pha loãng 500 lần + 60 l H2O2 0,2N hay 2% + 20 l Indigocarmin 0,001N + 50 l TCA 20% + Giếng điều khiển âm không có enzim, không có chất thử, giếng điều khiển dƣơng enzim hoạt động 100%, không có chất thử. + Để thời gian phản ứng t0 phòng 20 -25 phút, dừng phản ứng bằng TCA. Đọc kết quả ở bƣớc sóng 610nm.
  34. 34 3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.3.1. Khảo sát các đại lƣợng vật lý 3.3.1.1. Độ ẩm Dựa vào phƣơng pháp trọng lƣợng xác định độ ẩm của lá cây sống đời, kết quả trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm trong lá sống đời Stt Độ ẩm m0 (g) m1 (g) mẫu (%) 1 9,764 0,757 92,25 2 9,971 0,767 92,31 3 10,016 0,814 91,87 4 10,272 0,849 91,73 5 10,332 0,688 93,34 Trong đó: m0 : khối lƣợng lá tƣơi trƣớc khi sấy m1 : khối lƣợng lá sau khi sấy Nhận xét: Độ ẩm trung bình trong lá là: 92,3% 3.3.1.1. Hàm lượng tro Bảng 3.2. Kết quả xác định tỉ lệ tro trong lá sống đời sấy khô Khối lƣợng mẫu Khối Khối lƣợng Hàm Khối Khối Stt sấy khô + cốc lƣợng mẫu + cốc lƣợng lƣợng lƣợng mẫu trƣớc khi tro hóa mẫu sau khi tro tro cốc (g) tro (g) (g) (g) hóa (g) (%) 1 28,313 33,625 5,312 28,362 0,049 0,92 2 28,549 33,914 5,365 28,596 0,047 0,89 3 29,541 35,532 5,991 29,596 0,055 0,91 4 30,041 35,868 5,827 30,118 0,077 1,33 5 32,132 37,516 5,384 32,200 0,068 1,27
  35. 35 * Nhận xét: Hàm lƣợng tro trung bình trong lá là 1,06 %. 3.3.2. Kết quả xác định tổng lƣợng axit trong lá sống đời tƣơi và khô bằng phƣơng pháp chuẩn độ và cân Sau khi chiết 4 mẫu theo sơ đồ 3.1.1. Ta thu kết quả nhƣ trong bảng 3.3 Bảng 3.3. Tổng lượng axit trong lá sống đời tươi và khô Khối V dịch Vdịch V NaOH V NaOH Mẫu, Khối lƣợng lƣợng thu chuẩn 0,01N 0,01N dung axit béo mẫu đƣợc độ chuẩn độ TB môi (g) (g) (ml) (ml) (ml) (ml) Lá 5 14,5 tƣơi, 20,251 200 5 14,1 14,4 0,2 cồn 5 14,6 Lá 5 7,5 tƣơi, 20,212 200 5 7,1 7,3 0,3 nƣớc 5 7,4 Lá 5 1,4 khô, 10,152 200 5 1,8 1,5 0,7 ete 5 1,3 Lá 5 4,5 khô, 10,312 200 5 4,5 4,5 1,3 CHCl3 5 4,4 Tổng lƣợng axit thu bằng 4 phƣơng pháp chiết khác nhau đƣợc so sánh trong Hình 3.13. * Nhận xét - Đối với lá tƣơi chiết trong C2H5OH thu nhiều axit phân cực hơn là H2O. Nguyên nhân có thể do C2H5OH là dung môi hữu cơ nên chiết đƣợc nhiều hợp chất hữu cơ hơn so H2O. - Đối với lá khô thì dung môi CHCl3 tốt hơn ete dầu hỏa có thể giải thích phƣơng pháp chiết Soxhlet thu đƣợc nhiều chất hữu cơ hơn ngâm kiệt.
  36. 36 - Nguyên liệu khô lƣợng axit thu ít hơn nguyên liệu tƣơi vì theo quan sát của tác giả khi tiến hành sấy khô nguyên liệu một lƣợng lớn axit đã thất thoát. 16 1.4 14 1.2 12 1 10 0.8 Thể tích NaOH (ml) 8 0.6 Khối lượng Acid béo (g) 6 0.4 4 2 0.2 0 0 tươi/cồn tươi/nước khô/ete khô/CHCl3 Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tổng lượng axit vào dung môi. 3.3.3. Kết quả xác định axit trong dịch chiết lá tƣơi bằng sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS 3.3.3.1. Kết quả phổ GC-MS dịch chiết chưng ninh KOH Kết quả định danh thành phần axit trong lá cây sống đời bằng phƣơng pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS) thể hiện ở hình 3.14, bảng 3.4. Một số este đƣợc xác định bằng phổ GC-MS ở hình 3.15 và 3.16. * Nhận xét Từ kết quả ở hình 3.14 và bảng 3.4, ta định danh đƣợc 26 cấu tử. Trong đó hầu hết là các este và các cấu tử là hydrocacbon mạch dài, phân cực yếu. Các axit trong lá có thể tồn tại dạng tự do, dạng este hoặc dạng ete. Khi chiết với KOH tác giả mong muốn phân ly các liên kết này thu axit dƣới dạng muối, sau đó dùng axit HCl đẩy axit này ra dƣới dạng tự do. Rồi chuyển các axit này vào etyl axetat (là dung môi phân cực yếu có khả năng hòa tan tốt các axit béo). Tuy nhiên chỉ thu đƣợc các este của axit béo điều này có thể giải thích khi axit hóa các axit này sinh ra lại tác dụng ancol bị phân cắt bằng KOH (trong môi trƣờng HCl dƣ) lại tạo este.
  37. 37 Hình 3.14. Phổ đồ GC-MS dịch chiết chưng ninh KOH Bảng 3.4. Một số hợp chất được định danh bằng GC-MS trong mẫu 1
  38. 38 Hình 3.15. MS của este diisooctyl phtalat Hình 3.16. MS của este dioctyl hexandioat. 3.3.3.2. Kết quả phổ GC-MS dịch chiết soxhlet dung môi C2H5OH
  39. 39 Kết quả định danh thành phần axit trong lá cây sống đời bằng phƣơng pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS) thể hiện ở hình 3.17, bảng 3.5. Một vài axit, este thu đƣợc từ dịch chiết cồn có phổ MS ở các hình 3.18 và 3.19. * Nhận xét Qua kết quả phổ GC dịch chiết soxhlet trong C2H5OH xác định đƣợc một số cấu tử axit và este. Trong đó có một số este hàm lƣợng cao nhƣ: đimetyl malat 33,39%, etyl stearat 21,55%, etyl panmitat 19,74% và các axit: axit hexadecen-9- oic, hexandecanoic, stearic. Sự xuất hiện nhiều este etyl có thể do sự este hóa xảy ra khi dịch bị axit hóa trong điều kiện chƣa loại bỏ hết hoàn toàn dung môi C2H5OH. So sánh kết quả phổ GC dịch chiết bằng phƣơng pháp chƣng ninh và soxhlet bằng ancol etylic ta thấy dịch chiết bằng ancol etylic bên cạnh những este còn xuất hiện một vài axit. Theo tác giả sở dĩ dịch chiết dung môi cồn thu nhiều hợp chất hơn vì cồn là dung môi hữu cơ nên chiết hợp chất hữu cơ tốt hơn. Hình 3.17. Phổ đồ GC – MS dịch chiết soxhlet bằng C2H5OH
  40. 40 Bảng 3.5. Một số chất được định danh bằng GC-MS trong mẫu 2 Hình 3.18. MS của este etyl palmitat
  41. 41 Hình 3.19. MS của axit stearic Vậy sau khi chiết lá tƣơi bằng dung môi ancol etylic và dung dịch KOH ta kết luận 1. Chiết bằng ancol etylic thu nhiều hợp chất hữu cơ hơn bằng dung dịch KOH. 2. Nổi bật có những este hàm lƣợng cao nhƣ: este diisooctylphtalat 5.22%; este etylpalmitat: 19.74%, este dietylmalat: 33.39%, este etylstearat: 21.55%. 3. Bằng phƣơng pháp GC-MS xác định đƣợc 13 axit phân cực yếu trong lá sống đời tồn tại dạng axit tự do hoặc este nhƣ bảng 3.6 Bảng 3.6. Một số axit được xác định trong dịch chiết lá sống đời tươi. Mẫu Danh pháp Công thức cấu tạo % Este metyl-4,6,10,14- 0.97 1 tetrametyl pentadecanoat Este dioctyladipat 1.07
  42. 42 Este diisooctyl phtalat 5.22 Este Metyl-3,7,11,15- tetrametyl 2.7 hexadecantrien-4,6,10-oat Este Dietyl malat 33.39 Este Etyl myristat 1.04 Este Etyl pentadecanoat 0.51 2 Axit hexadecen-9-oic 1.11 Axit Hexadecanoic 3.47 Este etyl palmitat 19.74 Este etyl oleat 1.71
  43. 43 Axit stearic 2.29 Este etyl stearat 21.55 Este dioctyl adipat 0.95 Este Dioctyl phtalat 2.92 Este metyl-3,7,11,15- tetrametyl hexadecan- 1.19 6,10,14-trienoic 3.3.4. Thử hoạt tính sinh học dịch chiết nƣớc 3.3.4.1. Thử hoạt tính kháng khuẩn Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết trong nƣớc đƣợc biểu diễn ở bảng 3. Bảng 3.7. Ức chế vi khuẩn Gram dương Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của vi sinh vật và nấm kiểm định –IC50 (  g/ml) Gram (+) Gram (-) Nấm Pseudomonas Bacillus Lactobacillus Salmonnella Escherichia Pseudomonas Candida aeruginosa subtilis fermentum enterica coli aeruginosa albicans >0,57.10-4N >0,57.10-4N >0,57.10-4N >0,57.10-4N >0,57.10-4N >0,57.10-4N >0,57.10-4N  Kết luận: Mẫu thử thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật kiểm định trên ở nồng độ >0,57.10-4N 3.3.4.2. Thử hoạt tính chống oxy hoá Peroxydaza  Kết quả: Mẫu thể hiện hoạt tính chống oxi hoá Peroxydaza ở nồng độ >0,57.10-4.  Nhận xét: Dịch chiết axit trong lá cây sống đời thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật kiểm định và hoạt tính chống oxi hoá peroxydaza ở nồng độ
  44. 44 0,57.10-4. Nồng độ này khá thấp, ta có thể nhận thấy trong dịch chiết axit từ lá cây sống đời có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao.
  45. 45 KẾT LUẬN Trong quá trình nghiên cứu đề tài đã đạt một số kết quả nhƣ sau: 1. Độ ẩm trung bình trong lá sống đời tƣơi Kalanchoe Pinnata (Lamk.) Pers là: 92,3%, hàm lƣợng tro trung bình trong lá là: 1,06%. 2. Nguyên liệu cho nhiều axit nhất là lá tƣơi, dung môi chiết cho tổng lƣợng axit nhiều nhất là C2H5OH. 3. Xác định các axit phân cực yếu bằng phƣơng pháp phổ GC-MS cho thấy trong lá có 13 axit hữu cơ khác nhau tồn tại dạng axit tự do hoặc este. Đặc biệt trong đó có những axit tồn tại dạng este có nồng độ cao nhƣ: malic 33.39%, panmitic 19.74%, stearic 21.55%. 4. Thử hoạt tính kháng sinh vật kiểm định và hoạt tính chống oxy hoá peroxydaza cho kết quả mẫu dịch chiết thể hiện cả hai hoạt tính trên ở nồng độ >0,57.10-4N. KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục nghiên cứu xác định lƣợng axit đặc biệt là nhóm axit phenolic và tổng lƣợng hợp chất phenol trong lá sống đời vì có những ứng dụng quan trọng. 2. Nghiên cứu, xác định thành phần hóa học trong lá, thân, rễ cây sống đời đƣợc trồng ở các khu vực thổ nhƣỡng khác nhau để khảo sát mở rộng phát triển về sau.
  46. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1]. Hoàng Minh Châu, Từ Văn Mặc, Từ Vọng Nghi (2002), Cơ sở hoá học phân tích, Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội. [2]. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y hoc, Hà Nội. [3]. Nguyễn Đình Triệu (2001), Các phương pháp phân tích vật lý và hóa lý, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, Hà Nội. [4]. Bùi Xuân Vững (2009), Giáo trình môn Phương pháp phân tích công cụ, ĐHSP Đà Nẵng. Tiếng Anh [5]. Anjoo Kamboj, Ajay Kumar Saluja (2009), Bryophyllium pinnatum (Lam.) Kurz: Phytochemical and parmacological profile, Pharmacognosy Review, 364-374. [6]. Anna L (2004), “Antiproliferative and apoptotic effects of selective phenolic acids on T47D human breast cancer cells: potential mechanisms of action”, Breast Cancer Res, (2), 63-74. [7]. Babich H, Sedletcaia A, Kenigsberg B (2002), "In vitro cytotoxicity of protocatechuic acid to cultured human cells from oral tissue: involvement in oxidative stress" [8]. Chenniappan, K. and M. Kadarkarai (2010), “In vitro antimalarial activity of traditionally used Western Ghats plants from India and their interactions with chloroquine against chloroquine-resistant Plasmodium falciparum”, Parasitol Res, (10.1007), 9 - 10. [9]. Fatimatuzzahrra Bt Mohd Fadzel (2008), “Extraction and comparision of total Phenolic content from Malaysian grown Kalanchoe Pinnata”, Univesiti Teknologi MARA. [10]. Fred M (2005), “Ferulic acid stabilizes a solution of vitamins C and E and doubles its photoprotection of skin”, J Invest Dermatol, (4), 32 – 38.
  47. 47 [11]. Joseph, B., RM Priya PAM Helen and S. Sujatha (2010), “Bio-active compounds in essential oil and its effects of antimicrobial, cytotoxic activity from the Kalanchoe Pinnata (L.) Leaf”, Biotechnol, (9), 10-14. [12]. Joseph, S. Sridhar, Sankarganesh, Justinraj and Biby T. Edwin Sridhar (2010), “Rare Medicinal Plant-Kalanchoe Pinnata”, Indian J. Exp, Biol, (52), 230- 236. [13]. Joseph, S. Sridhar, Sankarganesh, Justinraj and Biby T. Edwin Sridhar (2010), “Rare Medicinal Plant-Kalanchoe Pinnata”, Indian J. Exp, Biol, (52), 230- 236. [14]. Lin HH, Chen JH, Huang CC, Wang CJ (2007), "Apoptotic effect of 3,4- dihydroxybenzoic acid on human gastric carcinoma cells involving JNK/p38 MAPK signaling activation", Int J Cancer, (11), 2306–2316. [15] Magareth B.C.Gallo, Miranda J. Sarachinc, Biological Activities of Lupeol, International of journal ò Biomedical and Pharmaceutical Sciences 3, 46-66. [16]. Muzitano, MF, LW Tinoco, C. Guette, CR Kaiser, B. Rossi-Bergmann and SS Costa (2006), “The antileishmanial activity assessment of unusual flavonoids from Kalanchoe pinnata”, Phytochemistry, (67), 2071-2077. [17]. Nakamura Y, Torikai K, Ohto Y, Murakami A, Tanaka T, Ohigashi H (2000), "A simple phenolic antioxidant protocatechuic acid enhances tumor promotion and oxidative stress in female ICR mouse skin: dose-and timing-dependent enhancement and involvement of bioactivation by tyrosinase", Carcinogenesis, (10), 1899–1907. [18]. Nayak, BS, JR Marshall and G. Isitor (2010), “Wound healing potential of ethanolic extract of Kalanchoe pinnata Lam”, Indian J. Exp, Biol, (48), 572- 576. [19]. Paulo S (2005), “Role of NADPH oxidase-mediated generation of reactive oxygen species in the mechanism of apoptosis induced by phenolic acids in HepG2 human hepatoma cells”, Arch Pharm Res,(10), 9-17. [20]. Simoes-Wust, AP, M. Graos, CB Duarte, R. Brenneisen and M. Hamburger (2010), “Juice of Bryophyllum pinnatum (Lam.) inhibits oxytocin-induced
  48. 48 increase of interacellular calcium concentration in human myometrial cells”, Phytomedicine, (17), 980-986. [21]. Supratman, U., T. Fujita, K. Akiyaa, H. Hayashi, A. Murkami, H. Sakai, K. Koshimizy and H. Ohigashi (2001), “Anti-tumor promoting activity of bufadienolides from Kalanchoe pinnata and K daigremontiana X tubiflora”, Biosci Biotechnol Biochem, (65), 947-949. [22]. Supratman, U., T. Fujita, K. Akiyama and H. Hayashi (2000), “New insecticidal bufadienolide, bryophyllin C, from Kalanchoe pinnata”, Biosci Biotechnol Biochem, (64), 1310-1312. [23]. Willcox, ML and G. Bodeker (2004), “Traditional herbal medicines for malaria”, BMJ, (329), 1156-1159. [24]. Yadav, NP and VK Dixit (2003), “Hepatoprotective activity of leaves of Kalanchoe pinnata Pers”, J. Ethnopharmacol, (86), 197-202. [25]. (11/01/2011). [26]. (11/02/2011). [27]. (15/05/2011). [28]. 1&NewsID=1042&PageNum=22
  49. 49 MỤC LỤC Trang nhiệm vụ khoá luận tốt nghiệp i Lời cảm ơn ii Danh mục các bảng iii Danh mục các hình vẽ, đồ thị iv MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 5 1.1. GIỚI THIỆU CÂY SỐNG ĐỜI 5 1.2. PHÂN BỐ 5 1.3. ĐẶC ĐIỂM CÂY SỐNG ĐỜI 5 1.4. CÔNG DỤNG CÂY SỐNG ĐỜI 6 1.5. CÁC TÁC DỤNG DƢỢC LÝ CỦA CÂY SỐNG ĐỜI 7 1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HÓA HỌC THỰC VẬT CỦA CHI KALANCHOE 9 1.6.1. Nhóm axit phenolic 10 1.6.1.1. Axit caffeic 11 1.6.1.2. Axit ferulic 11 1.6.1.3. Axit protocatechuic 12 1.6.2. Axit béo 12 1.6.3. Axit hữu cơ phân cực 13 1.6.3.1. Axit malic 14 1.6.3.2. Axit citric 14 Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 17 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.2.1. Phân tích trọng lƣợng 17 2.2.1.1. Xác định độ ẩm của nguyên liệu 17 2.2.1.2. Xác định hàm lƣợng tro của nguyên liệu 18 2.2.1.3. Xác định khối lƣợng các axit béo 18 2.2.2. Phƣơng pháp chiết tách 18
  50. 50 2.2.2.1. Chiết đơn giản một lần 18 2.2.2.2. Chiết đơn giản, nhiều lần 18 2.2.3. Phƣơng pháp chuẩn độ axit – bazơ 19 2.2.4. Phƣơng pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS) 19 Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 22 3.1.1. Xử lý nguyên liệu, xác định tổng axit trong lá sống đời tƣơi, khô bằng phƣơng pháp chuẩn độ và cân 22 3.1.2. Định danh và thành phần axit trong dịch chiết lá sống đời bằng phổ GC-MS 24 3.1.3. Thử hoạt tính sinh học dịch chiết H2O 24 3.2. TIẾN HÀNH THỰC NGHIỆM 25 3.2.1. Thu nguyên liệu 25 3.2.2. Xử lí nguyên liệu 25 3.2.3. Xác định một số đại lƣợng vật lí 25 3.2.3.1. Xác định độ ẩm 25 3.2.3.2. Xác định hàm lƣợng tro trong lá sống đời 26 3.2.4. Xác định tổng lƣợng axit hữu cơ 26 3.2.4.1. Chiết Soxhlet trong dung môi C2H5OH 27 3.2.4.2. Chƣng ninh trong H2O 28 3.2.4.3. Ngâm kiệt trong ete dầu hỏa 29 3.2.4.4. Chiết Soxhlet trong dung môi CHCl3 30 3.2.5. Định danh xác định thành phần axit dựa vào phổ GC-MS 30 3.2.5.1. Chƣng ninh trong KOH 31 3.2.5.2. Chiết bằng C2H5OH 31 3.2.6. Thử hoạt tính sinh học dịch chiết H2O 31 3.2.6.1. Thử hoạt tính kháng sinh vật kiểm định 32 3.2.6.2. Thử khả năng chống oxi hóa 33 3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.3.1. Khảo sát các đại lƣợng vật lý 34 3.3.1.1. Độ ẩm 34
  51. 51 3.3.1.1. Hàm lƣợng tro 34 3.3.2. Kết quả xác định tổng lƣợng axit trong lá sống đời tƣơi và khô bằng phƣơng pháp chuẩn độ và cân 35 3.3.3. Kết quả xác định axit trong dịch chiết lá tƣơi bằng sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS 36 3.3.3.1. Kết quả phổ GC-MS dịch chiết chƣng ninh KOH 36 3.3.3.2. Kết quả phổ GC-MS dịch chiết soxhlet dung môi C2H5OH 38 3.3.4. Thử hoạt tính sinh học dịch chiết nƣớc 43 3.3.4.1. Thử hoạt tính kháng khuẩn 43 3.3.4.2. Thử hoạt tính chống oxy hoá Peroxydaza 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46
  52. 52 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐH SƢ PHẠM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc KHOA HOÁ NHIỆM VỤ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Trƣơng Văn Cƣơng Lớp : 08SHH 1. Tên đề tài Nghiên cứu xác định axit hữu cơ trong lá cây sống đời (Kalanchoe pinnata) ở xã Hoà Liên, huyện Hoà Vang, thành phố Đà Nẵng 2. Nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị Nguyên liệu: lá cây sống đời tƣơi và khô Dụng cụ, thiết bị: cốc thuỷ tinh 250ml, bình tam giác 250ml, bình cầu 500ml, ống sinh hàn hồi lƣu, phễu chiết, bộ chiết soxhlet, bếp đun bình cầu, lò sấy, lo nung, cân phân tích. 3. Nội dung nghiên cứu + Xác định một số chỉ số nhƣ độ ẩm, hàm lƣợng tro của lá tƣơi. + So sánh, xác định tổng lƣợng axit chiết đƣợc bằng các dung môi khác nhau từ các phƣơng pháp chiết khác nhau. + Định danh một số axit bằng phổ GC-MS. + Thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxi hóa của dịch chiết lá tƣơi. 4. Giáo viên hƣớng dẫn: GS.TS Đào Hùng Cƣờng 5. Ngày giao đề tài: 25/11/2010 6. Ngày hoàn thành: 15/09/2011 Chủ nhiệm khoa Giáo viên hƣớng dẫn (Kí và ghi rõ họ tên) (Kí và ghi rõ họ tên)
  53. 53 Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho Khoa ngày tháng năm 2012 Kết quả điểm đánh giá Ngày tháng năm 2012 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Kí và ghi rõ họ tên)
  54. 54 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn thầy giáo GS.TS Đào Hùng Cƣờng đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và động viên em trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo giảng dạy bộ môn và các thầy cô công tác tại phòng thí nghiệm đã dạy dỗ, giúp đỡ cho em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trƣờng. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Phạm Thị Thanh An - Học viên cao học khoá 2008 - 2011 đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong thời gian làm đề tài Đà Nẵng, ngày 12 tháng 05 năm 2012 Trƣơng Văn Cƣơng
  55. 55 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm trong lá sống đời 33 Bảng 3.2 Kết quả xác định tỉ lệ tro trong lá sống đời sấy khô 33 Bảng 3.3 Tổng lƣợng axit trong lá sống đời tƣơi và khô 34 Bảng 3.4 Một số chất đƣợc định danh bằng GC-MS trong mẫu 1 36 Bảng 3.5 Một số chất đƣợc định danh bằng GC-MS trong mẫu 2 39 Bảng 3.6 Một số axit đƣợc xác định trong dịch chiết lá sống đời tƣơi 40 Bảng 3.7 Ức chế vi khuẩn Gram dƣơng 42
  56. 56 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Cây sống đời 4 Hình 1.2 Axit caffeic 10 Hình 1.3 Axit ferulic 10 Hình 1.4 Axit protocatechuic 11 Hình 1.5 Axit malic 13 Hình 1.6 Axit citric 13 Hình 2.1 Cây sống đời 16 Hình 2.2 Soxhlet 17 Hình 2.3 Cấu trúc khối một máy sắc kí khí 19 Hình 3.1 Lá sống đời tƣơi, cắt nhỏ 24 Hình 3.2 Bột lá sống đời sấy khô, xay nhỏ 24 Hình 3.3 Bã rắn, dịch trƣớc tẩy màu 26 Hình 3.4 Dịch chiết sau khi tẩy màu 26 Hình 3.5 Dịch sau chƣng ninh 27 Hình 3.6 Dịch axit chuẩn độ bằng NaOH 27 Hình 3.7 Chiết dịch ngâm với KOH 28 Hình 3.8 Axit hóa bằng HCl đặc 28 Hình 3.9 Dịch CHCl3 đƣợc chiết KOH 29 Hình 3.10 Kết tủa axit béo 29 Hình 3.11 Mẫu 1 30 Hình 3.12 Mẫu 2 30 Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tổng lƣợng axit vào dung môi 35 Hình 3.14 Phổ đồ GC-MS dịch chiết chƣng ninh KOH 36 Hình 3.15 MS của este diisooctyl phtalat 37 Hình 3.16 MS của este dioctyl hexandioat 37 Hình 3.17 Phổ đồ GC – MS dịch chiết soxhlet bằng C2H5OH 38 Hình 3.18 MS của este etyl palmitat 39 Hình 3.19 MS của axit stearic 40